植物離體細胞發(fā)育的細胞學基礎.ppt

第三章 植物離體細胞發(fā)育的細胞學基礎,3-1 植物細胞的離體發(fā)育,一.花粉小孢子離體發(fā)育途徑,花粉孢子體的發(fā)育途徑可主要歸納為為a,b,c三條 (sunderland ，1974)： （一）a 途徑(a route)： 特點：小孢子第一次有絲分裂仍按配子體方式 進行：即非均等有絲分裂，形成一個營養(yǎng)核（v） 和一個生殖核（g） ，并經不同分裂形成多細胞花 粉粒和多細胞團。,a-v 途徑：營養(yǎng)細胞發(fā)育成單倍性胚狀體，生殖細胞退化消失。在煙草、顛茄、大麥、黑麥、小麥、水稻、玉米等中存在。 a-g 途徑：生殖細胞發(fā)育成單倍性胚狀體，營養(yǎng)細胞退化消失。在天仙子中發(fā)現(xiàn)此途徑。,（二）c 途徑(c route)：,生殖細胞和營養(yǎng)細胞先融合后分裂，共同形成多 細胞花粉，產生非單倍體植株。在此途徑中，常會 發(fā)生生殖核的核內復制（endoreduplication of generator）。在毛葉蔓陀羅和小麥中發(fā)現(xiàn)此途 徑。,（三）b 途徑（b route ）,特點：花粉單核小孢子第一次核內有絲分裂為 均等分裂。即小孢子分裂成兩個大致相等、類似分生 細胞的營養(yǎng)型細胞，并連續(xù)不同分裂，形成不同倍性 的多細胞花粉。 其典型作物是毛葉曼陀羅，在小麥、小黑麥、水 稻、橡膠、楊樹、玉米等植物中已見到這種發(fā)育途 徑。大概有三種方式：, b-1 形成的兩個營養(yǎng)型細胞在以后的幾次分裂中是同步的，則大多數(shù)以胚狀體的形式形成花粉胚。 b-2 形成的兩個營養(yǎng)型細胞在以后的幾次分裂中是不同步的，其中一個停止分裂，或快或慢分裂，并存在于花粉的一側。另一個經過相當長時間的持續(xù)分裂，則形成愈傷組織。 b-3 形成的兩個營養(yǎng)型細胞在不同時期發(fā)生核融合或核內復制，結果產生不同倍性的花粉胚。,（四）e 途徑（e route）,特點：花粉內的營養(yǎng)核和生殖核獨立分裂，形成 兩類細胞群，各群的子細胞都類似于其母細胞。,近年來在蔓陀羅、水稻、玉米中發(fā)現(xiàn)了此途徑。,研究花粉發(fā)育途徑的意義:,研究花粉孢子體啟動第一次分裂的條件，揭示小 孢子發(fā)育過程中各種誘導因子對離體花藥(花粉)培養(yǎng) 的必要性。 如2,4-d對對愈傷組織的形成是必需的，而胚狀體 的形成不是必需的； 有利于研究花粉氈絨層細胞等其他花藥組織細胞 的作用，研制大幅度提高花粉胚誘導頻率的新技術：,如nitsch曾經計算過煙草一個花藥具有產生1440 棵植株的潛力，而實際上只能形成30多個植物體； 了解不同倍性花粉植株的來源，為雜交育種提 供原始材料：只有純合二倍體植株，才是育種的最 理想的和需要的； 研究細胞分化和胚胎發(fā)生規(guī)律。花粉發(fā)育是從 單細胞開始的，追蹤研究從單細胞到完整植物體的 全過程，有利于研究胚胎發(fā)育中的調控機理。,二. 胚珠和雌核的發(fā)育途徑,大孢子母細胞 (胚囊母細胞),單倍性的四分體,減數(shù)分裂,只有遠離珠孔端的一個細胞發(fā)育,胚囊細胞,8細胞胚囊,3次有絲分裂,1. 雌核發(fā)育,由單核至成熟胚囊時期均能誘導雌配子體的細胞 發(fā)育成愈傷組織。但直到形成成熟胚囊時，才啟動 向愈傷組織發(fā)育。 2.子房和胚珠培養(yǎng)中的胚胎發(fā)生 在子房和胚珠培養(yǎng)中，除胚囊細胞發(fā)形成再生植 株外，胚囊以外的珠柄、珠被和子房壁細胞均有可 能發(fā)育形成不定胚而產生二倍體再生株。,由未授粉的胚囊形成愈傷組織大致有兩種可能： 孤雌生殖：由未授精的卵細胞 單倍體無融合生殖 形成單倍體胚 （減數(shù)的胚囊） 無胚子生殖：由助細胞、反足 細胞發(fā)育成單倍體胚 二倍體無融合生殖：由胚囊中未經減數(shù)分裂的孢 原細胞形成二倍體胚。,水稻未授粉子房培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，再生的單倍體小植株來自于助細胞無胚子生殖(周嫦等，1981；黃群飛等，1982)。 