細胞培養(yǎng)中的細節(jié)問題.ppt

細胞培養(yǎng)中的細節(jié)問題,基礎(chǔ)篇-無菌操作基本技術(shù),1. 實驗進行前，無菌室及無菌操作臺(laminar flow) 以紫外燈照射30-60 分鐘滅菌，以70 %ethanol 擦拭無菌操作抬面，并開啟無菌操作臺風扇運轉(zhuǎn)10 分鐘后，才開始實驗操作。每次操作只處理一株細胞株，且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基，以避免失誤混淆或細胞間污染。實驗完畢后，將實驗物品帶出工作臺，以70 % ethanol 擦拭無菌操作抬面。操作間隔應讓無菌操作臺運轉(zhuǎn)10 分鐘以上后，再進行下一個細胞株之操作。 2. 無菌操作工作區(qū)域應保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時放置，其它實驗用品用完即應移出，以利于氣流之流通。實驗用品以70 % ethanol 擦拭后才帶入無菌操作臺內(nèi)。實驗操作應在抬面之中央無菌區(qū)域，勿在邊緣之非無菌區(qū)域操作。 3. 小心取用無菌之實驗物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作實驗。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45 角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。,4. 工作人員應注意自身之安全，須穿戴實驗衣及手套后才進行實驗。對于來自人類或是病毒感染之細胞株應特別小心操作，并選擇適當?shù)燃壷疅o菌操作臺(至少Class II)。操作過程中，應避免引起aerosol 之產(chǎn)生，小心毒性藥品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖銳針頭之傷害等。 5. 定期檢測下列項目： 5.1. CO2 鋼瓶之CO2 壓力 5.2. CO2 培養(yǎng)箱之CO2 濃度、溫度、及水盤是否有污染(水盤的水用無菌水，每周更換)。 5.3. 無菌操作臺內(nèi)之a(chǎn)irflow 壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA 過濾膜，預濾網(wǎng)(300小時/預濾網(wǎng)，3000 小時/HEPA)。 6. 水槽可添加消毒劑(Zephrin 1:750)，定期更換水槽的水。,基礎(chǔ)篇-實驗用品,1. 種類 1.1. 細胞培養(yǎng)實驗用品均為無菌，除了玻璃容器與pasteur pipet 外，其它均為塑料無菌制品。 1.2. TC 級培養(yǎng)盤表面均有coating 高分子物質(zhì)以讓細胞吸附，培養(yǎng)容器種類有Tflask，plates, dishes, roller bottle 等，依實驗需要使用。 1.3. plastic sterile pipet: 1 ml, 2 ml,5 ml, 10 ml, 25 ml 1.4. 塑料離心管: 15 ml, 50 ml，均有2 種不同材質(zhì)，其中polypropylene (PP) 為不透明材質(zhì)，polystyrene (PS) 為透明材質(zhì)，可依實驗需要而選擇適合材質(zhì)之離心管。 1.5. glass pastuer pipet: 9 inch，用以抽掉廢棄培養(yǎng)液等。 1.6. 玻璃血清瓶(Pyrex or Duran glassware)：100 ml, 250 ml,500 ml,1000ml,2. 清洗 2.1. 新購玻璃血清瓶先以0.10.05 N HCl 浸泡數(shù)小時，洗凈后才開始使用。 2.2. 用過之玻璃血清瓶，以高壓蒸汽滅菌，洗凈后分別用一次與二次去離子水沖洗干凈，勿加清潔劑清洗。 3. 滅菌 3.1. 實驗用玻璃血清瓶以鋁箔紙包覆瓶蓋，高壓蒸汽滅菌121, 15 lb, 20 分鐘，置于oven 中烘干。 3.2. 實驗用玻璃pasteur pipet 以干熱滅菌170, 4 小時。 3.3. 液體或是固體廢棄物可用10 % hypochloride 溶液(次氯酸，即漂白水) 或是蒸汽高壓滅菌121 , 15 lb, 20 分鐘處理。,基礎(chǔ)篇-培養(yǎng)基,1. 液體培養(yǎng)基貯存于4 冰箱，避免光照，實驗進行前放在37 水槽中溫熱。 2. 液體培養(yǎng)基(加血清) 存放期為六個月，期間glutamine 可能會分解，若細胞生長不佳，可以再添加適量glutamine。 3. 粉末培養(yǎng)基配制(以1 升為例)： 3.1. 細胞培養(yǎng)基通常須添加10 % 血清，因此粉末培養(yǎng)基之配制體積為900 ml，pH 為7.2 - 7.4。NaHCO3 為另外添加，若將NaHCO3 粉末直接加入液體培養(yǎng)基中會造成pH 之誤差，或局部過堿。因此粉末培養(yǎng)基及NaHCO3 粉末應分別溶解后才混合，然后用CO2 氣體調(diào)整pH，而非用強酸(HCl)或強堿(NaOH)，因為氯離子對細胞生長可能有影響，且貯存時培養(yǎng)基的pH 易發(fā)生改變。,3.2. 材料： 純水(milli-Q 水或二次至三次蒸餾水，水品質(zhì)非常重要) ，粉末培養(yǎng)基 ，NaHCO3 ，電磁攪拌器 無菌血清瓶 ，0.1 或0.2 mm無菌過濾膜 ，pH 計，真空泵，CO2 氣體 3.3. 