一種枯草芽孢桿菌食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建.doc

精品論文推薦一種枯草芽孢桿菌食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建曾伶俐, 夏雨, 趙建新，田豐偉，陳衛(wèi)，張灝*江南大學(xué) 食品學(xué)院 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫 214122e-mail: 摘 要：枯草芽孢桿菌（bacillus subtilis）是一個(gè)對(duì)人畜安全的菌種，通常被認(rèn) 為是食品發(fā)酵和酶生產(chǎn)菌種的良好選擇。本文采用枯草芽孢桿菌的丙氨酸消旋 酶基因dal構(gòu)建了一種枯草芽孢桿菌食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)，其中dal基因作為同源重組 序列以及高效的重組菌篩選標(biāo)記。采用來(lái)自于嗜熱脂肪芽孢桿菌（ bacillus stearothermophilus）的耐熱-半乳糖苷酶（bgab）作為報(bào)告蛋白質(zhì)試驗(yàn)了所構(gòu) 建表達(dá)系統(tǒng)的實(shí)用性。遺傳穩(wěn)定性研究顯示，重組片段穩(wěn)定且不容易丟失，耐 熱-半乳糖苷酶在這一體系中成功地實(shí)現(xiàn)了表達(dá)。關(guān)鍵詞: 枯草芽孢桿菌；食品級(jí)；表達(dá)系統(tǒng)中圖分類號(hào)：q7861 引言生物工程微生物及它們的產(chǎn)品在食品工業(yè)中應(yīng)用的安全性越來(lái)越受到人們的關(guān)注。不論生物工程 菌以活菌方式還是以其純化產(chǎn)物的方式被消費(fèi)，它們都必須是安全的，特性清楚的，同時(shí)是穩(wěn)定的1。 枯草芽孢桿菌（bacillus subtilis）擁有悠久的酶生產(chǎn)和食品發(fā)酵歷史，因而它是一種一般公認(rèn)安全（gras）微生物2,3。然而，很少有關(guān)于重組菌株直接用于食品加工的論文報(bào)道。一個(gè)重要的原因 在于在這些系統(tǒng)中使用的載體都不是食品級(jí)（food-grade）的。本文闡述了一種枯草芽孢桿菌食品級(jí) 表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建過(guò)程。根據(jù)歐洲現(xiàn)行的用于乳酸菌食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)，本文構(gòu)建所涉及的 所有元件均來(lái)源于食品級(jí)微生物，且整個(gè)體系中不含抗生素抗性基因。來(lái)自于嗜熱脂肪芽孢桿菌的 耐熱-半乳糖苷酶可以在高溫下水解乳糖，在食品工業(yè)中具有潛在應(yīng)用價(jià)值，其在本研究中被用作 食品級(jí)報(bào)告蛋白，以檢測(cè)重組基因是否能在該體系中正確表達(dá)。這一重組體系中所涉及的元件全部 來(lái)自食品級(jí)菌株，故該表達(dá)體系也是食品級(jí)的。2 材料與方法2.1 實(shí)驗(yàn)材料本實(shí)驗(yàn)所用菌株和質(zhì)粒見(jiàn)表 1。大腸桿菌 jm109 用于大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒的擴(kuò)增。 bacillus subtilis 168 株作為 dal 基因的供體菌。攜帶了丙氨酸消旋酶突變基因 dal-1 的枯草芽孢桿菌 qb9284作為 d-丙氨酸缺陷型菌株用于載體的整合。大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒 py020 由本實(shí) 驗(yàn)室構(gòu)建，它由來(lái)源于質(zhì)粒 pub110、puc18 和枯草芽孢桿菌內(nèi)源啟動(dòng)子 p435的片段組成，在本實(shí) 驗(yàn)中用于 bgab 表達(dá)單元的構(gòu)建。本課題得到國(guó)家自然科學(xué)基金（30670065）、863 項(xiàng)目（2006aa10z318）、教育部博士點(diǎn)基金（20050295003） 資助。