大米胚囊中的卵細胞、反足細胞、助細胞都可能產生胚，并認為,卵細胞和反足細胞起源的原胚再生植株較好，助細胞僅產生愈傷組織。,3-2 體細胞離體再生的基本類型及特點,一. 不定芽型(adventitous bud type) 芽外植體 不定芽 再生植株。 特點: 利用外植體原有的芽，不僅繁殖率高,而且能保持該植物和的遺傳穩(wěn)定性。,芽-芽型,大蒜莖尖培養(yǎng),二.直胚型（embryo）,特點：遺傳性一致，但繁殖率低。,種子或胚 芽（帶芽原球莖) 植株。,桃幼胚培養(yǎng),直胚型（embryo）,桃兒七幼胚培養(yǎng),三.器官型(organ type),器官外植體 不定芽 再生植株。 如石龍芮、煙草、水仙、百合、風信子、貝母的 鱗片培養(yǎng)誘導不定芽等； 特點：遺傳性較穩(wěn)定，繁殖速度較快。,非芽-芽型,石龍芮下胚軸胚狀體的發(fā)生 a、培養(yǎng)一個月的幼苗，下胚軸上產生許多胚狀體；b、下胚軸部分放大；c、兩個表皮細胞；dg 原胚發(fā)生過程；j、心形胚狀體；h、i 已分化子葉、胚根及原維管束的胚狀體。,器官外植體 愈傷組織 分化再生植株。 特點：繁殖速度快，但遺傳性不穩(wěn)定。,四.器官發(fā)生型（organogenesis),葉片、花藥 莖尖、根,五.類胚體發(fā)生型(embryogenesis),植物器官、組織和細胞 胚狀體 再 生成苗。 特點：遺傳性一致，有些植物繁殖率較高。如 胡蘿卜1 l培養(yǎng)基有10萬個以上的胚狀體。,未授粉 胚珠,植株,3-3 離體細胞胚胎發(fā)育的細胞學基礎,一. 體細胞胚發(fā)生的細胞胚胎學過程,(一）單子葉植物的胚胎發(fā)生,1.合子胚發(fā)生的基本特點 植物有性繁殖中,卵細胞受精后稱為合子(zygote),它經預 定的發(fā)育方式產生胚(embryo),故胚的發(fā)育是從合子開始。在 胚發(fā)育早期,從二細胞胚至器官分化之前的胚胎發(fā)育階段稱為 原胚(proembryo)時期。合子的第一次分裂為不均等分裂。,2.體細胞胚發(fā)生的基本特點,1）發(fā)生過程與合子相似: 在離體條件下誘導體細胞胚胎發(fā)生與相應的合子 胚發(fā)生過程大同小異：,2、體細胞胚的第一次分裂雖多為不均等分裂，但也有近似的均等分裂。,3、 胚性細胞發(fā)生具有不同步性,胚性細胞的繼續(xù)分裂形成多細胞原胚。由于胚性 細胞分裂是不同步的,因此在同一張切片上既可看到 單個的胚性細胞,又可見到二細胞,三細胞和四細胞， 以致多細胞原胚并存的多樣化原胚細胞群體。, 不同步產生的原因：,從脫分化形成愈傷組織后,再轉移誘導分化胚性細胞時,細胞狀態(tài)和啟動分裂的不一致,而存在多樣化的原胚細胞群。 在某些條件下,體細胞胚發(fā)生是有先后或反復進行的,新的胚胎發(fā)生中心有可能從原胚細胞群中或從胚體中產生。,克服不同步的可能方法,提高接種物的均勻性： 在培養(yǎng)基中加入dna合成抑制劑 轉移培養(yǎng) 時過篩分離； 通過在含2%蔗糖的16%ficoll溶液中離 心過濾 將分離物轉至無激素培養(yǎng)基上即可同步； 抑制額外或次生胚的產生： 使用aba。有實驗證明，aba在控制“重復胚胎發(fā) 生”或“畸形胚”的形成是有效的。,（二）雙子葉植物的胚胎發(fā)生,1.合子胚的發(fā)生特點 雙子葉植物與單子葉植物之間有相似的發(fā)育形態(tài)： 成熟胚都包含一個具子葉的胚軸(embryonal axis)， 分為上胚軸(epicotyl),和下胚軸(hypocotyl)。最 下端產生胚根(radicle)。被子植物中單子葉植物一 片子葉, 雙子葉植物兩片子葉。,雙子葉植物胚胎發(fā)生的細胞學特征（擬南芥） 不同線條表示胚胎與幼苗之間結構上的對應關系,2.體細胞胚發(fā)生的基本特點,與合子胚相似，仍存在不同步問題等。 胚性細胞多由愈傷組織表層或近表層的薄壁細胞 分化而來：其核大，位于細胞中央，質濃，第一次 有絲分裂既可不均等分裂，也可為均等分裂：,二. 體細胞胚發(fā)生的超微結構與生物化學,（一）胚性細胞的超微結構 1、核增大，細胞器數(shù)量增多： 特別是線粒體 (mitochondrion) 數(shù)量明顯增加。