步驟： 3.3.1. 取粉末培養(yǎng)基溶于700 ml milli-Q 水中，攪拌使其溶解。 3.3.2. 稱取適量之NaHCO3 粉末溶于200ml milli-Q 水中，攪拌使其溶解，然后通入CO2 氣體至飽和，約3-5 分鐘。 3.3.3. 將溶解且含飽和CO2 之NaHCO3 溶液加入溶解之液體培養(yǎng)基中混合。混后溶液之pH 應為7.2-7.4，除非pH 值偏差太大，否則不需用酸堿再調(diào)整之。若為太堿，可再通入CO2 氣體調(diào)整pH。培養(yǎng)基以真空幫浦通過過濾膜時，pH 會升高0.1-0.2。 3.3.4. 以0.1 或0.2 mm 無菌過濾膜過濾滅菌，同時分裝至無菌容器中，標示培養(yǎng)基種類、日期、瓶號等，貯存于4。(血清亦可加入培養(yǎng)基中一起過濾) 3.3.5. 配制之培養(yǎng)基配制須作生長試驗與污染測試。,附-配制培養(yǎng)基之生長測試,材料： MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004) 6-well TC plate (or 35 mm TC dish) methanol glacial acetic acid 10 % Giemsa solution (GibcoBRL 10092-013) 步驟： 1. 以待測試培養(yǎng)基培養(yǎng)MDCK cell，接種MDCK 細胞于6-well plate (或35mm TC dish) 中，每個well 接種1 102 活細胞，同時作對照組實驗。 2. 接種57 天后，在100 倍倒立顯微鏡作觀察細胞群落之生長，待細胞群落大到可以肉眼觀察，而群落間不互相接觸時即可。 3. 去除培養(yǎng)基，加入1 ml Carnoys 固定液(甲醇：冰醋酸 3:1)，室溫下靜置10 min。 4. 去除固定液，水洗二次。 5. 加入1 ml 10 % Giemsa solution，室溫下靜置染色2-3 min。 6. 去除染液，水洗二次。 7. 以肉眼計數(shù)群落數(shù)，并比較之，若新配制或新批號的培養(yǎng)基對細胞生長不佳，則丟棄之。,基礎(chǔ)篇-抗生素,1. 細胞庫之細胞培養(yǎng)基不加抗生素 1.1. 培養(yǎng)自ATCC 引進之細胞株，培養(yǎng)基中不加抗生素。 1.2. 培養(yǎng)自其它實驗室引進之細胞株，制作token freeze 前培養(yǎng)基須添加抗生素，待token freeze 通過污染測試后，大量培養(yǎng)時則不加抗生素。 2. 寄送活細胞時，須將培養(yǎng)液充滿整個flask 時，則須添加抗生素(penicillin 100 units/ml + streptomycin 100 ug/ml)。 3. 若要檢測mycoplasma，則培養(yǎng)基內(nèi)不可添加gentamicin，因gentamicin 會抑制mycoplasma 生長。,4. 去除細菌污染之抗生素混合配方: penicillin 250 units/ml, streptomycin 250 ug/ml, neomycin 250 ug/ml, bacitracin 2.5 units/ml，注意混合使用后藥物毒性會增強。 5. 抗生素使用種類與濃度： 工作濃度. 儲存溫度. 殺滅細菌 penicillin 100 units/ml -20 G(+) bacteria streptomycin 100 ug/ml -20 G(+) and G(-) bacteria chlotetracycline 50 ug/ml -20 G(+) and G(-) bacteria gentamicin 50 ug/ml -20 G(+) and G(-) bacteria, mycoplasma amphotericin B 2.5 ug/ml -20 yeast and molds nystatin 50 ug/ml -20 yeast and molds fungizone 2.5ug/ml -20 yeast and molds,基礎(chǔ)篇-血清,1. 血清必須貯存于20 -70，若存放于4，請勿超過一個月。如果一次無法用完一 瓶，可將4045 ml 分裝于無菌50 ml 離心管中，由于血清結(jié)凍時體積會增加約10 %， 必須預留此膨脹體積之空間，否則易發(fā)生污染或容器凍裂之情形。 2. 一般廠商提供之血清為無菌，不需再無菌過濾。若發(fā)現(xiàn)血清有許多懸浮物，則可將血清加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾，勿直接過濾血清。 3. 瓶裝(500ml) 血清解凍步驟(逐步解凍法): -20或70至4冰箱溶解一天，至室溫下全溶后再分裝，一般以50 ml 無菌離心管可分裝4045 ml。在溶解過程中須規(guī)則搖晃均勻(小心勿造成氣泡)，使溫度與成分均一，減少沈淀的發(fā)生。勿直接由20直接至37解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沈淀。,4. heat-inactivation 是指56, 30 分鐘加熱已完全解凍之血清。加熱過程中須規(guī)則搖晃均勻。此熱處理之目的是使血清中之補體成份(complement) 去活化。