-8-表 1 本研究采用的菌株和質(zhì)粒菌株/質(zhì)粒 特性描述 來(lái)源大腸桿菌jm109 reca supe44 enda1 hsdr17 gyra96rela1thi(lac-proab) ftrad36 proab laciqlaczm15本研究室嗜熱脂肪芽孢桿菌 iam11001 本研究室枯草芽孢桿菌168 trpc2 bgscaqb928 aroi906 dal-1 pure1 trpc2 bgsc qb928-bgabaroi906 pure1 trpc2 bgab 本研究 質(zhì)粒pgem-t 用于 e. coli 中亞克隆的 t-載體( bla lacz ori ori-f1 ) promega py020含 p43 啟動(dòng)子的 e. coli-b. subtilis 穿梭載體 本研究室 pxy2由質(zhì)粒 pgem-t 和 dal 表達(dá)單元所構(gòu)建的重組載體 本研究 py020-bgab 由 bgab 片段和質(zhì)粒 py020 構(gòu)建的表達(dá)載體 本研究a bgsc：bacillus genetic stock center2.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件大腸桿菌（escherichia coli）宿主和重組 b. subtilis 菌株采用 luria-bertani（lb）液體或 lb 瓊脂 固體培養(yǎng)基培養(yǎng)。重組 e. coli 在添加氨芐青霉素（50g/ml）的 lb 瓊脂平板上篩選。d-丙氨酸缺陷 型 b. subtilis 菌株 qb928 在添加 50-200g/ml d-丙氨酸的 lb 液體培養(yǎng)基或 200g/ml d-丙氨酸的 lb 瓊脂平板上培養(yǎng)。2.3 遺傳操作e. coli 中的操作參照文獻(xiàn)6，b. subtilis 感受態(tài)細(xì)胞的制備、轉(zhuǎn)化及基因組提取方法參考文獻(xiàn)7進(jìn) 行。2.4 野生型 b. subtilis dal 表達(dá)單元的克隆b. subtilis 的 dal 基因編碼丙氨酸消旋酶，全長(zhǎng) 1170 bp，位于染色體上第 516929 bp 至 518098 bp 區(qū)域8。為得到完整的丙氨酸消旋酶基因表達(dá)單元，dal 結(jié)構(gòu)基因及其上游組成型啟動(dòng)子以 pcr 的方 法 從 枯草 芽孢 桿菌 168 株中擴(kuò)增出來(lái)， 擴(kuò) 增 引 物 為 5-gtagattaccttctctcttc-3 和5-catccagtgataatgatacc-3 ，引物中沒(méi)有引入限制性酶切位點(diǎn)。擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入載體 pgem-t，得到的重組質(zhì)粒命名為 pxy2。該重組質(zhì)粒以上述引物進(jìn)行 pcr 驗(yàn)證，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌 jm109 進(jìn)行擴(kuò)增。1 2 3 4 5 62 kb1.4 kb圖 1 dal 表達(dá)單元和 bgab 基因的 pcr 擴(kuò)增泳道 1：從 168 株染色體擴(kuò)增的 dal 片段; 泳道 2：從 pxy2 擴(kuò)增的 dal 片 段，作為重組驗(yàn)證; 泳道 3, mbi dna 分子量標(biāo)準(zhǔn); 泳道 4：從 iam11001 染色體擴(kuò)增的 bgab 片段; 泳道 5：從 qb928-bgab 轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增的 bgab 片 段，作為整合驗(yàn)證；泳道 6：從傳 100 代后 qb928-bgab 菌株擴(kuò)增的 bgab 片 段，作為穩(wěn)定性驗(yàn)證。2.5 bgab 表達(dá)單元的構(gòu)建耐熱 - 半 乳糖苷酶 的基因 bgab 全長(zhǎng) 2 kb ， 分 子量約 為 70 kda10 。采 用引物 5-aattggtaccatgaatgtgttatcctcaa-3和 5-aattggatccattatgttgccaactgtcg-3以 pcr 方法將其從非病原性、不產(chǎn)毒素的菌株 bacillus stearothermophilus iam11001 染色體上 擴(kuò)增出來(lái)。