流式細(xì)胞凋亡分析-2.ppt

流式細(xì)胞凋亡分析,概 念,細(xì)胞凋亡（apoptosis）是指有核細(xì)胞在一定條件下通過啟動(dòng)其內(nèi)部自身機(jī)制，主要是通過內(nèi)源性DNA內(nèi)切酶的激活而發(fā)生的細(xì)胞死亡過程。細(xì)胞凋亡是受基因控制的一種主動(dòng)性細(xì)胞自殺過程，是生物體中一種普遍存在的現(xiàn)象。,概 念,細(xì)胞凋亡是維持人體正常生理過程和功能活動(dòng)所必需的，是多細(xì)胞生物生命活動(dòng)過程中不可缺少的組成內(nèi)容，是其藉以存活的需要，貫穿了生物全部生命周期中。,概 念,細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死（necrosis）是細(xì)胞死亡的兩種模式，但兩者有明顯的區(qū)別。后者是由于細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷或或大劑量細(xì)胞毒藥物作用后發(fā)生的被動(dòng)分解過程，并可導(dǎo)致周圍組織的炎癥反應(yīng)。,概 念,細(xì)胞凋亡的作用主要包括以下幾方面： 清除無功能的細(xì)胞； 控制細(xì)胞數(shù)量； 清除病態(tài)的或有害的細(xì)胞； 清除多余的細(xì)胞；,細(xì)胞凋亡的特征,形態(tài)學(xué)特征： 光鏡下，凋亡細(xì)胞最突出的形態(tài)學(xué)特征是細(xì)胞核固縮、染色質(zhì)濃集、細(xì)胞變圓皺縮而細(xì)胞膜保持完整，其中胞核變化尤為突出。染色質(zhì)的濃集可能是由于凋亡細(xì)胞核雙鏈DNA發(fā)生裂解所致。,細(xì)胞凋亡的特征,形態(tài)學(xué)特征： DNA降解后，形成長(zhǎng)度主要為180-200bp的DNA片斷，隨后細(xì)胞裂解成許多有膜包被的小體，稱為凋亡小體（apoptotic bodies),最后被巨噬細(xì)胞吞噬，但不會(huì)引起周圍組織的炎癥反應(yīng)。凋亡小體是凋亡細(xì)胞特征性的標(biāo)志。如在顯微鏡下觀察到凋亡小體，則可確認(rèn)為細(xì)胞發(fā)生了凋亡。,細(xì)胞凋亡的特征,形態(tài)學(xué)特征： 電鏡下，細(xì)胞核內(nèi)可見高電子密度區(qū)，這是核DNA在核小體連接處斷裂成核小體后，在異染色質(zhì)區(qū)聚集形成的染色質(zhì)濃縮塊。染色質(zhì)聚集區(qū)以外的低電子密度區(qū)為透明區(qū)，是由于核孔變大導(dǎo)致其通透性增加，細(xì)胞質(zhì)中水分不斷滲入而造成。線粒體增殖，呈空泡化。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔擴(kuò)大，為凋亡細(xì)胞形成自噬體提供包裹膜。細(xì)胞骨架變得致密、紊亂。,細(xì)胞凋亡的特征,形態(tài)學(xué)特征：,細(xì)胞凋亡的特征,形態(tài)學(xué)特征：,細(xì)胞凋亡的特征,形態(tài)學(xué)特征： 共聚焦顯微鏡觀察，凋亡細(xì)胞膜電位和線粒體膜電位下降，膜流動(dòng)性降低。細(xì)胞膜上新出現(xiàn)了一些生物大分子如磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine,ps)和凝血酶敏感蛋白等，這些分子的出現(xiàn)與凋亡細(xì)胞的清除有關(guān)。,細(xì)胞凋亡的特征,形態(tài)學(xué)特征： 凋亡細(xì)胞另一個(gè)形態(tài)特征通過總DNA提取，DNA凝膠電泳分析，可呈現(xiàn)出梯狀圖譜，可見清晰的DNA梯子(ladder)。,細(xì)胞凋亡的特征,生化特征： 1 caspase蛋白酶： 細(xì)胞凋亡的發(fā)生和發(fā)展過程也可能是水解酶級(jí)聯(lián)切割的過程，它將大分子結(jié)構(gòu)的物質(zhì)如DNA、細(xì)胞骨架水解變性成小分子碎片，致使細(xì)胞發(fā)生凋亡。,細(xì)胞凋亡的特征,生化特征： 1 caspase蛋白酶： 其中，半胱氨酸蛋白酶家族發(fā)揮了重要作用。它具有一段攜帶活化位點(diǎn)的保守氨基酸序列，可以特異性識(shí)別、切割天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶殘基。由于這些蛋白酶具有相同的結(jié)構(gòu)和功能特性而被稱為caspase。,細(xì)胞凋亡的特征,生化特征： 1 caspase蛋白酶： caspase可能在凋亡細(xì)胞的形態(tài)變化中起了主導(dǎo)作用。Caspase通常是以酶原形式存在，通過其自身誘發(fā)的蛋白水解而轉(zhuǎn)化為有活性的酶，活化的caspase進(jìn)一步激活其他的caspase前體，形成了級(jí)聯(lián)放大切割過程，裂解重要的大分子物質(zhì)，導(dǎo)致凋亡。,細(xì)胞凋亡的特征,生化特征： 1 caspase蛋白酶： 目前已發(fā)現(xiàn)15個(gè)caspase家族成員，分別命名為caspase-115，并根據(jù)其功能特點(diǎn)分成兩類，即啟動(dòng)caspase(caspase-2、8、9、10）和效應(yīng)caspase(caspase3、6、7）。,細(xì)胞凋亡的特征,生化特征： 1 caspase蛋白酶： 啟動(dòng)caspase作用于凋亡信號(hào)觸發(fā)后上游的不可逆位點(diǎn)。