DCC和netrin在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中的.doc

精品論文dcc 和 netrin 在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中的表達分析高景霞，張長穩(wěn)，張翠珍，彭剛5（復旦大學腦科學研究院，上海 200032） 摘要：本文用全胚胎原位雜交的方法研究了 dcc 和 netrin 這對軸突導向因子受體及其配體 在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中的表達情況。結果顯示：dcc 在斑馬魚前腦背側神經(jīng)元有豐富而 集中的表達，而 netrin 在前腦腹側中線有很強的表達。提示斑馬魚高表達 dcc 前腦背側神 經(jīng)元受到前腦腹側中線 netrin 的作用實現(xiàn)向腹側的軸突投射。10關鍵詞：dcc；netrin；斑馬魚中圖分類號：q189the expression pattern of dcc and netrin in the embryonic zebrafish15gao jingxia, zhang changwen, zhang cuizhen, peng gang(institute of brain sciences, fudan university, shanghai 200032)abstract: the current research focuses on the expression pattern of dcc and netrin in the embryonic zebrafish using whole mount in situ hybridization. dcc and netrin are one of the guidance receptors and ligands. the results showed that dcc are highly expressed in the anterior20dorsal neurons in embryonic zebrafish, and netrins are highly expressed in the ventral midline.these results suggest that the axons of the anterior dorsal neurons which express dcc project ventrally guided by the ventral expressed netrins.keywords: dcc; netrin; zebrafish250引言在脊椎動物胚胎發(fā)育研究中，神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育尤其是腦部的形成是最為研究者所關注的 領域之一。斑馬魚因其具有生長繁殖快、體外受精、胚胎透明和個體小易養(yǎng)殖等諸多特點， 逐漸為越來越多的研究者所采用，已成為脊椎動物發(fā)育生物學研究的理想模型動物之一1。 在斑馬魚前腦，胚胎早期發(fā)育生成的神經(jīng)元的軸突形成高度固定及保守的神經(jīng)束并向不同的30腦區(qū)投射。這些神經(jīng)束是腦中復雜的神經(jīng)回路形成的基礎2。這些神經(jīng)元的軸突投射受到周 圍環(huán)境中的化學信號分子以及神經(jīng)元所表達的受體的吸引或者排斥作用，從而形成正常的軸 突投射3。這些化學信號分子表達異?；蛘呤荏w表達異常都會導致錯誤的軸突投射，從而導 致神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙。dcc (deleted in colorectal carcinoma)和 netrin 便是眾多的軸突導向因 子受體和配體的其中一對。為了研究斑馬魚前腦神經(jīng)元的正常投射，我們研究了斑馬魚野生35型胚胎中在不同發(fā)育時期 dcc 和 netrin 的表達。1材料和方法1.1 材料實驗中所用到的野生型斑馬魚為 ab 品系。按照斑馬魚飼養(yǎng)的標準步驟4。在循環(huán)水系 統(tǒng)中飼養(yǎng)。循環(huán)水用人工海水鹽調(diào)整鹽度至 500uf，用 nahco3 調(diào)整 ph 值至 7.2。將成年基金項目：國家自然科學基金（30900861）， 教育部博士點基金（20090071120098）作者簡介：高景霞，（1974-），女，助理研究員， 神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育。e-mail: - 5 -40斑馬魚交配獲得胚胎，在胚胎培養(yǎng)液中，28.5培養(yǎng)到所需發(fā)育時期。斑馬魚胚胎的發(fā)育時期用受精后的小時數(shù)5來界定。1.2 方法1.2.1dcc、 netrin1a 和 netrin1b 探針的制備實驗中用到的探針克隆是： dcc6, netrin1a（accession number: bc114259），netrin1b45（accession number: ck684895）。探針克隆經(jīng)測序正確后體外合成帶有地高辛標記的反義rna。用 licl 沉淀法對獲得的反義 rna 探針進行純化。1.2.2全胚胎原位雜交在所需的發(fā)育時期收集斑馬魚胚胎，用新鮮配制的 4%多聚甲醛固定胚胎，室溫固定 2小時，4固定過夜。用蛋白酶 k 消化胚胎后，在未加探針的雜交液中預雜交 2 小時，再加50入反義 rna 探針，65雜交過夜。第二天，用 65 ssc 洗滌胚胎，將胚胎洗至 pbst。 用封閉液封閉，堿性磷酸酶標記的抗地高辛抗體孵育過夜，pbst 洗滌后，用 nbt/bcip 顯 色。雜交結束的胚胎保存于 50%甘油/pbst 中待拍照。2結果和分析2.1 dcc 在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中的表達55斑馬魚胚胎時期的神經(jīng)元經(jīng)過生成、遷移到正確的位置以及長出軸突并形成正確的軸突 投射等過程。斑馬魚前腦背側的神經(jīng)元在胚胎發(fā)育至 20 小時時，遷移至正確的位置，但尚 未形成軸突投射。因此我們關注此后的發(fā)育階段，即神經(jīng)元形成軸突投射的階段。胚胎發(fā)育 至 24 小時時，從側面觀察 dcc 的在前腦背側有很豐富而集中的表達（圖 1a），說明 dcc 對于該時期該部位的神經(jīng)元的軸突投射的正常形成有重要作用。此外，dcc 在下丘腦等其60他腦區(qū)也有表達。從斑馬魚胚胎前側觀察，也看到在斑馬魚前腦背側的豐富而集中的表達（圖1b）。