擴(kuò)增產(chǎn)物兩端分別引入 kpni 和 bamhi 酶切位點(diǎn)。擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖 1 所示。之后用限制性 內(nèi)切酶 kpni 和 bamhi 消化該片段，并連接到用同樣酶切的質(zhì)粒 py020 中，得到的重組質(zhì)粒命名為 py020-bgab（見(jiàn)圖 2）。在這個(gè)載體中，bgab 基因融合到啟動(dòng)子 p43 下游。2.6 dal 表達(dá)單元和 bgab 表達(dá)單元在宿主染色體中的整合將 dal 表達(dá)單元用限制性內(nèi)切酶 bglii 和 ecori 從質(zhì)粒 pxy2 上切割下來(lái)；同時(shí)將完整的 bgab 表 達(dá)單元從重組穿梭質(zhì)粒 py020-bgab 上用 ecori 和 bamhi 切割下來(lái)。將兩片段進(jìn)行連接得到載體 dal-bgab，該載體在枯草桿菌宿主中不能復(fù)制。按 harwood 的轉(zhuǎn)化方法將其轉(zhuǎn)化宿主 qb928 產(chǎn)生整 合菌株 qb928-bgab（見(jiàn)圖 2）。在不添加 d-丙氨酸的 lb 平板上挑選轉(zhuǎn)化子。精品論文推薦圖 2 食品級(jí)重組菌 qb928-bgab 的構(gòu)建2.7 重組菌株穩(wěn)定性的檢測(cè)重組菌株穩(wěn)定性研究根據(jù)文獻(xiàn)9的方法進(jìn)行。將新分離的 qb928-bgab 菌株接種到 50 ml 含 d-丙 氨酸（200g/ml）的 lb 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)（無(wú)選擇壓力）。37搖床培養(yǎng) 24 小時(shí)以后，取培養(yǎng)液 稀釋到合適濃度涂布含 d-丙氨酸（200g/ml）的 lb 平板。置 37過(guò)夜培養(yǎng)后，挑取 100 個(gè)單菌落 相應(yīng)接種于兩塊 lb 平板上，一塊含有 200g/ml 的 d-丙氨酸，另一塊不含 d-丙氨酸。在 37過(guò)夜 培養(yǎng)后，比較兩塊平板上的菌落數(shù)，在無(wú)選擇壓力的條件下，分析并計(jì)算傳 20 代后基因的穩(wěn)定性。2.8 耐熱-半乳糖酶的酶活力檢測(cè)重組菌 qb928-bgab 采用超聲波法破碎細(xì)胞。然后將破胞液于 7155 g 離心 30 min 去除細(xì)胞碎片。 qb928-bgab 耐熱-半乳糖苷酶（bgab）酶活測(cè)定按照 gist 和 brocades10的方法進(jìn)行，按照 hirata 所述11，本實(shí)驗(yàn)中酶反應(yīng)的溫度調(diào)整到 55。一個(gè) bgab 酶活單位定義為每分鐘水解 1mol 底物所 需的酶量。蛋白質(zhì)總濃度的測(cè)定按 lowery12的方法進(jìn)行。bgab 的比酶活力以 u/g 蛋白表示。 sds-page 酶活力分析按 ausubel13方法進(jìn)行。3 結(jié)果和分析3.1 食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建 食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)中不能含有抗生素抗性基因，因而必須為重組枯草芽孢桿菌選擇食品級(jí)的重組子篩選標(biāo)記。本文選擇了丙氨酸消旋酶基因 dal 作為互補(bǔ)選擇標(biāo)記基因。丙氨酸消旋酶在大多數(shù)細(xì)菌合成細(xì)胞壁的過(guò)程中是必需的14。缺乏生物合成 d-丙氨酸能力的枯草芽孢桿菌宿主無(wú)法在沒(méi)有提供適 當(dāng)濃度 d-丙氨酸的 lb 培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，這一特性正好可以作為篩選重組菌株強(qiáng)有力的選擇壓力。在本研究工作中，將構(gòu)建的 dal-bgab 載體整合到宿主染色體上，從而構(gòu)建了食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)。