效應(yīng)caspase由啟動(dòng)胱冬肽酶激活，作用于下游的執(zhí)行位點(diǎn)，裂解細(xì)胞成凋亡小體。分子結(jié)構(gòu)相互聯(lián)系的這兩部分影響線粒體，通過線粒體方式執(zhí)行凋亡的信號(hào)。bcl-2家族成員能調(diào)節(jié)執(zhí)行位點(diǎn)的進(jìn)程。,細(xì)胞凋亡的特征,生化特征： 1 caspase蛋白酶： caspase-3是最重要的指示蛋白酶，為17kD和12kD亞單位組成的異二聚體。活化的caspase-3可以蛋白水解切割和激活其他caspase、相關(guān)的胞質(zhì)靶位點(diǎn)（細(xì)胞因子18，CK18)和細(xì)胞核靶位點(diǎn)。Caspase-3切割CK18是凋亡過程中caspase切割發(fā)生的早期指示因子。,細(xì)胞凋亡的特征,生化特征： 2 核酸內(nèi)切酶的激活： 細(xì)胞凋亡時(shí)，內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶被激活，將核小體間連接DNA降解，形成長(zhǎng)度主要為180-200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段，組蛋白和其他核內(nèi)蛋白質(zhì)不降解，核基質(zhì)也不改變。在DNA凝膠電泳分析中呈現(xiàn)出特征性“梯狀”條帶，而細(xì)胞壞死時(shí)，DNA片斷大小不一，無“梯狀”條帶出現(xiàn)。但并非所有凋亡細(xì)胞都能檢測(cè)到這種典型的生化特征。,細(xì)胞凋亡的特征,生化特征： 2 核酸內(nèi)切酶的激活：,細(xì)胞凋亡的特征,生化特征： 3 線粒體的變化： 線粒體發(fā)生的重要改變之一就是凋亡誘導(dǎo)因子使線粒體通透性升高，膜上巨型通道開放，使線粒體蛋白進(jìn)入細(xì)胞液中，線粒體膜兩側(cè)質(zhì)子不對(duì)稱性消失，線粒體膜電位迅速下降，電子傳遞與呼吸鏈解偶聯(lián)。,細(xì)胞凋亡的特征,生化特征： 3 線粒體的變化： 線粒體膜電位的變化發(fā)生在細(xì)胞凋亡的早期。線粒體膜電位是由于其內(nèi)膜兩側(cè)質(zhì)子和其他離子分布不對(duì)稱造成的。線粒體參與了凋亡的調(diào)控和實(shí)施。與凋亡密切相關(guān)的bcl-2家族分布在細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)，其中線粒體外膜上分布最多，bcl-2具有抑制線粒體通透性變化的能力，并通過此途徑抑制細(xì)胞凋亡。,細(xì)胞凋亡的特征,生化特征： 4 胞質(zhì)Ca2+和pH的變化： 細(xì)胞內(nèi)Ca2+和H+濃度的穩(wěn)定對(duì)維持生命活動(dòng)至關(guān)重要。胞內(nèi)Ca2+庫的釋放，胞質(zhì)Ca2+與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切。胞外Ca2+內(nèi)流促使胞質(zhì)Ca2+持續(xù)升高，作為凋亡信號(hào)啟動(dòng)凋亡發(fā)生。,細(xì)胞凋亡的特征,生化特征： 4 胞質(zhì)Ca2+和pH的變化： 此外，Ca2+的釋放打破了細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，使得細(xì)胞凋亡效應(yīng)系統(tǒng)的關(guān)鍵成分開始和細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常時(shí)不能接觸到的基質(zhì)接觸，從而觸發(fā)細(xì)胞凋亡。,細(xì)胞凋亡的特征,生化特征： 4 胞質(zhì)Ca2+和pH的變化： 細(xì)胞pH的變化可影響細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡時(shí)伴隨胞質(zhì)pH降低，胞質(zhì)酸化影響細(xì)胞凋亡。胞質(zhì)pH降低可能與胞質(zhì)Ca2+升高有關(guān)。胞質(zhì)酸化主要通過激活酸性DNase啟動(dòng)細(xì)胞凋亡。pH降低也影響了一些酸性功能蛋白在細(xì)胞凋亡過程中的作用。,細(xì)胞凋亡的基因調(diào)控,細(xì)胞凋亡受基因的調(diào)控，其機(jī)制非常復(fù)雜。凋亡基因可分為兩類： 1誘導(dǎo)基因：野生型p53基因、c-myc、細(xì)胞表面抗原基因Apo-1(Fas)等 2抑制基因：bcl-2、突變型p53基因和ras基因等,細(xì)胞凋亡的基因調(diào)控,上述兩類基因蛋白產(chǎn)物的表達(dá)對(duì)凋亡起重要調(diào)控作用。誘導(dǎo)基因蛋白產(chǎn)物表達(dá)上調(diào)，可提高細(xì)胞對(duì)凋亡信號(hào)的敏感性，促進(jìn)凋亡發(fā)生。抑制基因蛋白產(chǎn)物表達(dá)，可降低細(xì)胞對(duì)凋亡信號(hào)的敏感性，抑制或推遲凋亡。,細(xì)胞凋亡的基因調(diào)控,誘導(dǎo)與抑制凋亡兩大基因蛋白表達(dá)的平衡，可對(duì)細(xì)胞的增殖、分化和死亡進(jìn)行調(diào)控，維持細(xì)胞群體的正常穩(wěn)定性。當(dāng)調(diào)控失衡時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致疾病，如腫瘤、AIDS、霍奇金淋巴瘤等。,細(xì)胞凋亡的基因調(diào)控,常見的凋亡基因及其蛋白： 1 bcl-2 是研究最早的與凋亡有關(guān)的基因。 