除非必須，一般不建議作此熱處理，因為會造成沈淀物之顯著增多，且會影響血清之品質(zhì)。補體參與之反應有：cytolytic activities, contraction of smooth muscle, release of histamine from mast cells and platelets, enhanced phagocytosis, chemotaxis and activation of lymphocytic and macrophage cell type。 5. 勿將血清置于37太久，若在37放置太久，血清會變得混濁，同時血清中許多較不穩(wěn)定之成份亦會因此受到破壞，而影響血清之品質(zhì)。,6. 血清之沈淀物 6.1. 凝絮物：發(fā)生之原因有許多種，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein) 變性及解凍后血清中存在之血纖維蛋白(fibrin) 造成，這些凝絮沈淀物不會影響血清本身之品質(zhì)。若欲減少這些凝絮沈淀物，可用離心3000 rpm, 5 min 去除，或離心后上清液可以加入培養(yǎng)基中一起過濾。不建議用過濾步驟去除這些凝絮沈淀物，因為會阻塞過濾膜。 6.2. 顯微鏡下觀察之“小黑點”：通常經(jīng)過熱處理之血清，沈淀物的形成會顯著的增多。有些沈淀物在顯微鏡下觀察像是“小黑點”，常會誤認為血清遭受污染，而將血清放在37中欲培養(yǎng)此“微生物“，但在37環(huán)境下，又會使此沈淀物增多，更會誤認為微生物之增殖，但以培養(yǎng)細菌之培養(yǎng)基檢測，又沒有污染。一般而言，此小黑點應不會影響細胞之生長，但若懷疑此血清之品質(zhì)，應立即停用，更換另一批號的血清。,附-血清之生長測試,材料： MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004) a-MEM (alpha modified minimal essential medium, GibcoBRL 12000-022 ) 6-well TC plate (or 35mm TC dish) methanol glacial acetic acid 10 % Giemsa solution(GibcoBRL 10092-013) 步驟： 1. 以a-MEM with 10 % FBS (已測試過) 培養(yǎng)MDCK 細胞于T75 flask 至80% confluency。 2. 以trypsin-EDTA 處理細胞，離心后，加入適量不加血清之a(chǎn)-MEM 制成細胞懸浮液，并測細胞濃度。以不加血清之a(chǎn)-MEM 稀釋細胞濃度為1102活細胞數(shù)/ ml。 3. 將1 ml 細胞懸浮液接種入6-well plate 中，并另加入1 ml 含不同濃度的血清(20 % , 10 % , 4 % , 2 % , 1 % , 0.4 %) 之a(chǎn)-MEM，使血清最終濃度為10% , 5 % , 2 % , 1 % , 0.5 % , 0.2 %。用已測試過之血清同時進行對照組試驗。,4. 37 oC，5 % CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)5-7 天，期間不需更換培養(yǎng)基，待細胞群落大到可以肉眼觀察，而群落間不互相接觸即可。 5. 去除培養(yǎng)基，加入1 ml Carnoys 固定液(甲醇:冰醋酸 3:1)，室溫下靜置10 min。 6. 去除固定液，水洗二次。 7. 加入1 ml 10 % Giemsa solution，室溫下靜置染色2-3 min。 8. 去除染液，水洗二次。 9. 以肉眼計數(shù)群落數(shù) 10. 計算SPE ( Serum Plating Efficiency )： SPE = ( no. of colonies / well ) / 100 x 100 % 11. 計算RPE(Relative Plating Efficiency)： SPE = total colonies of six well (test) / Total colonies of six well (control) x100 % 比較各濃度血清培養(yǎng)基之RPE，即可得知待測血清對細胞生長的影響。訂購多量同一批號的優(yōu)良血清，置于70 保存之,基礎(chǔ)篇-細胞傳代培養(yǎng),1. 細胞生長至高密度時，即須分殖至新的培養(yǎng)瓶中，一般稀釋比例為1:3 至1:6，依細胞種類而異。 2. 材料： 2.1. 無菌磷酸生理緩沖液(Dulbeccos phosphate-buffered saline, Ca+/Mg+ free, D-PBS, GibcoBRL 21600-010) 2.2. trypsin-EDTA solution (0.05% trypsin-0.53mM EDTA-4Na, GibcoBRL 25300-062)： 以10 ml 分裝于15 ml 無菌離心管中，保存于20，使用前放在37 水槽回溫。 2.3. 新鮮培養(yǎng)基 2.4. 無菌吸管/離心管/培養(yǎng)瓶 3. 步驟： 3.1. 附著型胞(adherent cell) 3.1.1. 吸掉舊培養(yǎng)液。 3.1.2. 用D-PBS 洗滌細胞一至二次。,3.1.3. 