,愈傷組織圓形薄壁細胞的核增大,核仁著色深,一般具 有兩個以上的核仁，大液泡消失，細胞質電子密度明顯加強，質體plastid),核糖體(ribosome)，特別是線 粒體 (mitochondrion) 數(shù) 量明顯增加,同時核糖體不僅數(shù)量增加,而且聚集成多聚核糖體(polyri-bosome or polysome)。,2. 廣泛存在著胞間連絲(plasmodesmata)：,早期胚性細胞與周圍細胞間還存在廣泛的胞間連絲通過胞間連絲傳遞物質和信號，為胚性細胞的進一步分化與發(fā)育奠定了基礎。,3. 細胞膜上有分泌泡的形成：,其內含一些被消化的細胞器和殘渣。,4.細胞拉長，核偏移,細胞壁加厚，細胞器持續(xù)增加：,隨著胚性細胞的發(fā)育,細胞拉長，核偏移,細胞壁加厚，線粒體（m）數(shù)目進一步增加,常連片分布于細胞質中,既有大量游離核糖體,又有多聚核糖體存在,并出現(xiàn)高爾基體(golgibody)和微管(microtu- bule)等。,小麥體細胞胚微結構的變化,小結,體細胞胚胎發(fā)生的脫分化與再分化。 體細胞胚胎發(fā)生過程與合子胚類似，第一次分裂多為不均等分裂，也有近似的均等分裂。但胚性細胞發(fā)生具有明顯的不同步性。 胚性細胞核增大，偏移,細胞器數(shù)量增多，特別是線粒體 數(shù)量明顯增加。細胞壁加厚，且存在著胞間連絲。,（二）體細胞胚發(fā)生的生物化學,1、atpase增高并逐漸 由質膜轉入細胞內,推測：胚性細胞是通過外 源激素的誘導而啟動的。因 為外源激素作用的部位是質 膜，首先誘導膜蛋白的合 成，于是導致膜atp酶活性 提高。,后期：atp酶活性從細 胞質膜逐漸轉入細胞內， 并在細胞壁的加厚處也出 現(xiàn)atp酶活性反應的沉積 物。,推測：處于“生理隔離”晚期的胚性細胞或胚性細胞團一直處于一個厚壁包圍之中，與其周圍細胞之間的胞間連絲也消失。atp酶的廣泛存在和保持較高活性為胚性細胞或原胚的一系列代謝提供了能量保證。,2. 蛋白質含量升高,胚性愈傷組織蛋白質含量遠高于非胚性愈傷組織； 體細胞胚的可溶性蛋白質含量高于胚性愈傷組織； 體細胞胚發(fā)育過程中，蛋白質含量高低依次為：（ g ） 以成熟胚為單位,可溶性蛋白質含量隨胚體的增加而升高。,3.淀粉含量有所增加,淀 粉 粒 初期 發(fā)育中的 二細胞 多細胞 球形胚 成熟胚 胚性細胞 胚性細胞 原胚 原胚,小麥體細胞胚發(fā)生過程中淀粉粒消長動態(tài)與小麥合子胚基本一致； 單子葉與雙子葉植物體細胞胚發(fā)生過程中淀粉粒消長動態(tài)趨勢相似；,4.dna含量增加明顯,應用3h-胸苷(3h- dt)標記,放射自顯影方法研究表明:愈傷組織轉入“胚發(fā)生培養(yǎng)”4h后，標記的細胞數(shù)和標記量逐漸增加，到“球形胚”時dna合成速率達到最高峰.,隨著體細胞胚的發(fā)育,dna合成明顯增加:,8 8 2 2,5.內源激素含量升高,(1) 胚性愈傷組織(ec)的內源激素含量遠高于非胚性愈傷組織 (nec)； (2)胚性細胞中內源ga水平較低，非胚性細胞中較高。ga可能對體細胞胚發(fā)生有負作用；,(3) aba/iaa和aba/ga的比值一直是ec高于nec，顯然豐富的內源激素含量，可能是體細胞脫分化并形成胚性細胞和保持胚胎發(fā)生能力不可缺少的因素； (4) 補加適量的外源aba（4moll-1），可明顯提高體細胞胚發(fā)生的頻率與質量（促進發(fā)生和抑制畸形胚）。 (5) aba合成抑制劑不僅降低內源aba 含量,而且抑制體細胞胚胎發(fā)生。,3-4 體細胞胚的起源與遺傳穩(wěn)定性,一. 體細胞胚的起源 1. 絕大多數(shù)體細胞胚是起源于單細胞，證據： 從多種植物中都觀察到單個的胚性細胞、均等分裂的和不均等分裂的二細胞原胚； 在一塊愈傷組織中或一張切片上可觀察到多個不同發(fā)育時期的體細胞胚。,在紅豆草單細胞懸浮培養(yǎng)中也觀察到單個胚性細胞具有明顯極性，第一次分裂多為不等分裂，頂細胞繼續(xù)分裂形成多細胞原胚，基細胞進行少數(shù)幾次分裂形成胚柄。 在石防風懸浮培養(yǎng)的體細胞中也觀察到無絲分裂，其中多為縊縮分裂，形成兩個細胞核；,3h-胸苷(3h-dt)標記實驗表明,開始是愈傷組織外層少數(shù)細胞被標記。