bcl-2基因是一種對(duì)細(xì)胞凋亡具有明顯抑制作用的癌基因。它是阻止細(xì)胞死亡的最后途徑，而對(duì)細(xì)胞周期無明顯影響。它能抑制由許多因子，如化療藥物、某些病毒、p53、c-myc及生長(zhǎng)因子等激發(fā)的凋亡。,細(xì)胞凋亡的基因調(diào)控,常見的凋亡基因及其蛋白： 2 p53 p53基因不僅是一種與腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的抑癌基因，而且參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化及死亡的調(diào)控。P53在調(diào)節(jié)凋亡中起重要作用。正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞在受到紫外線或gamma射線照射后，含正常p53的細(xì)胞，可發(fā)生凋亡，而p53基因缺失或突變的細(xì)胞則表現(xiàn)出對(duì)電離射線和化療藥物的抗性。野生型p53對(duì)凋亡起促進(jìn)作用，突變型p53對(duì)凋亡起抑制作用。,細(xì)胞凋亡的基因調(diào)控,常見的凋亡基因及其蛋白： 3 Fas和Fas配體 Fas是腫瘤壞死因子（TNF）受體和神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體家族的細(xì)胞表面分子。Fas配體（Fas ligand,FasL)是TNF家族的細(xì)胞表面分子。FasL與其受體Fas結(jié)合導(dǎo)致攜帶Fas的細(xì)胞凋亡?？笷as抗體、表達(dá)FasL的細(xì)胞和可溶性的FasL與Fas交聯(lián)均產(chǎn)生細(xì)胞凋亡信息，而bcl-2過度表達(dá)能抑制Fas致凋亡作用。,細(xì)胞凋亡與疾病,細(xì)胞凋亡與腫瘤： 以往，細(xì)胞增殖的失調(diào)、細(xì)胞分化與增殖紊亂被認(rèn)為是惡性腫瘤的發(fā)生機(jī)制。近來，人們認(rèn)識(shí)到在腫瘤細(xì)胞快速增殖過程中，同時(shí)也發(fā)生凋亡，增殖與凋亡之間的平衡有可能決定著腫瘤的生長(zhǎng)速度。細(xì)胞凋亡的減少，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。,細(xì)胞凋亡與疾病,細(xì)胞凋亡與腫瘤： 凋亡調(diào)節(jié)基因的紊亂、凋亡機(jī)制蛋白的增加是腫瘤形成的重要機(jī)制。用于調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡的基因主要有bcl-2基因家族、p53基因、Fas基因家族和c-myc基因家族。,細(xì)胞凋亡與疾病,細(xì)胞凋亡與腫瘤： 許多腫瘤，尤其是消化道腫瘤?？梢姷蛲龅陌l(fā)生。凋亡在胃粘膜發(fā)生腸上皮化生等病變中起決定性作用，但胃癌的凋亡指數(shù)低于慢性胃炎和胃潰瘍。因此，胃粘膜病變細(xì)胞凋亡減少、生存期延長(zhǎng)、細(xì)胞大量堆積可能是胃癌發(fā)生、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。,細(xì)胞凋亡與疾病,細(xì)胞凋亡與腫瘤： 凋亡還可能與胃癌的血管生成有關(guān)。凋亡指數(shù)與腫瘤內(nèi)部微血管密度成負(fù)相關(guān)，并與胃癌的組織類型有關(guān)。,細(xì)胞凋亡與疾病,細(xì)胞凋亡與免疫系統(tǒng)疾?。?許多以免疫功能異常為主要特征的疾病均存在細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。細(xì)胞凋亡在免疫形態(tài)的發(fā)生分化以及抗感染免疫和自身免疫病的發(fā)生中起重要作用。,細(xì)胞凋亡與疾病,細(xì)胞凋亡與免疫系統(tǒng)疾?。?當(dāng)?shù)蛲鲞^少、炎癥反應(yīng)過強(qiáng)時(shí)，易造成變態(tài)反應(yīng)或自身免疫病。當(dāng)?shù)蛲鲞^多，機(jī)體免疫力下降時(shí)，容易繼發(fā)感染與腫瘤。在細(xì)胞凋亡過程中，CD95(Fas)/CD95L(FasL)以及CD40/CD40L之間的相互作用起了重要作用。它們通過激活T淋巴細(xì)胞的自殺或殺傷激活的B淋巴細(xì)胞，進(jìn)一步調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的強(qiáng)弱。,細(xì)胞凋亡與疾病,細(xì)胞凋亡與免疫系統(tǒng)疾?。?當(dāng)?shù)蛲鲞^少、炎癥反應(yīng)過強(qiáng)時(shí)，易造成變態(tài)反應(yīng)或自身免疫病。當(dāng)?shù)蛲鲞^多，機(jī)體免疫力下降時(shí)，容易繼發(fā)感染與腫瘤。在細(xì)胞凋亡過程中，CD95(Fas)/CD95L(FasL)以及CD40/CD40L之間的相互作用起了重要作用。它們通過激活T淋巴細(xì)胞的自殺或殺傷激活的B淋巴細(xì)胞，進(jìn)一步調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的強(qiáng)弱。,細(xì)胞凋亡與疾病,細(xì)胞凋亡與免疫系統(tǒng)疾?。?近來研究發(fā)現(xiàn)，淋巴細(xì)胞凋亡作用的缺陷與系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系。