色層分析法之原理與應(yīng)用.ppt

色層分析法之 原理與應(yīng)用,黃平志,色層分析法之定義與原理,色層分析( chromatography)簡稱層析。 係一種分離技術(shù)。 操作過程：利用含混合物之移動相(mobile phase)流經(jīng)固定相(stationary phase) 。 分離機(jī)制： 混合物中各成分在固定相和移動相之間的分配係數(shù)不同(即親和力不同) 。 各成分移動速率不同，而達(dá)到分離之目的。 化合物與靜相親和力較強(qiáng)，則沖提較慢(即滯留時(shí)間長) 化合物與移動相的親和力較強(qiáng)，則沖提較快(即滯留時(shí)間短)。,色層分析法之發(fā)展,20世紀(jì)初，Tswett發(fā)現(xiàn)當(dāng)溶有植物萃取液之石油醚倒於內(nèi)含碳酸鈣顆粒之玻璃管柱，再加入石油醚使其自然流下時(shí)，植物色素被分離而於管柱內(nèi)呈現(xiàn)不同顏色之色帶。 氣相層析儀。 HPLC。 離子層析、超臨界流體層析,層析分離示意圖,層析之原理,t : Retention time 滯留時(shí)間,層析之分類,依兩相之物理性質(zhì)分類： 氣相層析法(GC)：以氣體為移動相 氣固層析法(GSC) 氣液層析法(GLC) 液相層析法(LC)：以液體為移動相 液固層析法(LSC) 液液層析法(LLC) 超臨界流體層析法(SFC),層析之分類,依固定相之使用型式分類： 管柱層析法(Column Chromatography) 平面層析法(Planar Chromatography) 於平面介質(zhì)上進(jìn)行分離 濾紙層析法(Paper Chromatography) 薄層層析法(Thin Layer Chromatography),層析之分類,依分離原理分類 吸附式層析法 分配式層析法 離子交換式層析法 大小排除層析法 Affinity 層析法,層析圖及相關(guān)名詞介紹,基線：於正常操條件下，僅有流動相通過檢出器時(shí)之訊號曲線。 層析峰：由管柱流出之成分於通過檢出器時(shí)之產(chǎn)生之訊號對時(shí)間曲線。 峰高：由峰最大值至峰底之距離。 層帶寬度：峰寬 半高峰寬 峰面積：峰與峰底間之面積,W,h,Wh/2,層析圖及相關(guān)名詞介紹,無感時(shí)間( dead time, tM )：不被固定相所滯留之成分由進(jìn)入系統(tǒng)至檢出器呈現(xiàn)其最大訊號之時(shí)間，代表流動相經(jīng)系統(tǒng)到檢出器所需之時(shí)間。 滯留時(shí)間( retention time, tR )： ：成分由進(jìn)入系統(tǒng)至檢出器呈現(xiàn)其最大訊號之時(shí)間。 調(diào)整滯留時(shí)間(tR )： 減去無感時(shí)間之滯留時(shí)間。,W,h,Wh/2,層析圖及相關(guān)名詞介紹,無感體積(VM)： 不被固定相所滯留之物質(zhì)由進(jìn)入系統(tǒng)至檢出器呈現(xiàn)其最大訊號時(shí)需之流動相體積。 滯留體積 調(diào)整滯留體積 相對滯留值(relative retention value)或分離因子(selectivity factor)：在相同操作條件下，成分與參考成分調(diào)整滯留時(shí)間之比。,W,h,Wh/2,影響分離效果之因子,分配係數(shù)(partition coefficient) 容量因子(capacity factor) 選擇因子(separation factor) 柱效率及理論板數(shù) 解析度(resolution),分配係數(shù)(partition coefficient)及容量因子(capacity factor),分配係數(shù)：平衡時(shí)，成分在固定相及移動相中的濃度比(溶質(zhì)在不互溶或僅稍互溶之二溶劑間的分配關(guān)係) K = CL/CM 容量因子：平衡時(shí)，成分在固定相及移動相中的質(zhì)量比 k = CL VL/CM VM = KVL/VM = (tR- tM)/tM = tR/tM 選擇因子或分離因子,柱效率及理論板數(shù),平板理論 N:理論平板數(shù) number of theoretical plates N=16(tR/W)2 H: height equivalent of a theoretical plates 理論平板等效高度(平板厚度) H=LW2/16tR2 L: column length 管柱長度 L=NH N=L/H,解析度 Resolution,Rs=Z/(WA/2+WB/2),如何增加解析度,增加理論板數(shù)(N)：即增加管柱長度或減小理論板高 增加選擇因子(分離因子), 1.0 1.001 1.01 1.1 1.5 2.0 (-1)/ 0 0.001 0.01 0.091 0.38 0.50,改變固定相，柱溫(GC)，流動相(HPLC) 改變?nèi)萘恳蜃樱?k 0.5 1.0 3.0 5.0 8.0 10.0 30 50 k/(1+ k) 0.33 0.50 0.75 0.83 0.89 0.91 0.97 0.98,影響層析峰寬之因素,渦流擴(kuò)散(eddy diffusion) 縱向擴(kuò)散(longitudinal diffusion) 非平衡質(zhì)量傳送(nonequilibrium mass transfer) 控制因子：流動速率、填充物粒徑、擴(kuò)散速率、固定相厚度,van Deemter equation,導(dǎo)出流動相流動速率與之關(guān)係式 H = A + B/u + Cu A：渦流擴(kuò)散項(xiàng)(多徑項(xiàng))，由粒徑、幾何形狀及固定相填充緊密度有關(guān)A=2dp B：縱向擴(kuò)散項(xiàng)(分子擴(kuò)散) C：質(zhì)傳阻力項(xiàng),Partition Packing,Packed Columns,Liquid Phase,Solid Support,Very porous with very high surface area,van Deemter equation,van Deemter equation,層析法之定性分析,依據(jù)滯留時(shí)間定性 與己知物對照 雙管柱對照 利用化學(xué)性質(zhì)定性 利用選擇性檢出器（雙檢出器系統(tǒng)）定性 與其他儀器結(jié)合定性：GC-MS, FT-IR,層析法之定量分析,一定分析條件下，待測成分於檢出器產(chǎn)生之訊號與其量成正比：a.