自此以后，dcc 的表達逐漸降低。胚胎發(fā)育到 36 小時時 dcc 的表達局限到更靠近 中線的部位，此時 dcc 在中腦的表達較強（圖 2a 和 b）。自此以后 dcc 的表達在前腦背 側這組神經(jīng)元的表達繼續(xù)降低，到胚胎發(fā)育至 48 小時時，dcc 在該部位的表達已經(jīng)檢測不 到（未顯示）。65圖 1. dcc 在斑馬魚胚胎 24 小時和 36 小時的表達. a. dcc 在斑馬魚胚胎 24hpf 的表達 （側面圖）。b. dcc在斑馬魚胚胎 24hpf 的表達 （正面圖）。c. dcc 在斑馬魚胚胎 36hpf 的表達 （側面圖）。d. dcc 在斑馬 魚胚胎 36hpf 的表達（正面圖）。標尺：側面圖，100m；正面圖，60m。fig. 1 the expression pattern of dcc in embryonic zebrafish in 24 and 36 hpf. a. the expression pattern of dcc70at 24hpf (lateral). b. the expression pattern of dcc at 24hpf (frontal). c. the expression pattern of dcc at 36hpf(lateral). d. the expression pattern of dcc at 36hpf (frontal). scale bar:, lateral, 100m; frontal, 60m.2.2 netrin 在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中的表達netrin 是 dcc 的配體。netrin1 是哺乳動物 netrin1 基因的類似物，在斑馬魚基因組中有75netrin1a 和 netrin1b 兩個重復基因。如圖所示，在斑馬魚胚胎發(fā)育至 24 小時和 36 小時時，netrin1a 和 netrin1b 均表達于前腦腹側中線部位（圖 2a-d）。這提示，在斑馬魚前腦背側24 到 36 小時表達 dcc 的這組神經(jīng)元在腹側中線部位表達的 netrin 的吸引作用下，軸突向 腹側投射。80圖 2. netrin 在斑馬魚胚胎 24 小時和 36 小時的表達。 a. netrin1a 在斑馬魚胚胎 24 小時的表達（側面圖）。b. netrin1a 在斑馬魚胚胎 36 小時的表達（側面圖）。c. netrin1b 在斑馬魚胚胎 24 小時的表達（側面圖）。d. netrin1b 在斑馬魚胚胎 36 小時的表達（側面圖）。標尺：100m。fig. 2 the expression pattern of netrin in embryonic zebrafish in 24 and 36 hpf. a. the expression pattern of netrin1a at 24dpf (lateral). b. the expression pattern of netrin1a at 36dpf (lateral). c. the expression pattern of85netrin1b at 24dpf (lateral). d. the expression pattern of netrin1b at 36dpf (lateral). scale bar: 100m.90951003討論dcc 家族成員在脊椎動物和非脊椎動物的軸突導向中都發(fā)揮很重要的作用。斑馬魚 dcc 基因已經(jīng)被克隆。斑馬魚 dcc 是跨膜受體，屬于免疫球蛋白超家族。細胞外部分包括 四個免疫球蛋白結構域和六個纖粘蛋白(firbronectin-type iii repeats)結構域，一個單次跨膜結 構域，細胞內(nèi)部分包含三個保守結構域（p1、p2 和 p3）。已有報道指出7,dcc 在斑馬魚神 經(jīng)系統(tǒng)（包括脊髓、后腦、頂蓋、視網(wǎng)膜等）高度表達，另外在發(fā)育中的胸鰭、心臟、胰腺 和小腸等部位也有表達。dcc 的功能在體外培養(yǎng)的脊椎動物以及非脊椎動物神經(jīng)元中被廣 泛而細致的研究。 dcc 可以與其配體 netrin 直接結合8。 dcc 與其配體 netrin 結合后可 以發(fā)揮軸突導向的吸引作用，也可以發(fā)揮排斥作用，這取決于神經(jīng)元上 netrin 受體的表達狀 況。如果 dcc 在神經(jīng)元細胞膜上形成同源二聚體，那么 dcc 可以介導軸突導向的吸引作 用。如果 dcc 與 unc-5 形成異源二聚體，那么 dcc 可以介導軸突導向排斥作用9。本研究發(fā)現(xiàn)，在斑馬魚胚胎發(fā)育的早期（受精后 24 和 36 小時），dcc 在斑馬魚前腦 背側有豐富而集中的表達，netrin 在胚胎前腦腹側中線也有很強表達。這就提示斑馬魚前腦 背側這組神經(jīng)元的軸突受到前腦腹側中線表達的 netrin 的作用，與其軸突上高度表達的 netrin105110115120125130受體 dcc 相互作用，實現(xiàn)其軸突的正常投射。如果改變 dcc 的表達或者改變 netrin 的表達可能會導致斑馬魚前腦背側這組神經(jīng)元軸突導向的錯誤，值得進一步深入研究。4結論本文給出了 dcc 和 netrin 在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中的表達情況。dcc 在斑馬魚前腦背 側有集中而豐富的表達，而 netrin1a 和 netrin1b 則在斑馬魚前腦腹側中線部位有很強的表達。 提示表達 dcc 的斑馬魚前腦背側這組神經(jīng)元受到腹側中線分泌的 netrin 的作用，實現(xiàn)正常 的向腹側的軸突投射。參考文獻 (references)1 fekany k, yamanaka y, leung t, sirotkin hi, topczewski j, gates ma, hibi m, renucci a, stemple d, radbill a, schier af, driever w, hirano t, talbot ws, solnica-krezel l. the zebrafish bozozok locus encodes dharma, a homeodomain protein essential for induction of gastrula organizer and dorsoanterior embryonic structuresj. development, 1999; 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