淋巴細(xì)胞凋亡的缺陷常是自身基因調(diào)控異常的結(jié)果。目前已明確定義為自身基因的有Fas和bcl-2等。,細(xì)胞凋亡與疾病,細(xì)胞凋亡與皮膚?。?某些皮膚病是以凋亡的增加為特征。銀屑病表皮的基底膜上層中觀察到凋亡的形態(tài)學(xué)和生化特征。plaque基底細(xì)胞層bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)顯著下降。,細(xì)胞凋亡與疾病,細(xì)胞凋亡與皮膚?。?自身免疫性皮膚病，如皮肌炎、硬皮病等，其免疫異常與自身反應(yīng)性T、B淋巴細(xì)胞凋亡缺陷有關(guān)。惡性黑色素瘤的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞凋亡基因調(diào)控失常而導(dǎo)致凋亡障礙有關(guān)。此外，細(xì)胞凋亡與皮膚腫瘤自動(dòng)消退有關(guān)。,細(xì)胞凋亡與疾病,缺血性腦損傷和缺血性心臟?。?以往，腦缺血導(dǎo)致的細(xì)胞死亡被認(rèn)為是由于神經(jīng)元廣泛壞死所致。近來研究表明，全腦或局部腦梗死均激活細(xì)胞凋亡過程。大腦半球短暫缺血后，缺血中心區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞很快壞死，但周圍的神經(jīng)細(xì)胞，以海馬CAI區(qū)的錐形細(xì)胞最為明顯，要經(jīng)過一個(gè)潛伏期才出現(xiàn)延遲性神經(jīng)細(xì)胞退化，即細(xì)胞凋亡。,細(xì)胞凋亡與疾病,缺血性腦損傷和缺血性心臟病： 這種凋亡發(fā)生在缺血后1-2天，并在缺血周邊區(qū)域出現(xiàn)bcl-2蛋白的表達(dá)。而且，不僅在神經(jīng)細(xì)胞，在膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和血管壁中也有表達(dá)，這提示非致死性的損傷導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生bcl-2，以抵抗細(xì)胞的凋亡。此外，在缺血后的腦組織中檢測(cè)到Fas抗原mRNA明顯增加，提示Fas在凋亡中起一定作用。,細(xì)胞凋亡與疾病,缺血性腦損傷和缺血性心臟?。?除了細(xì)胞壞死以外，凋亡也是缺血性心肌細(xì)胞死亡的重要方式。在體心臟實(shí)驗(yàn)表明，再灌注損傷和心肌梗死均能誘發(fā)心肌細(xì)胞凋亡，尤其在梗死早期。心肌梗死的大小取決于細(xì)胞凋亡的嚴(yán)重程度，凋亡可能是缺血性心臟病演化為心力衰竭的細(xì)胞學(xué)機(jī)制。,細(xì)胞凋亡與疾病,感染性疾病： HIV感染可導(dǎo)致AIDS。其感染的細(xì)胞學(xué)特征是特異性破壞CD4+T淋巴細(xì)胞，造成相關(guān)免疫功能缺陷，導(dǎo)致感染和腫瘤。在HIV感染過程中，從HIV對(duì)CD4+T淋巴細(xì)胞黏附、病毒顆粒進(jìn)入細(xì)胞、HIV基因組在細(xì)胞中復(fù)制和裝配以及出芽釋放等環(huán)節(jié)，都與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。,細(xì)胞凋亡與疾病,其他疾病： 腎小球腎炎和狼瘡腎炎動(dòng)物模型中均發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞，這些凋亡細(xì)胞可能與腎小球硬化和腎功能衰竭有關(guān)。血管動(dòng)脈粥樣硬化形成過程中，平滑肌細(xì)胞的增殖與凋亡同時(shí)存在，凋亡對(duì)內(nèi)皮損傷、增殖抑制、粥樣病灶的形成和斑塊的剝脫有一定的影響。,細(xì)胞凋亡與疾病,通過對(duì)各種疾病細(xì)胞凋亡的研究，使我們對(duì)疾病的發(fā)生機(jī)制有了新的認(rèn)識(shí)，同時(shí)也為疾病的治療提供了新的思路。,流式細(xì)胞分析細(xì)胞凋亡,形態(tài)學(xué)特征檢測(cè) 凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化是細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)最可靠的證據(jù)，其直接檢測(cè)方法主要是通過對(duì)組織或細(xì)胞進(jìn)行各種染色，然后在光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡下觀察。,流式細(xì)胞分析細(xì)胞凋亡,形態(tài)學(xué)特征檢測(cè) 凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化是細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)最可靠的證據(jù)，其直接檢測(cè)方法主要是通過對(duì)組織或細(xì)胞進(jìn)行各種染色，然后在光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡下觀察。如通過蘇木素-伊紅（HE)染色、吉姆薩（Giemsa)染色、甲基綠-哌諾寧染色在普通光學(xué)顯微鏡下觀察；通過熒光染料如丫啶橙（AO)、Heochst33258染色在熒光顯微鏡下觀察；或制成超薄切片用電子顯微鏡觀察，以區(qū)別凋亡和壞死。