峰高 b.峰面積 c.積分儀之應(yīng)用 校正因子：各成分於檢出器產(chǎn)生之訊號不同，即靈敏度不同 絕對校正因子：fi = mi/Ai mi = fi x Ai 相對校正因子：fi = mi/Ai, fs = ms/As fi = (mi/Ai/) (ms/As) = miAs/msAi 定量方法： 歸一法(normalization method)：適用於各成分均能流出並被檢測之狀況 操作條件應(yīng)維持不變 應(yīng)適用於線性範(fàn)圍內(nèi) 樣品注入量較不需嚴(yán)格控管 外標(biāo)準(zhǔn)法： 內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)法： 標(biāo)準(zhǔn)添加法,氣相層析法,以氣體作為移動相之層析法，移動相與分析物質(zhì)不起作用 氣相層析法之特點(diǎn) 高選擇性。 高效能。 高靈敏度 分析速度快。,氣相層析儀,管柱,樣品注人器,偵檢器,資料擷取及儀器控制用電腦,典型之氣相層析儀構(gòu)造,載流氣體,氫氣,空氣,兩段式調(diào)壓閥,氣相層析儀,氣體供應(yīng)系統(tǒng) 樣品注入系統(tǒng) 管柱 管柱恆溫控制器(烘箱) 偵檢器 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),氣體及管線,載流及偵檢器支持氣體之品質(zhì)需求Carrier and Detector Support Gases,氣相層析儀,流量控制 流量控制閥中裝有限流器 鋼瓶壓力亦需適當(dāng)調(diào)整 載流氣體必須是高純度，且需在氣體鋼瓶和氣相層析儀間加裝純化裝置，以去除氣體中的微量水氣和氧氣 樣品注入系統(tǒng) 手動注射 自動注射 吹氣捕捉,分流/不分流注入口 Split/Splitless Inlet,SEAL,(INLET),(SEPTUM),SPLIT VENT,TOTAL FLOW,COLUMN,SEPTUM,= CARRIER GAS,LINER,50 mL/min,2 mL/min,0.6 mL/min,48 mL/min,47.4 mL/min,PURGE VENT,PURGE VALVE,Split Flow Diagram: Pre-Injection,吹氣捕捉裝置,層析管柱之種類Column Types,LENGTH (meters),I.D. (mm),.5-10,2-4,5-100,.530,5-100,.1-.25,PACKED,SERIES 530,NARROW BORE,填充管柱 Packed,毛細(xì)管柱 Open (Capillary),Wall Coated,Open Tube,管柱-填充管柱,玻璃管柱 長 1.5至 3 m 內(nèi)徑 2至 4 mm 內(nèi)部填充表面被覆一層液相的小固體顆粒( 60至100篩目的矽藻土或碳化物),管柱-毛細(xì)管柱,開口式玻璃毛細(xì)管柱 長 15至 100 m 內(nèi)徑 0.2至 0.75 mm 管柱裡面塗敷一層液相，現(xiàn)在大部分的毛細(xì)管柱是使用熔矽材質(zhì)，而玻璃管柱也仍被用來分析揮發(fā)性有機(jī)物 毛細(xì)管柱的分離效果比填充管柱好,10% of Applications,Gas Solid Chromatography (GSC),Partition Packing,Packed Columns,Liquid Phase,Solid Support,Very porous with very high surface area,Gas Liquid Chromatography (GLC),Gas Liquid Chromatography (GLC),Parameter effect on R down sides Column length the longer the better longer elution time Film thickness the thinner the better smaller sample loads poor retention for extremely volatile compounds Inner diameter the smaller the better smaller sample loads,Summary of column parameters on Resolution,不同型式管柱性能之比較 Comparison of Column Types,Packed Column Analysis:,Capillary,Conventional,5% OV101,on 80/100 Chromosorb,30m X 0.53mm X .88m,30m X 0.32mm X .25m,HP Column Evaluation Sample,理想偵檢器特性,適當(dāng)靈敏度(Sensitivity) 穩(wěn)定性(Stability)及再現(xiàn)性(Reproducibility)佳 適當(dāng)線性範(fàn)圍(Linear dynamic range) 適當(dāng)溫度範(fàn)圍 反應(yīng)時(shí)間(Response time)短且不受載流氣體流速影響 內(nèi)容積小以避免溶質(zhì)帶變寬 對所有溶質(zhì)都有類似訊號或?qū)σ换蚨喾N類型溶質(zhì)具選擇性感應(yīng) 對溶質(zhì)沒有破壞性 高可信度且使用方便,熱傳導(dǎo)度偵檢器 Thermal Conductivity Detector (TCD) 火燄離子化偵檢器 Flame Ionization Detector (FID) 電子捕捉偵檢器 Electron Capture Detector (ECD) 氮磷偵檢器 Nitrogen Phosphorus Detector (NPD) 火燄光度偵檢器 Flame Photometric Detector (FPD),氣相層析儀偵檢器,電解導(dǎo)電感應(yīng)偵檢器 El