加入trypsin-EDTA 溶液(1ml/25cm2, 2ml/75cm2)，37 作用數(shù)分鐘，于倒立顯微鏡下觀察，當細胞將要分離而呈現(xiàn)圓粒狀時，吸掉trypsin-EDTA 溶液。(若不移去trypsin-EDTA，則在trypsin-EDTA 作用后，加入適量含血清之新鮮培養(yǎng)基終止trypsin 作用，離心后再吸掉上清液。) 3.1.4. 輕拍培養(yǎng)瓶使細胞自瓶壁脫落，加入適量之新鮮培養(yǎng)基，以吸管上下吸放數(shù)次以打散細胞團塊，混和均勻后，依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，以正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)。,3.2. 懸浮型細胞(suspension cell) 3.2.1. 吸出細胞培養(yǎng)液，放入離心管中，離心1000 rpm 5 分鐘。 3.2.2. 吸掉上清液，加入適量之新鮮培養(yǎng)基，混和均勻后，依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，以正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)。 3.3. 融合瘤(hybridoma) 3.3.1. 有些hybridoma cell 需培養(yǎng)三天以上才會產(chǎn)生抗體，若是更換培養(yǎng)基，則可能會失去抗體。因此繼代培養(yǎng)不需離心后更換培養(yǎng)基，直接添加新鮮培養(yǎng)基稀釋細胞濃度即可。若體積太大，可傾斜放置，或分殖至新培養(yǎng)瓶中。,基礎(chǔ)篇-細胞冷凍保存 （一）,1. 注意事項： 1.1. 欲冷凍保存之細胞應在生長良好(log phase) 且存活率高之狀態(tài)，約為80 90 致密度。 1.2. 冷凍前檢測細胞是否仍保有其特有性質(zhì)，例如hybridoma 應在冷凍保存前一至二日測試是否有抗體之產(chǎn)生。 1.3. 注意冷凍保護劑之品質(zhì)。DMSO 應為試劑級等級，無菌且無色(以0.22 micronFGLP Telflon 過濾或是直接購買無菌產(chǎn)品，如Sigma D-2650)，以510 ml 小體積分裝，4避光保存，勿作多次解凍。Glycerol 亦應為試劑級等級，以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內(nèi)使用，因長期儲存后對細胞會有毒性。 1.4. 冷凍保存之細胞濃度：,1.4.1. normal human fibroblast: 13 x 106 cells/ml 1.4.2. hybridoma: 13 x 106cells/ml，細胞濃度不要太高，某些hybridoma 會因冷凍濃度太高而在解凍24 小時后死去。 1.4.3. adherent tumor lines: 57 x 106，依細胞種類而異。Adenocarcinoma 解凍后須較高之濃度，而HeLa 只需1-3 x 106cells/ml。 1.4.4. other suspensions: 510 x 106cells/ml, human lymphocyte 須至少5 x 106cells/ml。 1.5. 冷凍保護劑濃度為5 或10 DMSO，若是不確定細胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時，亦應作一個backup culture，以防止冷凍失敗。 1.6. 冷凍方法： 1.6.1. 傳統(tǒng)方法: 4 10 分鐘- -20 30 分鐘- -80 16 - 18 小時(或隔夜) - 液氮槽vapor phase 長期儲存。 1.6.2. 程序降溫：利用等速降溫機以1 -3/分鐘之速度由室溫降至120，放在液氮槽vapor phase 長期儲存。適用于懸浮型細胞與hybridoma 之保存。,基礎(chǔ)篇-細胞冷凍保存 （二）,2. 材料： 2.1. 生長良好之培養(yǎng)細胞 2.2. 新鮮培養(yǎng)基 2.3. DMSO (Sigma D-2650) 2.4. 無菌塑料冷凍保存管(Nalgene 5000-0020) 2.5. 0.4 w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061) 2.6. 血球計數(shù)盤與蓋玻片 2.7. 等速降溫機(KRYO 10 Series II),3. 步驟： 3.1. 冷凍前一日前更換半量或全量培養(yǎng)基，觀察細胞生長情形。 3.2. 配制冷凍保存溶液(使用前配制)：將DMSO 加入新鮮培養(yǎng)基中，最后濃度為5-10，混合均勻，置于室溫下待用。 3.3. 依細胞繼代培養(yǎng)之操作，收集培養(yǎng)之細胞，取少量細胞懸浮液(約0.1 ml) 計數(shù)細胞濃度及凍前存活率。 3.4. 離心，去除上清液，加入適量冷凍保存溶液，使細胞濃度為1-5 x 106 cells/ml，混合均勻，分裝于已標示完全之冷凍保存管中，1 ml/vial，并取少量細胞懸浮液作污染檢測。 3.5. 冷凍保存方法1: 冷凍管置于4 10 分鐘 -20 30 分鐘 -80 1618 小時(或隔夜) 液氮槽vapor phase 長期儲存。 3.6. 冷凍保存方法2: 冷凍管置于已設(shè)定程序之等速降溫機中，再放入液氮槽中。