,流式細(xì)胞分析細(xì)胞凋亡,形態(tài)學(xué)特征檢測(cè) FCM可間接觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，主要是根據(jù)未經(jīng)染色的凋亡細(xì)胞的光散射特征進(jìn)行檢測(cè)。,流式細(xì)胞分析細(xì)胞凋亡,形態(tài)學(xué)特征檢測(cè) FCM提供的散射光參數(shù)主要包括前向散射光（FSC）和測(cè)向散射光（SSC）。FSC主要與細(xì)胞大小有關(guān)，對(duì)同一個(gè)細(xì)胞群體，散射光強(qiáng)的，其細(xì)胞大一些，散射光弱的，其細(xì)胞小一些。SSC主要與細(xì)胞內(nèi)部顆粒密度有關(guān)，顆粒密度越大，SSC就越大，而顆粒密度越小，SSC就越小。,流式細(xì)胞分析細(xì)胞凋亡,形態(tài)學(xué)特征檢測(cè) 當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡的早期，細(xì)胞膜完整、細(xì)胞皺縮，因此這一階段凋亡細(xì)胞FSC較活細(xì)胞小，而SSC較之增強(qiáng)或無明顯變化。,流式細(xì)胞分析細(xì)胞凋亡,形態(tài)學(xué)特征檢測(cè) 當(dāng)細(xì)胞凋亡進(jìn)一步發(fā)展時(shí)，細(xì)胞皺縮更加明顯，核質(zhì)的變化導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)顆粒密度明顯增強(qiáng)，F(xiàn)SC進(jìn)一步變小，而SSC卻明顯增大。最終，當(dāng)?shù)蛲鲂◇w形成時(shí)，F(xiàn)SC明顯縮小。,流式細(xì)胞分析細(xì)胞凋亡,形態(tài)學(xué)特征檢測(cè) 此外，也可通過FSC區(qū)分壞死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞。細(xì)胞壞死時(shí)，由于細(xì)胞腫脹，其FSC增大，SSC在細(xì)胞壞死時(shí)也增大。但晚期凋亡細(xì)胞的FSC和SSC與壞死細(xì)胞區(qū)分不明顯。當(dāng)壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜破裂，核質(zhì)丟失，細(xì)胞成為碎片時(shí)，其FSC和SSC均明顯變小。,流式細(xì)胞分析細(xì)胞凋亡,流式細(xì)胞分析細(xì)胞凋亡,形態(tài)學(xué)特征檢測(cè) 但實(shí)際上，由于被檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)上的均一性和核/質(zhì)比例不同，凋亡不同階段的細(xì)胞，其光散射參數(shù)的變化不同，有時(shí)很難準(zhǔn)確檢測(cè)到凋亡細(xì)胞。但將光散射參數(shù)與熒光標(biāo)記的抗體或熒光染料結(jié)合起來檢測(cè)細(xì)胞凋亡，可以克服單純的光散射參數(shù)的缺點(diǎn)。,流式細(xì)胞分析細(xì)胞凋亡,細(xì)胞對(duì)染料吸收能力的檢測(cè) 凋亡細(xì)胞的一個(gè)重要特點(diǎn)是很長(zhǎng)一段時(shí)間里細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)未受影響，其主要表現(xiàn)為：維持膜的基本功能，如離子和大分子的屏蔽作用和具有功能的通道泵。,流式細(xì)胞分析細(xì)胞凋亡,細(xì)胞對(duì)染料吸收能力的檢測(cè) 根據(jù)不同功能狀態(tài)下的細(xì)胞對(duì)染料的吸收或排斥作用不同，可用流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)活細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞的百分比。,流式細(xì)胞分析細(xì)胞凋亡,細(xì)胞對(duì)染料吸收能力的檢測(cè) 處于早/中期的凋亡細(xì)胞，仍然保持著完整的質(zhì)膜及其基本功能，阻礙大分子物質(zhì)及離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。而晚期凋亡細(xì)胞或壞死細(xì)胞，其質(zhì)膜完整性受到破壞，使某些大分子物質(zhì)及離子可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。因此，根據(jù)對(duì)DNA染料通透性的不同，可區(qū)分處于不同階段的細(xì)胞。,流式細(xì)胞分析細(xì)胞凋亡,細(xì)胞對(duì)染料吸收能力的檢測(cè) PI和EB均屬于插入性熒光染料，可選擇性的定量嵌入核酸雙螺旋的堿基之間，其熒光發(fā)射均為橙紅色，如果使用氬離子激光488nm激發(fā)，PI的發(fā)射光譜波長(zhǎng)在610-620nm范圍，EB的發(fā)射光譜波長(zhǎng)在603-610nm之間，二者可互相替代，但EB毒性較大。,流式細(xì)胞分析細(xì)胞凋亡,細(xì)胞對(duì)染料吸收能力的檢測(cè) 7-氨基-放線菌素D（7-AAD）主要以插入方式與DNA鏈的G-C堿基對(duì)結(jié)合，其激發(fā)波長(zhǎng)約為580nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為660nm，由于其發(fā)射波長(zhǎng)較大，可與藻紅蛋白（PE）結(jié)合，通過單一光譜488nm的激光光源激發(fā)，可以進(jìn)行定量DNA和免疫熒光的雙參數(shù)分析。