接著另一些薄壁細胞被標記，這部分的細胞從形態(tài)上相繼轉變?yōu)榕咝约毎?2.關于來源于多細胞的問題,用同位素脈沖標記實驗可以證明，一些形成的胚性 細胞團也是由一個單細胞連續(xù)分裂而形成的。當然也 不排除有些植物的體細胞胚的確是起源于多細胞的， 有待深入研究。,3. 體細胞轉化為胚性細胞的漸變理論,即一個細胞系的發(fā)生與形成是一個特定基因組中 基因活化的結果： 一是預定階段，即細胞在脫分化時基因所處的 特殊狀態(tài)（預定性）； 二是表達階段，在適合的 誘導條件下,預定的細胞發(fā)生一系列的生理生化和形 態(tài)上的變化,表現(xiàn)出分化的特性。這一特性是不穩(wěn)定 的。,通過調節(jié)培養(yǎng)基成分、激素組成與配比繼續(xù)進行誘導,二.極性與生理隔離,1.體細胞胚胎發(fā)生的“雙極性(double polarity)”： 垂周分裂和平周分裂 極性分化的誘導因素：植物激素和外界刺激引起 不均等分裂和基因表達產物的不均勻分布： 合子在休眠期中，細胞質和細胞核都集中在一端, 形態(tài)發(fā)生顯著的變化。,小麥的胚性細胞的細胞核和質向一端偏移, 細胞器、核糖體和質體等都有區(qū)域性集中分布現(xiàn)象,并和細胞核偏移的方向一致。 紅豆草體細胞胚、胡蘿卜體細胞胚發(fā)生中，dna和rna的合成同樣具有極性化集中區(qū)域。,2.生理隔離(physiological isolation)：,即胚性細胞與周圍細胞或組織形成明顯界限的現(xiàn)象。 “細胞生理隔離”與“組織生理隔離”？ 合子胚： 被子植物的胚囊減數(shù)分裂后,形成的大孢子是與周圍細胞處于分開的狀態(tài)。 在小孢子發(fā)生時,小孢子母細胞在減數(shù)分裂前期也與絨氈層的細胞間沒有聯(lián)系。,體細胞胚：, steward從胡蘿卜體細胞胚胎發(fā)生中同樣觀察到與母體組織或外植體的維管束系統(tǒng)無直接聯(lián)系，處于相對獨立的狀態(tài)。 多種植物中都觀察到,早期的胚性細胞與周圍細胞還存在胞間連絲,但隨著胚性細胞的發(fā)育,細胞壁加厚,胞間連絲消失或被堵塞。胚性細胞開始分裂,從二細胞原胚到多細胞原胚始終被厚壁所包圍,與周圍細胞形成明顯的界限。,3.發(fā)育竟爭現(xiàn)象,胚性細胞形成后，并不是所有的都能進一步發(fā)育 成體細胞胚，這里除了培養(yǎng)誘導條件外，細胞間的 相互作用與競爭是重要的因素。 只有那些從周圍細胞獲得能量、物質的那些胚性 細胞才可繼續(xù)分裂和分化：,證據： 在這些胚胎迅速發(fā)育過程中，相鄰細胞逐漸處于 解體狀態(tài)，以致在體細胞胚周圍出現(xiàn)較大的縫隙， 與其鄰近細胞隔離開處于相對獨立的情況。 因而如何改善條件,減少細胞間相互競爭作用是提 高體細胞胚發(fā)生頻率的重要途徑。,由此推測,在胚性細胞的發(fā)生與發(fā)育過程中處于相對獨立狀態(tài),有利于胚胎發(fā)生潛力的表達。但生理隔離也只是相對的,并不意味著它們與周圍組織在生理上完全隔離開,在體細胞胚發(fā)生與發(fā)育過程中,必須從周圍細胞中取得營養(yǎng)、能量和激素等,不僅有相互依存關系,而且有相互競爭的關系。生理隔離可能是營養(yǎng)競爭的結果。,三.遺傳穩(wěn)定性與變異性,1.遺傳穩(wěn)定性： 一般認為,通過體細胞胚發(fā)生途徑形成再生植株是 相對穩(wěn)定的。理論依據是： 只有那些未經過畸變的細胞才有可能形成體細胞胚。 人工種子的制作,優(yōu)良種質的保存和無性系繁殖等,正是基于體細胞胚的基因型與原親本的相同性。,2. 變異性發(fā)生的普遍性,小麥幼胚作為外植體,通過體細胞胚發(fā)生途徑建立體細胞無性系,在其后代中出現(xiàn)廣泛的變異,包括單基因控制的質量性狀變異,如粒色、蠟性和穎色變異;多基因控制的數(shù)量性狀變異,如株高、抽穗期變異等。 寧夏枸杞葉片離體培養(yǎng)形成的再生植株根尖細胞染色體發(fā)生明顯變異。