程序為: program 7: HB CELL,基礎(chǔ)篇-冷凍細胞活化,1. 冷凍細胞之活化原則為快速解凍，以避免冰晶重新結(jié)晶而對細胞造成傷害，導致細胞之死亡。 2. 細胞活化后，約需數(shù)日，或繼代一至二代，其細胞生長或特性表現(xiàn)才會恢復正常(例如產(chǎn)生單株抗體或是其它蛋白質(zhì))。 3. 材料 37 恒溫水，新鮮培養(yǎng)基，無菌吸管/ 離心管/ 培養(yǎng)瓶，液氮或干冰容器,4. 步驟： 4.1 操作人員應戴防護面罩及手套，防止冷凍管可能爆裂之傷害。 4.2 自液氮或干冰容器中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，由于熱脹冷縮過程，此時蓋子易松掉。 4.3 將新鮮培養(yǎng)基置于37 C 水槽中回溫，回溫后噴以70 % 酒精并擦拭之，移入無菌操作臺內(nèi)。 4.4 取出冷凍管，立即放入37 C 水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1 分鐘內(nèi)全部融化，以70 % ethanol 擦拭保存管外部，移入無菌操作臺內(nèi)。 4.5 取出0.9 ml 解凍之細胞懸浮液，緩緩加入有培養(yǎng)基之培養(yǎng)容器內(nèi)(稀釋比例1:101:15)，混合均勻，放入CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。另取0.1 ml 解凍細胞懸浮液作存活測試。 4.6 解凍后是否立即去除冷凍保護劑(例如DMSO 或glycerol)，依細胞種類而異，一般而言，大都不需要立即去除冷凍保護劑。惟若要立即去除，則將解凍之細胞懸浮液加入含有5-10 ml 培養(yǎng)基之離心管內(nèi)，離心1,000 rpm, 5 分鐘，移去上清液，加入新鮮培養(yǎng)基，混合均勻，放入CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 4.7 若不需立即去除冷凍保存劑，則在解凍培養(yǎng)后隔日更換培養(yǎng)基。,基礎(chǔ)篇-收到細胞的處理方式 (一),1. 收到細胞株包裹時， 請檢查細胞株冷凍管是否有解凍情形， 若有請立即通知。細胞株請盡速開始培養(yǎng)， 或立即冷凍保存(置于70 C， 隔夜后， 移到液氮)。 2. 冷凍細胞解凍程序: 2.1. 依據(jù)細胞株數(shù)據(jù)單指定之基礎(chǔ)培養(yǎng)基種類、血清種類和其它指定之成份和比例，制備培養(yǎng)基。絕大多數(shù)之細胞均無法立即適應不同之基礎(chǔ)培養(yǎng)基或不同之血清種類， 若因?qū)嶒炐枰?必須有所不同時， 務必以緩慢比例漸次改變培養(yǎng)基組成， 確定細胞適應后， 方進行所需之實驗。 2.2. FBS (fetal bovine serum, 胚牛血清), CS (calf serum, 小牛血清)和HS (horse serum, 馬血清)，對細胞而言差異極大，請務必依據(jù)細胞株資料單指定之血清種類培養(yǎng)之。,2.3. 將培養(yǎng)基置于37 C 水槽中回溫， 回溫后噴以70 % 酒精并擦拭之， 移入無菌操作臺內(nèi)。取出冷凍管， 立即放入37 C 水槽中快速解凍， 水面高度不可接近或高過冷凍管之蓋沿， 否則易發(fā)生污染。輕搖冷凍管使其在1 分鐘內(nèi)全部融化后， 以70 % ethanol 擦拭冷凍管外部， 移入無菌操作臺內(nèi)。 2.4. 依據(jù)細胞種類和濃度，于無菌操作臺內(nèi)取10 ml 培養(yǎng)基加至T25 或T75 flask中。取出已解凍之細胞懸浮液，緩緩加入T25 或T75 flask 內(nèi)之培養(yǎng)基， 混合均勻，放入37 C，5 % CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 2.5. 對絕大多數(shù)細胞而言，1 % 以下之冷凍保護劑DMSO，不會對細胞之貼附或活化有不良影響，不需立刻由解凍細胞中去除， 待第二天確定細胞生長或貼附良好后再去除即可。惟對極少數(shù)因?qū)MSO 敏感或會造成細胞分化之細胞，需立即去除DMSO 者， 則可將解凍后之細胞懸浮液放入5 - 10 ml 培養(yǎng)基中，離心300 xg (約1000 rpm)，5 分鐘，小心移去上清液，加入適量新鮮培養(yǎng)基，將細胞均勻混合后， 轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中， 再放入37 C， 5 % CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。,基礎(chǔ)篇-收到細胞的處理方式 (二),收到T25 flask 細胞時， 處理方式為 1. 于寄送過程中，為避免起泡造成細胞脫落死亡，T25 flask 均加滿培養(yǎng)基。請檢查flask 外觀，并于顯微鏡下觀察細胞生長狀況和有無污染現(xiàn)象，若有任何問題， 不要打開蓋子，請立即通知細胞實驗室。 2. 將原封之T25 flask 靜置于37 C， 5 % CO2 培養(yǎng)箱中，使細胞回溫至37 C， 并讓運送過程中少數(shù)脫落的細胞可再附著生長。