,流式細(xì)胞分析細(xì)胞凋亡,細(xì)胞對(duì)染料吸收能力的檢測(cè) 由于EB、PI和7-AAD不能進(jìn)入具有完整細(xì)胞膜的活細(xì)胞中，即正常細(xì)胞和凋亡細(xì)胞在未固定時(shí)對(duì)這些染料是拒染的，而壞死細(xì)胞胞膜完整性已破壞，可被染色。因此，這些染料可被用來鑒別死細(xì)胞和活細(xì)胞。,流式細(xì)胞分析細(xì)胞凋亡,細(xì)胞對(duì)染料吸收能力的檢測(cè) 赫斯特類染料（特別是HO33342)檢測(cè)細(xì)胞凋亡的原理與上述染料不同。HO33342是雙苯并咪唑家族成員之一，能特異與DNA螺旋中富含A-T重復(fù)序列結(jié)合。HO33342用氪激光激發(fā)紫外線熒光，激發(fā)光波長(zhǎng)為352nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為400-500nm，產(chǎn)生藍(lán)色熒光。,流式細(xì)胞分析細(xì)胞凋亡,細(xì)胞對(duì)染料吸收能力的檢測(cè) HO33342能被活細(xì)胞攝取，而其從細(xì)胞內(nèi)排出是一個(gè)耗能的主動(dòng)過程，依賴細(xì)胞膜上的P-糖蛋白泵?；罴?xì)胞染色時(shí)，應(yīng)考慮是否存在細(xì)胞抗藥性問題，如有耐藥性，則染色效果不佳。HO33342進(jìn)入凋亡細(xì)胞比正常細(xì)胞多，將其與PI結(jié)合對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行雙染，可將正常細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞區(qū)分開來。,流式細(xì)胞分析細(xì)胞凋亡,細(xì)胞對(duì)染料吸收能力的檢測(cè) 在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上，這三群細(xì)胞表現(xiàn)為：正常細(xì)胞低藍(lán)光/低紅光，凋亡細(xì)胞為高藍(lán)光/低紅光，壞死細(xì)胞為低藍(lán)光/高紅光。,流式細(xì)胞分析細(xì)胞凋亡,caspase的流式細(xì)胞儀檢測(cè) caspase家族在細(xì)胞凋亡過程中起著重要作用，通過caspase對(duì)大分子結(jié)構(gòu)的瀑布級(jí)聯(lián)水解反應(yīng)，導(dǎo)致凋亡發(fā)生。其中caspase-3是最重要的指示蛋白酶，活化的caspase-3可以蛋白水解切割和激活其他的caspase、相關(guān)胞質(zhì)的靶位點(diǎn)（CK18）等。Caspase-3切割細(xì)胞因子，尤其是CK18，是凋亡過程中caspase切割發(fā)生的早期指示因子。,流式細(xì)胞分析細(xì)胞凋亡,流式細(xì)胞分析細(xì)胞凋亡,caspase的流式細(xì)胞儀檢測(cè) caspase-3的活性在細(xì)胞凋亡發(fā)生前是檢測(cè)不到的，只有在凋亡早期才能檢測(cè)到。隨后在凋亡的過程中持續(xù)升高，在凋亡晚期快速下降。因此，對(duì)caspase-3的連續(xù)檢測(cè)可動(dòng)態(tài)觀察凋亡的整個(gè)過程。,流式細(xì)胞分析細(xì)胞凋亡,線粒體功能的檢測(cè) 線粒體被認(rèn)為是凋亡生化反應(yīng)的基地，因?yàn)樗赡苁菦Q定細(xì)胞存活或死亡的中心。線粒體的一個(gè)重要作用是在外膜形成通透性通道孔（線粒體大通道），允許線粒體內(nèi)的蛋白流入胞質(zhì)。線粒體大通道的開放，導(dǎo)致質(zhì)子在內(nèi)膜兩側(cè)的不對(duì)稱分布被破壞，即線粒體跨膜電位（TMP）被轉(zhuǎn)變。,流式細(xì)胞分析細(xì)胞凋亡,線粒體功能的檢測(cè) TMP的變化是凋亡早期特有的現(xiàn)象。TMP由膜內(nèi)外包括質(zhì)子在內(nèi)的離子形成的。內(nèi)膜內(nèi)面帶負(fù)電，因此帶正電的親脂性熒光素會(huì)集中分布于線粒體基質(zhì)。凋亡早期TMP的變化導(dǎo)致其聚集熒光色素的能力喪失。其發(fā)生要早于DNA斷裂和PS外翻。,流式細(xì)胞分析細(xì)胞凋亡,線粒體功能的檢測(cè) TMP的變化可通過適于流式細(xì)胞儀檢測(cè)的熒光染料來檢測(cè)。多種膜通透性親脂陽離子熒光色素，如羅丹明123（RH123）被用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)TMP的探針。當(dāng)它們與活細(xì)胞一起培養(yǎng)時(shí)，探針被聚集于線粒體，通過測(cè)定細(xì)胞熒光色素的強(qiáng)度及外流來反映TMP的變化。,流式細(xì)胞分析細(xì)胞凋亡,線粒體功能的檢測(cè) 位于線粒體的啟動(dòng)凋亡和抑制凋亡的bcl-2/bax家族蛋白通過形成同源性或異源性二聚體在線粒體跨膜電位的調(diào)控中起重要作用。所有bcl-2家族蛋白都可通過特異性抗體進(jìn)行FCM測(cè)定。,流式細(xì)胞分析細(xì)胞凋亡,線粒體功能的檢測(cè) 線粒體在凋亡時(shí)的變化及與bcl-2家族蛋白之間的相互作用發(fā)生于凋亡早期，影響細(xì)胞對(duì)凋亡的敏感性。bcl-2家族蛋白可能影響抗腫瘤治療的轉(zhuǎn)歸。