,60.64,64.30, 無性系的變異是極其廣泛的：,五種不同愈傷組織的染色體變異 愈傷組織來源 觀察細胞數(shù) 變異細胞數(shù) 變異頻率(%) 變異范圍 煙草葉片(n=24) 127 98 77.2 896 枸杞葉片(2n=24) 126 81 64.3 648 伊貝母鱗莖(2n=24) 64 39 60.9 1360 白蘭瓜子葉(2n=24) 217 166 76.5 8162 山黧豆胚根(2n=14) 211 155 73.5 6140,3.染色體數(shù)量與結構變異的原因：,數(shù)量變異：如核融合、核內有絲分裂、核內染色體復制等產生整倍多倍體；一些不正常的有絲分裂則導致產生非整倍體，如多極分裂、落后染色體、染色體后期橋等； 結構變異：分裂過程中染色體的重復、缺失、易位和倒位等。,易位,2n14,4.外源植物激素在染色體變異中的作用,激素成分對貝母鱗莖離體培養(yǎng)中染色體變異的影響 激素組合 觀察細胞數(shù) 變異細胞數(shù) 變異頻率(%) 變異范圍 2,4-d 55 19 34.5 1242 iaa 63 17 27.4 541 naa 51 12 23.5 738 2.4-d + kt 64 39 60.9 2260 iaa+kt 69 36 52.2 2148 naa+kt 73 23 31.5 1241 2,4-d、iaa、naa各lmg/l 2,4-d + kt,iaa+kt和naa+kt,kt的濃度均為0.1 mg /l， 20天后進行檢查。,5.繼代培養(yǎng)時間對培養(yǎng)細胞染色體變異的影響,愈傷組織繼代培養(yǎng)的次數(shù)與細胞染色體變異的頻率呈正相 關，即細胞倍性混亂程度增大，異形核細胞比 例增加。,伊貝母愈傷組織繼代培養(yǎng)對染色體變異的影響 繼代 培養(yǎng) 觀 察 變異 變異頻率 非整倍體 非整倍體 次數(shù) 天數(shù) 細胞數(shù) 細胞數(shù) (%) 細胞數(shù) 細胞頻率(%) 1 43 82 52 63.4 50 61.0 3 122 112 74 66.1 74 66.1 5 203 77 53 68.8 51 66.2 7 279 85 69 81.2 66 77.6 9 427 71 63 88.7 63 88.7,3-5 離體培養(yǎng)器官發(fā)生的調控機制,在合適的培養(yǎng)條件下，離體的組織或細胞可以脫分化、再分化形成任何我們所需的芽、根、葉、花，并逐步發(fā)育成完整的植株。 植物器官再生的種類受內、外兩種因素控制，即外植體的來源和所處生理狀態(tài)與培養(yǎng)時使用的激素種類和濃度。,一.離體培養(yǎng)過程中的發(fā)育事件,感受（competence）： 某些細胞對激素的誘導產生反應。 應答（commtiment）： 產生反應的細胞發(fā)生特異的細胞分裂，向形成器 官原基發(fā)育。 發(fā)育（development）： 發(fā)生特異分裂的細胞進入不定芽再生的發(fā)育路徑。,經歷第一、第二個階段后，一些細胞己經獲得了某種“決定”(determination)，沿著這一決定了的特定路線進入確定發(fā)育路徑。 現(xiàn)有的研究主要集中在兩個方面:一是從解剖學角度說明其形態(tài)發(fā)生過程；另一個是尋找參與調控器官原基發(fā)生和表達的基因與蛋白。,二.離體培養(yǎng)中芽的起源及參與其發(fā)生的基因,（一）關于芽的起源： 源于莖尖分生組織（shoot apical meristem, sam）的一部分細胞并始終保持其自主性的“detached meristem”理論（馬鈴薯）。 源于莖尖分生組織中的某些新細胞，即“de novol cells”理論（擬南芥）。,（二）調控腋芽和莖尖分生組織發(fā)育的基因,1.通過調節(jié)植物體內激素的分布和時間來影響腋芽 和莖尖分生組織發(fā)育的時間和腋芽形成數(shù)目的基因: axr（auxin-insensitive）, tb1(teosinte branched 1), sps(supershoot)。,2.直接影響（促進或抑制）腋芽分生組織及其后的發(fā)生發(fā)育過程的基因 與生長素、細胞分裂素或獨角金內酯信號傳導有關的因子: pin、cre1、ahks、max1等； 與細胞分裂相關的細胞周期蛋白和細胞周期蛋白依賴性激酶cdks（cyclin dependentkinase）； 與莖尖分生組織發(fā)育相關基因：knox、wus、moc1、ls、clv1、clv3等；,三.knox基因與莖尖組織發(fā)育,knox（knotted-like homeobox genes）家族是植物中 的4個同源異型盒基因家族（knox、wox、bell、hd-zip） 之一，幾乎存在于所有的單子葉和雙子葉植物中。 （一）knox基因家族： 1.knox亞家族： 主要在植物分生組織中表達，是分生組織發(fā)生與維持所必 須的關鍵基因，調控與器官發(fā)生相關的細胞分化，最終影響側 生器官的形態(tài)建成。,2.knox亞家族： 在所有植物組織中均表達，由于表達廣泛且缺乏 響應的突變體，目前對其研究較少。,莖尖形態(tài)結構（morphology of shoot apex）,（二）knox基因在莖尖中的時空表達,1.莖尖分生組織的結構,周圍區(qū)的細胞通常較小,細胞分裂速度較快,位于sam的側翼邊緣,發(fā)育過程中分化為葉、側芽和莖外層組織。肋區(qū)促成莖的伸長。,以擬南芥為例,擬南芥中有4個knox基因: stm,bp,knat2和 knat6。這些基因共同參與維持莖尖分生組織活力與結構，確 定側生器官邊界等功能。,擬南芥根離體培養(yǎng)過程中和莖（芽）形成相關基因的表達順序,自體調節(jié)/反饋調節(jié),出生側枝,擬南芥胚胎發(fā)育過程中典型基因的表達模式,ga,stm (knox),ck,arr,wus,胚胎發(fā)育過程中典型基因的表達模式,3-6 體細胞胚發(fā)生中基因表達與調控,調控,1、順式作用元件及其鑒出:啟動子、增強子 2、反式作用因子,3.體細胞胚發(fā)生中基因表達的激素調節(jié)； iaa、ctk、aba、2，4-d 4.蛋白質磷酸化與基因表達 5. dna的甲基化對基因表達的調控作用,一.體細胞胚發(fā)生中特定遺傳信息的表達,1.mrna的合成： mrna在細胞中的含量很低(占總rna的1%5%), 每種特異 mrna的含量則更少。 植物細胞中mrna合成的知識主要來自于對幾種能產生高豐 度mrna的基因的研究。 mrna分子的合成過程大致分為三步：,m7g5ppp5npnp,2.胚性蛋白質的形成,在有胚胎發(fā)生的體細胞培養(yǎng)中均有特異性蛋白表達 苜蓿體細胞胚發(fā)生中,在誘導培養(yǎng)第5天的胚性細胞中有50kd的特異性蛋白表達； 在胡蘿卜、水稻、玉米、豌豆等的胚性愈傷組織中存在45 55kd的相關性蛋白； 在小麥和枸杞體細胞胚發(fā)生早期分別檢測到49kd和35 kd相關性蛋白。,二.體細胞胚發(fā)生中基因表達常用鑒定方法,1.轉錄水平上的鑒定 (1) northern雜交： 通過細胞總rna或ploy(a) mrna與探針的雜交 來分析基因轉錄水平的方法，稱northern 雜交。 程序：植物總rna的提取；探針的制備；印跡 及雜交。,斑點雜交與印跡雜交的區(qū)別：,斑點雜交只需要將rna樣品點在固相膜上直接與 探針雜交。此法只能鑒定基因是否轉錄； 印跡雜交則需要先將提取的總rna或mrna樣品進 行電泳分離，然后轉移到固相膜上，再與探針雜 交。此法可對基因的轉錄情況進行較詳細的分析， 如rna轉錄的大小及豐度等。,（2）mrna差別顯示技術,在生物體發(fā)育的不同階段，或是在不同組織或細胞 中發(fā)生的不同基因，按時間、空間進行有序的表達方 式，叫基因的差異表達（differential expression）。 ddrt-pcr技術的基本原理: 合成兩組引物,通過隨機組合,使1500種自由mrna 均有擴增機會,并顯示出清晰的電泳條帶：,ddrt-pcr反應的基本程序,a 從一對不同組織或器官中分離總rna，分別為a、b兩組： b 5-nmaaaaaaaaaaa aa a(a)3n nmttttttttt tt 3 5 反轉錄酶 3端錨定引物(5-t11mn-3) 5-nmaaaaaaaaaaa aa a(a)3n nmttttttttt tt 3 5 a b 5端隨機引物 c nmttttttttt tt 3端錨定引物(5-t11mn-3) pcr 5隨機引物 放射性標記dntps nmttttttttt tt d,cdna,優(yōu)點：,可以同時比較多個樣品間基因表達的差異； 可以同時檢測到“上游”及“下游”基因； 檢測靈敏度高,所需樣品少,經過pcr擴增一些 低豐度的mrna也可以被檢測出來； 結合使用了pcr和序列膠電泳分析兩項技術,使 本法具有高效性。