隔天后，于無菌操作箱內(nèi)取出flask內(nèi)之培養(yǎng)基，(取出之培養(yǎng)基可以再使用)，僅留約5-10ml 培養(yǎng)基于flask 內(nèi)，依一般培養(yǎng)方式再將細胞置入培養(yǎng)箱中，或細胞已長滿盤， 則將細胞做傳代培養(yǎng)。,附-細胞計數(shù)與存活測試（一）,1. 原理： 1.1. 計算細胞數(shù)目可用血球計數(shù)盤或是Coulter counter 粒子計數(shù)器自動計數(shù)。 1.2. 血球計數(shù)盤一般有二個chambers，每個chamber 中細刻9 個1 mm2 大正方形，其中4 個角落之正方形再細刻16 個小格，深度均為0.1 mm。當chamber 上方蓋上蓋玻片后，每個大正方形之體積為1 mm2 x 0.1 mm=1.0 x 10-4 ml。使用時，計數(shù)每個大正方形內(nèi)之細胞數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，再乘以104，即為每ml 中之細胞數(shù)目。 1.3. 存活測試之步驟為dye exclusion，利用染料會滲入死細胞中而呈色，而活細胞因細胞膜完整，染料無法滲入而不會呈色。一般使用藍色之trypan blue 染料，如果細胞不易吸收trypan blue，則用紅色之Erythrosin bluish。,附-細胞計數(shù)與存活測試（二）,2. 材料： 0.4 % w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061) Erythosin bluish stain 取0.1 gram Erythrosin bluish (Sigma E-9259) 及0.05 gram preservative methyl paraben (Sigma H-3647) 溶于100 ml Ca+/Mg+ free saline 血球計數(shù)盤及蓋玻片(Hemocytometer and coverslip) ，計數(shù)器(counter) ，低倍倒立顯微鏡 粒子計數(shù)器(Coulter counter, Coulter Electronics) 3. 步驟： 3.1. 取50ml 細胞懸浮液與50ml trypan blue (or Erythrosin bluish) 等體積混合均勻于1.5ml 小離心管中。 3.2. 取少許混合液(約15ml) 自血球計數(shù)盤chamber 上方凹槽加入，蓋上蓋玻片，于100 倍倒立顯微鏡下觀察，活細胞不染色，死細胞則為藍色(或紅色- Erythrosinbluish)。 3.3. 計數(shù)四個大方格之細胞總數(shù)，再除4，乘以稀釋倍數(shù)(至少乘以2，因與trypan blue等體積混合)，最后乘以104，即為每ml 中細胞懸浮液之細胞數(shù)。若細胞位于線上，只計上線與右線之細胞(或計下線與左線之細胞)。 4 大格*細胞總數(shù)x 2 x 104 / 4= 細胞數(shù)/ml *每一大格的體積= 0.1cm x 0.1cm x 0.01cm = 10-4 ml,3.4. 若不用血球計數(shù)盤，可用Coulter counter 作自動計數(shù)，惟無法辨別死細胞或活細胞。 3.5. 范例： T75 monolayer culture 制成10ml 細胞懸浮液，取0.1 ml 溶液與0.1ml trypan blue 混合均勻于試管中，取少許混合液加入血球計數(shù)盤，計數(shù)四大方格內(nèi)之細胞數(shù)目。 活細胞數(shù)/方格：55 ,62, 49, 59 死細胞數(shù)/方格：5, 3, 4, 6 細胞總數(shù)= 243 平均細胞數(shù)/方格= 60.75 稀釋倍數(shù)= 2 細胞數(shù)/ml：60.75 x 104 x 2 = 1.22 x 106 細胞數(shù)/flask： 1.22 x 106 x 10ml = 12.2 x 106 存活率：225/24392.6 %,升級篇-細胞培養(yǎng)1,1 冷凍管應如何解凍？ 取出冷凍管后， 須立即放入37 C 水槽中快速解凍， 輕搖冷凍管使其在1 分鐘內(nèi)全部融化， 并注意水面不可超過冷凍管蓋沿， 否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時， 必須注意安全， 預防冷凍管之爆裂。 2 細胞冷凍管解凍培養(yǎng)時， 是否應馬上去除DMSO？ 除少數(shù)特別注明對DMSO 敏感之細胞外， 絕大部分細胞株（包括懸浮性細胞）， 在解凍之后， 應直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中， 待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO 即可， 如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附之問題。,3 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基？ 不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應之細胞培養(yǎng)基， 若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基， 細胞大都無法立即適應， 造成細胞無法存活。 