因此，流式細(xì)胞儀檢測(cè)這些變化，在腫瘤學(xué)上具有一定意義。,流式細(xì)胞分析細(xì)胞凋亡,細(xì)胞內(nèi)Ca2+的檢測(cè) 細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，其胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度升高，pH調(diào)節(jié)能力喪失，導(dǎo)致細(xì)胞磷酸化。目前有許多檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的方法，但通過流式細(xì)胞儀采用Ca2+選擇性的熒光探針（Flu-3）檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度仍是最佳方法。,流式細(xì)胞分析細(xì)胞凋亡,細(xì)胞DNA含量的檢測(cè) 使用PI熒光染料通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞DNA含量測(cè)定，會(huì)出現(xiàn)一亞二倍體細(xì)胞峰（sub-population),為DNA低染色的細(xì)胞群，其峰值低于正常G0/G1區(qū)域。DNA染色能力降低主要是由于內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶激活及低分子量DNA流失。,流式細(xì)胞分析細(xì)胞凋亡,細(xì)胞DNA含量的檢測(cè) 用于檢測(cè)DNA含量的特異性熒光染料包括PI、EB、7-AAD、HO33342、DAPI等。凋亡細(xì)胞DNA信號(hào)代表核基質(zhì)上黏附著剩余核小體，交聯(lián)固定劑如甲醛能阻止凋亡細(xì)胞DNA外漏，因此不應(yīng)使用。,流式細(xì)胞分析細(xì)胞凋亡,細(xì)胞DNA含量的檢測(cè) DNA特異性熒光染料可與其他熒光單克隆抗體同時(shí)應(yīng)用，而且可通過使用溫和的乙醇固定方法同時(shí)進(jìn)行DNA和免疫表型分析，雖然不是很特異，但快速、操作簡(jiǎn)單。,流式細(xì)胞分析細(xì)胞凋亡,蛋白含量的檢測(cè) 凋亡細(xì)胞蛋白含量也會(huì)下降，其與DNA含量減少同時(shí)發(fā)生。凋亡過程中的蛋白水解是DNA降解所必需的。細(xì)胞蛋白的濃度可用不同的酸性染料如異硫氰酸熒光素（FITC）測(cè)定，它主要與氨基基團(tuán)結(jié)合，很少與碳水化合物及脂質(zhì)反應(yīng)。,流式細(xì)胞分析細(xì)胞凋亡,膜磷脂重分布的檢測(cè) 細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化較早，主要表現(xiàn)為細(xì)胞膜內(nèi)外不同的磷脂基團(tuán)重分布。在正常活細(xì)胞狀態(tài)下，細(xì)胞膜維持兩側(cè)的磷脂不對(duì)稱分布，細(xì)胞外膜PS完全缺如。這一穩(wěn)定狀態(tài)主要是由于細(xì)胞主動(dòng)把外膜PS轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)膜。,流式細(xì)胞分析細(xì)胞凋亡,膜磷脂重分布的檢測(cè) 在特定條件下，細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，這一不對(duì)稱性被破壞，導(dǎo)致外膜持續(xù)出現(xiàn)PS。這一過程首先在受體激活的血小板和老化的紅細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)。在受體激活或衰老時(shí)，細(xì)胞膜上PS轉(zhuǎn)運(yùn)活性受抑，使PS出現(xiàn)在血小板和紅細(xì)胞外膜上。,流式細(xì)胞分析細(xì)胞凋亡,膜磷脂重分布的檢測(cè) Fadok等首先提出有核細(xì)胞凋亡時(shí)有PS外翻，與血小板和紅細(xì)胞有相似之處。Fadok等的發(fā)現(xiàn)引發(fā)了凋亡中Annexin 作用的研究，這主要是由于在Ca2+存在時(shí)，Annexin 特異性的結(jié)合磷脂膜上的PS。因此， Annexin 能用于區(qū)別PS暴露和未暴露的血細(xì)胞和其他有核細(xì)胞。,流式細(xì)胞分析細(xì)胞凋亡,膜磷脂重分布的檢測(cè) 由于Annexin 具有區(qū)別凋亡及壞死細(xì)胞的能力，使用結(jié)合FITC的Annexin 和PI，能區(qū)分活細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和繼發(fā)壞死細(xì)胞。PS外翻是絕大多數(shù)細(xì)胞發(fā)生凋亡的特異現(xiàn)象，而且不依賴于刺激因子。,流式細(xì)胞分析細(xì)胞凋亡,膜磷脂重分布的檢測(cè) Annexin -FITC與PS外翻的細(xì)胞迅速結(jié)合，無需長(zhǎng)時(shí)間孵育和洗滌就可以用流式細(xì)胞儀分析?；罴?xì)胞不被Annexin 和PI染色，膜未受損害凋亡細(xì)胞僅被Annexin 染色，繼發(fā)的壞死細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞被Annexin 和PI雙染色。,流式細(xì)胞分析細(xì)胞凋亡,凋亡相關(guān)蛋白的檢測(cè) 在細(xì)胞凋亡的研究中，要重視對(duì)凋亡相關(guān)蛋白的檢測(cè)，它們?cè)谔囟ǖ男盘?hào)傳導(dǎo)通路中與啟動(dòng)凋亡的信號(hào)分子相互作用。