轉(zhuǎn) 化該載體之后，dal 表達(dá)單元通過(guò)載體上的 dal 同源區(qū)域與染色體上的 dal-1 區(qū)域發(fā)生單交換同源重 組（single-crossover recombination）而整合到染色體上，使得營(yíng)養(yǎng)缺陷型宿主又重新獲得了正常的 d-丙氨酸生物合成能力（圖 2）。這些轉(zhuǎn)化子是 d-丙氨酸原養(yǎng)型并可以在不添加 d-丙氨酸的 lb 培養(yǎng) 基中正常生長(zhǎng)；而未發(fā)生染色體整合的細(xì)胞則會(huì)死亡。在此，dal 基因不僅作為整合同源區(qū)域，還是 有效的互補(bǔ)選擇標(biāo)記。該整合同時(shí)使得完整的 bgab 表達(dá)單元插入到宿主染色體上。整合載體轉(zhuǎn)化宿主菌株 168 后，有可能發(fā)生雙交換同源重組（double-crossover recombination）， 此重組方式會(huì)使得 dal 片段整合到宿主染色體上而丟失外源序列 bgab。為了消除雙交換同源重組產(chǎn) 生的干擾，挑選了部分轉(zhuǎn)化子抽提基因組作為模板，以 bgab 基因的特異性引物進(jìn)行 pcr 驗(yàn)證。該 實(shí)驗(yàn)原理是基于在 lb 平板上生長(zhǎng)的所有轉(zhuǎn)化子可能是通過(guò)單交換或雙交換的方式整合到宿主染色 體上，而 bgab 表達(dá)單元只有通過(guò)單交換同源重組才能整合到宿主染色體上，結(jié)果見(jiàn)圖 2。結(jié)果大多 數(shù)的 pcr 呈陽(yáng)性（數(shù)據(jù)未顯示），得到的 bgab 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為 2 kb 左右（見(jiàn)圖 1），反應(yīng)了這些轉(zhuǎn) 化子發(fā)生了單交換同源重組，且 bgab 表達(dá)單元已經(jīng)成功地整合到了宿主染色體上。挑選正確的陽(yáng)性 轉(zhuǎn)化子進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。3.2 重組菌株的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)和生長(zhǎng)曲線的測(cè)定為了評(píng)價(jià)重組菌株的穩(wěn)定性，對(duì) qb928-bgab 在無(wú)選擇壓力的培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng) 20，60，100 代并進(jìn)行穩(wěn)定性檢測(cè)。在培養(yǎng)的 20，60 和 100 代各測(cè)三個(gè)樣本，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析，結(jié)果見(jiàn)表 2。 將培養(yǎng) 100 代的培養(yǎng)物進(jìn)行染色體提取，以 bgab 基因的特異性引物進(jìn)行 pcr 驗(yàn)證，所有的 pcr 檢 驗(yàn)均呈陽(yáng)性（見(jiàn)圖 1），表明插入片段 bgab 是穩(wěn)定存在的。綜合上述結(jié)果表明該整合系統(tǒng)是穩(wěn)定的（插入片段不會(huì)輕易從染色體環(huán)出丟失），同時(shí) dal 基因是一個(gè)有效的選擇標(biāo)記。表 2 重組菌株 qb928-bgab 的遺傳穩(wěn)定性傳代數(shù)lb+d-alanine (200g/ml)平板上菌落數(shù)lb 平板上菌落數(shù)穩(wěn)定性20100100100%60100100100%1001009898%將重組菌株 qb928-bgab 和宿主菌株 qb928 置于 37培養(yǎng)，并在 600 nm 下測(cè)定其生長(zhǎng)。前者 的生長(zhǎng)曲線與后者的相似（見(jiàn)圖 3）?？偟膩?lái)說(shuō)，重組菌株的生長(zhǎng)速度和宿主是同步的。培養(yǎng) 13 小時(shí) 以后，兩個(gè)菌株均達(dá)到了指數(shù)生長(zhǎng)末期。