4 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之血清種類？ 不能。血清是細胞培養(yǎng)上一個極為重要的營養(yǎng)來源， 所以血清的種類和品質(zhì)對于細胞的生長會產(chǎn)生極大的影響。來自不同物種的血清， 在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。,升級篇-細胞培養(yǎng)2,5 何謂FBS, FCS, CS, HS ? FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 兩者都是指胎牛血清， FCS 乃錯誤的使用字眼， 請不要再使用。CS (calf serum) 則是指小牛血清。HS (horseserum) 則是指馬血清。 6 培養(yǎng)細胞時應使用5 % 或10% CO2？或根本沒有影響？ 一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為pH 的緩沖系統(tǒng)， 而培養(yǎng)基中NaHCO3 的含量將決定細胞培養(yǎng)時應使用的CO2 濃度。當培養(yǎng)基中NaHCO3 含量為每公升3.7 g 時，細胞培養(yǎng)時應使用10 % CO2；當培養(yǎng)基中NaHCO3 為每公升1.5 g 時， 則應使用5 % CO2 培養(yǎng)細胞。,7 何時須更換培養(yǎng)基？ 視細胞生長密度而定， 或遵照細胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時間，按時更換培養(yǎng)基即可。 8 培養(yǎng)基中是否須添加抗生素？ 除于特殊篩選系統(tǒng)中外， 一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下， 培養(yǎng)基中不應添加任何抗生素。 9 附著性細胞繼代時所使用之trypsin-EDTA 濃度？應如何處理？ 一般使用之trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中， 保存于20 C，避免反復冷凍解凍造成trypsin 之活性降低， 并可減少污染之機會。 10 懸浮性細胞應如何繼代處理？ 一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中， 稀釋細胞濃度即可， 若培養(yǎng)液太多時， 可將培養(yǎng)角瓶口端稍微抬高， 直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細胞之培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)角瓶， 加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當濃度， 重復前述步驟即可。,升級篇-細胞培養(yǎng)3,11 欲將一般動物細胞離心下來，其離心速率應為多少轉(zhuǎn)速？ 欲回收動物細胞， 其離心速率一般為300xg (約1,000rpm)，5 - 10 分鐘， 過高之轉(zhuǎn)速， 將造成細胞死亡。 12 細胞之接種密度為何？ 依照細胞株基本數(shù)據(jù)上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長之一重要原因。 13 細胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何？ 動物細胞冷凍保存時最常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原來細胞生長用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意：由于DMSO 稀釋時會放出大量熱能， 故不可將DMSO 直接加入細胞液中， 必須使用前先行配制完成。,14 DMSO 之等級和無菌過濾之方式為何？ 冷凍保存使用之DMSO 等級， 必須為Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650)， 其本身即為無菌狀況， 第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中， 保存于4C， 避免反復冷凍解凍造成DMSO 之裂解而釋出有害物質(zhì)， 并可減少污染之機會。若要過濾DMSO， 則須使用耐DMSO 之Nylon 材質(zhì)濾膜。 15 冷凍保存細胞之方法？ 冷凍保存方法一: 冷凍管置于4 C 3060 分鐘 (-20 C30 分鐘*) -80 C 1618 小時(或隔夜) 液氮槽vaporphase 長期儲存。 冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3 C 至80 C 以下， 再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20 C 不可超過1 小時， 以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80C 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。