,(3) mrna的體外翻譯,rna的體外翻譯技術： 從細胞中提取的自由mrna 或總rna，在無細胞提取液 的環(huán)境中被翻譯合成蛋白質 的技術。 優(yōu)點：可以探討體內翻譯后產生蛋白質的修飾、加工過程,以及蛋白質活性問題。體外翻譯所產生的蛋白質無進一步的修飾加工過程,它所具有的一切特性都是編碼它的基因經轉錄和轉錄后的修飾、加工所提供的。,從細胞中提取rna 體外翻譯系統(tǒng) + 除met外的19 種氨基酸+mgac2+kac+35s-met 30溫浴 蛋白質 免疫沉淀或sds聚丙烯酰胺 凝膠電泳進行分析,2.翻譯水平上的鑒定,(1)蛋白質的雙向電泳 雙向電泳是將等電聚焦ief 和 sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳結合 起來,依據蛋白質的等電點和分子量來分辨蛋白質有關信息的 技術。 特點: ief/sds-page雙向電泳技術既能提高多肽的分辨率, 又能提供有關多肽的分子量、氨基酸組成及在某些場合下翻譯 后修飾作用的信息。,利用該技術研究發(fā)現(xiàn)，苜蓿體細胞胚發(fā)生中的特異蛋白質50kd蛋白質，是等電點不同而分子量相同的三種蛋白質,在非胚性愈傷組織中缺乏這種蛋白質； 在胡蘿卜的體細胞胚發(fā)生研究中得到了伴隨2,4-d的加入而產生的蛋白質。 發(fā)現(xiàn)枸杞胚性愈傷組織中有70kd, 56kd，32kd和一系列較小分子量(2026kd)的特異蛋白質表達。,(2)western雜交,westem雜交是將蛋白質 電泳、印跡、免疫測定融為 一體，用來檢測表達的產物 不具酶活性的特異蛋白質表 達的技術?？梢詮闹参锛毎?總蛋白中檢出50 ng的特異 性蛋白質，若是提純的蛋白 質,可檢至15ng，具有很 高的靈敏度。 根據檢出結果,可得知被檢植物細胞內目的蛋白表達與否,濃度高低及大致的分子量。,從植物細胞中提取總蛋白或目的蛋白 溶解于含去污劑和還原劑的溶液中 經sds聚丙烯酸膠凝膠電泳，使蛋白質 按分子量大小分離 將分離的各蛋白質條帶原位轉移到固相 膜上,膜在高濃度的蛋白質溶液中溫育, 以封閉非特異性位點 然后加入特異抗體(一抗),印跡上的目的 蛋白(抗原)與-l抗結合 加入能與一抗專一結合的標記的二抗 通過二抗上標記化合物的性質進行檢出,(3) ellsa檢測技術(酶聯(lián)免疫吸附法),elisa是一種利用免疫學原理檢測抗原、抗體的技術。其測定的靈敏度極高和具有較強特異性，是研究基因表達十分有效的方法。 elisa檢測程序分三個階段:抗體的制備;抗體或抗原的包被；免疫反應及檢出。其中酶-抗體偶聯(lián)物的制備是該技術的基礎。 elisa使用的酶應具有特異性強、純度及比活高、室溫下穩(wěn)定、來源方便、價格便宜等優(yōu)點。目前主要使用辣根過氧化物酶(hrp)和堿性磷酸酶(akp)。,三.體細胞胚發(fā)生中基因表達的調控,1.順式作用元件及其鑒出 順式作用元件(cis-acting element)： 是指基因5端上游區(qū)中那些與基因表達調控有關的 dna序列，包括一般基因都有的tata box與caatbox 和一些重要的調控元件。由于這些序列均與基因處于 順式位置，即在同一條dna鏈上,故冠以順式之名。,啟動子(promotor)是指rna聚合酶識別并與之 結合,從而起始轉錄的一段特異性dna序列,包括 tata盒（控制轉錄啟動的準確性）與cat盒（調控 轉錄的起始頻率）兩部分序列。 增強子(enhancer)是能夠增強與之相連鎖的基 因轉錄活性的調控序列。增強子的結構與啟動子非 常相似, 其功能是結合特定的轉錄因子或影響dna 構象。, 順式作用元件(cis-acting element)的鑒出,構建融合基因(從轉錄起始點開始的5上游區(qū)一定長度的dna片段與報告基因 編碼區(qū)及3末端區(qū)相連接) 用exo外切核酸酶處理 得到5端各有不同缺失長度的融合基因 轉化植物 獲得含有上述不同缺失長度融合基因突變體的植株 用組織化學方法或其他方法,分析基因的5上游區(qū)缺失到什么部位就不能使 報告基因表達,或失去正確時空表達專一性,或失去對脅迫因素的應答能力。 