精品論文推薦3.02.52.0a6001.51.00.50.0qb928qb928-bgab02 4 68 10 12 14 16 18 20 22 24time / hours圖 3 b. subtilis qb928 和 qb928-bgab 在 lb 培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線67 kda1 2 3 4圖 4 蛋白質(zhì)表達(dá)的 sds-page 分析泳道 1：iam11001 無(wú)細(xì)胞提取液（陽(yáng)性對(duì)照）；泳道 2：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道 3：qb928-bgab 無(wú)細(xì)胞提取液；泳道 4：qb928 無(wú)細(xì)胞提取液（陰性對(duì)照）3.3 耐熱-半乳糖苷酶的表達(dá)和酶活力檢測(cè)在重組菌 qb928-bgab 中，bgab 基因處于 p43 啟動(dòng)子的控制之下，使得其在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和平穩(wěn) 期都進(jìn)行了表達(dá)。分別在培養(yǎng)的 8，14，20 小時(shí)進(jìn)行取樣，超聲波破碎菌體。上清液在 55水浴中 進(jìn)行了酶活檢測(cè)。重組菌 qb928-bgab 在 14 h 時(shí)的酶活高于 8 和 20 h 時(shí)的酶活（見(jiàn)表 3）。這一值接 近于基因供體菌 iam11001。作為對(duì)照，還測(cè)定了菌株 qb928 和 iam11001 在培養(yǎng)到 14 h 時(shí)的酶活（見(jiàn)表 3）。表 3 耐熱-半乳糖苷酶的比酶活力（u/mg）培養(yǎng)時(shí)間qb928-bgabiam11001qb9288 h0.05214 h0.1610.1400.06020 h0.135對(duì) qb928-bgab，qb928 和 iam11001 菌株的細(xì)胞破碎上清液進(jìn)行了 sds-page 電泳檢測(cè)，結(jié)果 見(jiàn)圖 4。盡管 bgab 的理論分子量為 78 kda，但 qb928-bgab 菌株表達(dá)的 bgab 卻在 70 kda 處顯示了 條帶，iam11001 菌株的表達(dá)條帶也同樣如此。該結(jié)果與已報(bào)道的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是相符合的。4 結(jié)論本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)將 dal 表達(dá)單元和外源的 bgab 表達(dá)單元整合入宿主染色體中構(gòu)建了食品級(jí)重組 枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)證實(shí) dal 基因不僅可以取代抗生素抗性基因作為一種有效的選擇標(biāo)記， 同時(shí)該基因還是單交換整合的同源區(qū)。構(gòu)建該系統(tǒng)的所有序列均已知且來(lái)源于食品級(jí)細(xì)菌，因此該 系統(tǒng)也是食品級(jí)的。它可以直接適用于食品工業(yè)中酶的表達(dá)以及發(fā)酵食品的生產(chǎn)。該系統(tǒng)遺傳穩(wěn)定 好，外源基因不會(huì)輕易從染色體上環(huán)出丟失。盡管耐熱-半乳糖苷酶的表達(dá)量較低，但今后通過(guò)使 用強(qiáng)啟動(dòng)子、在目標(biāo)基因上游引入分泌信號(hào)等手段也許可以提高外源蛋白質(zhì)的表達(dá)量。對(duì)于工業(yè)應(yīng) 用，d-丙氨酸缺陷菌株可以通過(guò)雙交換同源重組的方法敲除染色體上的 dal 基因來(lái)獲得。該研究工作 為開發(fā)其它食品級(jí)的多拷貝可復(fù)制質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)建立了一個(gè)模式。這類系統(tǒng)在發(fā)酵食品的生產(chǎn)和過(guò) 量表達(dá)有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的代謝物應(yīng)用中具有很大的潛力。參考文獻(xiàn)1 rowlands, j.c. 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