從凋亡的開始到結(jié)束，許多信號(hào)傳導(dǎo)通路都需要或受到特定的蛋白間相互作用的調(diào)控。,流式細(xì)胞分析細(xì)胞凋亡,凋亡相關(guān)蛋白的檢測(cè) 我們現(xiàn)在所認(rèn)識(shí)的P53、bcl-2、Fas等調(diào)控凋亡的基因蛋白，均有相應(yīng)的商品化單克隆抗體產(chǎn)品，從而可以應(yīng)用FCM快速、方便的檢測(cè)，這也是目前流行的凋亡檢測(cè)方法。,流式細(xì)胞分析細(xì)胞凋亡,常用的細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法 隨著FCM的發(fā)展和越來越多的熒光探針的出現(xiàn)，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞已成為細(xì)胞凋亡研究的常用方法。該方法可充分發(fā)揮FCM快速、靈敏、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，在完整細(xì)胞的基礎(chǔ)上，直接分析DNA含量的變化，并可同時(shí)對(duì)細(xì)胞表型和調(diào)控蛋白進(jìn)行測(cè)定。,流式細(xì)胞分析細(xì)胞凋亡,常用的細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法 1 PI單染色法 PI染液的配置（100ml）：PI5mg、RNase 2mg、1Triton X-100、生理鹽水65ml、枸櫞酸鈉100mg，加蒸餾水至100ml，調(diào)pH至7.2-7.6,用棕色瓶分裝，4避光保存。,流式細(xì)胞分析細(xì)胞凋亡,常用的細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法 1 PI單染色法 制備單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)細(xì)胞，細(xì)胞為1106個(gè)。假如適量生理鹽水，1000rpm，離心5min，去上清，加入預(yù)冷的70乙醇，4過夜。,流式細(xì)胞分析細(xì)胞凋亡,常用的細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法 1 PI單染色法 離心除去固定液，適量生理鹽水重懸細(xì)胞，采用篩網(wǎng)過濾一次，離心棄去上清，加入1mlPI染液，4避光孵育30min。,流式細(xì)胞分析細(xì)胞凋亡,常用的細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法 1 PI單染色法 PI用488nm的氬離子激光器激發(fā)，由630nm的帶通濾光片接收，通過FSC/SSC散點(diǎn)圖收集10000個(gè)細(xì)胞，采用設(shè)門技術(shù)排除粘連細(xì)胞和細(xì)胞碎片，分析PI熒光直方圖上細(xì)胞各周期的百分率和凋亡細(xì)胞百分率。,流式細(xì)胞分析細(xì)胞凋亡,常用的細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法 1 PI單染色法 在FSC/SSC散點(diǎn)圖上凋亡細(xì)胞與正常細(xì)胞相比，F(xiàn)SC較小。在PI熒光直方圖上，凋亡細(xì)胞在G0/G1期前出現(xiàn)一亞二倍體峰。采用雞紅細(xì)胞作為內(nèi)參對(duì)照，參入量為單細(xì)胞懸液的10，雞紅細(xì)胞的PI熒光強(qiáng)度為正常二倍體細(xì)胞的35。,流式細(xì)胞分析細(xì)胞凋亡,常用的細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法 1 PI單染色法,流式細(xì)胞分析細(xì)胞凋亡,常用的細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法 1 PI單染色法 注意事項(xiàng)：?jiǎn)渭?xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)量要充足，過少的細(xì)胞數(shù)會(huì)影響PI直方圖上各時(shí)相的變異系數(shù)（CV），當(dāng)G0/G1期的CV10時(shí)，結(jié)果的可信度下降。,流式細(xì)胞分析細(xì)胞凋亡,常用的細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法 1 PI單染色法 注意事項(xiàng)：70的乙醇固定效果最佳，甲醛或多聚甲醛均會(huì)影響亞二倍體的出現(xiàn)。 4或-20固定效果比37好。 固定過程中要充分混勻細(xì)胞，避免細(xì)胞團(tuán)塊形成。,流式細(xì)胞分析細(xì)胞凋亡,常用的細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法 1 PI單染色法 PI單染色法的最大優(yōu)點(diǎn)在于獲得凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的同時(shí)，可以與細(xì)胞周期中其他時(shí)相的細(xì)胞進(jìn)行比較。方法簡(jiǎn)便、標(biāo)本制備容易，檢測(cè)費(fèi)用低，是目前最經(jīng)典也是最常用的細(xì)胞凋亡