找到調控元件存在的區(qū)域 從該區(qū)域的5端作小范圍的缺失突變,或從該區(qū)域中間的不同部位造成缺 失突變 找出調控元件存在的準確位點 人工合成此位點內的核苷酸序列,或將此序列中的個別核苷酸調換,或將這段 序列與突變后的序列分別連接在基礎啟動子上游 檢測它們是否能調節(jié)報告基因的表達,2.反式作用因子(trans-acting factor) 反式作用因子是指那些結合到順式作用元件上特 異dna序列，并相互作用而實現(xiàn)其調節(jié)效應的蛋白質 因子，它們可以增強或阻遏基因的表達,或者決定著基 因表達的組織與發(fā)育階段專一性。,主要的反式作用因子有：,基礎轉錄因子，是與tata盒/啟動子結合的蛋白質因子； 轉錄調控因子，是一些與啟動子上游序列結合的蛋白質因子； 誘導基因表達的轉錄因子，它是與基因的啟動子或增強子區(qū)內一小段短的dna序列結合從而完成該基因的誘導表達過程蛋白質因子； 細胞專一基因表達的轉錄因子，這些因子通常都在某一特定組織中合成或激活并誘發(fā)細胞專一基因的轉錄。,轉錄因子的作用方式,研究發(fā)現(xiàn)，轉錄因子通常由dna結合區(qū)和轉錄激活 區(qū)兩個功能區(qū)組成。,(1) dna結合區(qū)的類型,螺旋-轉角-螺旋結構 由兩個的-螺旋通過-折疊相互 垂直連接構成：兩個的-螺旋 中的一個通過與磷酸作用，與 dna形成非特異的結合；另一 個叫識別螺旋，與dna上的堿 基序列特異的接觸結合。,左圖,右圖,鋅指(zinc finger)結構,由多個重復的結構組成，每個 分子中結合有7-11個鋅原子， 每2個半胱氨酸（cys）和2個 組氨酸（his）與一個zn原子結 合形成鋅指，一個完整的分子 可形成多個“指頭”，這有利于 dna結合。,由亮氨酸豐富區(qū)組成兩個-螺旋：每7個氨基酸就有1個亮氨酸，螺旋中每兩圈出現(xiàn)一個亮氨酸；二個蛋白質因子的-螺旋通過亮氨酸的疏水作用形成一個拉鏈（二聚體）,其作用只是使兩個蛋質分子能形成雙體，從而有助于堿性功能區(qū)與dna 結合。,亮氨酸拉鏈(leucine zipper)結構,(2)激活功能區(qū),轉錄因子的轉錄激活功能區(qū)一般 由30個到150個氨基酸組成，其結 構主要有三種類型：酸性功能區(qū)、 谷氨酰胺豐富功能區(qū)和脯氨酸豐富 功能區(qū)。其作用機制可能有兩種模 式： 一是激活功能區(qū)直接與rna聚合 酶相互作用，從而提高其活性。 二是激活功能區(qū)與其他轉錄因子 （tfd）作用，然后再作用于 rna聚合酶。,3.體細胞胚發(fā)生中基因表達的激素調節(jié),(1) 細胞分裂素對基因表達的調控 細胞分裂素能夠直接調控細胞核基因的活性： 例如，從豌豆染色質中分離到一種細胞分裂素受 體蛋白,在rna合成實驗體系中加入這種蛋白質及細 胞分裂素時可以使rna合成速度增加20%到50% （細胞分裂素受體蛋白能作為一種反式作用因子識 別dna中某些基因的順式作用元件）。,細胞分裂素可調控蛋白質的磷酸化； 細胞分裂素還可調控蛋白質的翻譯： 例如，一種稱為異戊間二烯腺嘌呤(ipa)細胞分裂 素存在于trna分子的反密碼子鄰近處。 實驗證 實，ipa具有是維持密碼和反密碼子之間的相互協(xié)調 的作用。,(2)生長素對基因表達的調控,植物生長素能誘導mrna的合成，而且能調控細胞內mrna的含量水平： 已克隆出幾個受植物生長素誘導的mrna的cdna 2,4-d可以誘導苜蓿體細胞胚胎發(fā)生中編碼富含脯氨酸的小分子蛋白質基因(msprp5)的表達；用100 mol/l的2,4-d處理愈傷組織20min，其msprps 的mrna量開始增加,處理24-48h， mrna的量達到峰值。,生長素受體在基因表達調控中的作用方式： 激素受體是一類特殊的識別蛋白, 生長素先與靶 細胞膜或細胞質中的激素受體結合,形成“生長素- 受體”復合物，進而轉移到細胞核內，復合物特異 性、高親和地與dna上特定序列相互作用（激活反 式作用因子），形成新的rna，在轉錄水平上調控 基因表達：,(3) aba對基因表達的調控,aba對植物的生理及發(fā)育過程都有調控作用，包括胚胎形態(tài)