,升級篇-細胞培養(yǎng)4,16 細胞欲冷凍保存時， 細胞冷凍管內(nèi)應有多少細胞濃度？ 冷凍管內(nèi)細胞數(shù)目一般為1x106 cells/ml vial， 融合瘤細胞則以5x106 cells/ml vial 為宜。 17 應如何避免細胞污染？ 細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉?jié){菌。主要的污染原因為無菌操作技術(shù)不當、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細胞等。嚴格之無菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好之細胞來源和培養(yǎng)基配制是減低污染之最好方法。 18 如果細胞發(fā)生微生物污染時，應如何處理？ 加入相應抗生素。直接滅菌后丟棄之。 19 支原體(mycoplasma) 污染的細胞， 是否能以肉眼觀察出異狀？,不能。除極有經(jīng)驗之專家外，大多數(shù)遭受支原體污染的細胞株，無法以其外觀分辨之。 20 支原體污染會對細胞培養(yǎng)有何影響？ 支原體污染幾乎可影響所有細胞之生長參數(shù)， 代謝及研究之任一數(shù)據(jù)。故進行實驗前，必須確認細胞為mycoplasma-free，實驗結(jié)果之數(shù)據(jù)方有意義。 21 偵測出細胞株有支原體污染時， 該如何處理？ 直接滅菌后丟棄，以避免污染其它細胞株。 22 CO2 培養(yǎng)箱之水盤如何保持清潔？ 定期(至少每兩周一次) 以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。,升級篇-細胞培養(yǎng)5,23 為何培養(yǎng)基保存于4 C 冰箱中， 顏色會偏暗紅色， 且pH值會越來越偏堿性？ 培養(yǎng)基保存于4 C 冰箱中， 培養(yǎng)基內(nèi)之CO2 會逐漸溢出，造成培養(yǎng)基越來越偏堿性。而培養(yǎng)基中之酸堿指示劑(通常為phenol red) 的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿之結(jié)果， 將造成細胞生長停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時， 可以通入無菌過濾之CO2， 以調(diào)整pH 值。 24 各種細胞培養(yǎng)用的dish，flask是否均相同？ 不同廠牌的dish 或flask， 其所coating 的polymer 不同， 制造程序亦不同， 雖對大部分細胞沒有太大之影響， 惟少數(shù)細胞則可能因使用廠牌不同之dish 或flask 而有顯著之生長差異。,25 購買之細胞冷凍管經(jīng)解凍后，為何會發(fā)生細胞數(shù)目太少之情形？ 研究人員在冷凍細胞之培養(yǎng)時出現(xiàn)細胞數(shù)目太少， 大都是因為離心過程操作上的失誤， 造成細胞的物理性損傷， 以及細胞流失。建議細胞解凍后不要立刻離心， 應待細胞生長隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。 26 購買之細胞死亡或細胞存活率不佳可能原因？ 研究人員在細胞培養(yǎng)時出現(xiàn)存活率不佳， 常見原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳。血清使用錯誤或血清的品質(zhì)不佳。解凍過程錯誤。冷凍細胞解凍后， 加以洗滌細胞和離心。懸浮細胞誤認為死細胞。培養(yǎng)溫度使用錯誤。細胞置于80 C 太久。 27 收到之冷凍管瓶身破裂，瓶蓋有裂紋，或瓶蓋脫落之原因？ 冷凍管瓶蓋裂紋，或瓶身破裂，可能是因為操作者夾取冷凍管時用力不當，造成冷凍管裂損，建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動或松脫，乃因熱脹冷縮之物理現(xiàn)象，冷凍管有可能因此而造成細胞污染，故冷凍管于放入和取出液氮桶時，均應立刻將冷凍管再一次扭緊,升級篇-細胞培養(yǎng)6,28 如何選用特殊細胞系培養(yǎng)基？ 培養(yǎng)某一類型細胞沒有固定的培養(yǎng)條件。在MEM中培養(yǎng)的細胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長。總之，首選MEM做粘附細胞培養(yǎng)、RPMI-1640做懸浮細胞培養(yǎng)是一個好的開始，各種目的無血清培養(yǎng)最好首選AIM V（12005）培養(yǎng)基（SFM）。 29 L-谷氨酰胺在細胞培養(yǎng)中重要嗎？它在溶液中不穩(wěn)定嗎？ L-谷氨酰胺在細胞培養(yǎng)時是重要的。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細胞的能量來源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過一段時間后會降解，但是確切的降解率一直沒有最終定論。L-谷氨酰胺的降解導致氨的形成，而氨對于一些細胞具有毒性。,30 GlutaMAX-I是什么？培養(yǎng)細胞如何利用GlutaMAX-I？這個二肽有多穩(wěn)定？ GlutaMAX-I 二肽是一個L-谷氨酰胺的衍生物，其不穩(wěn)定的alpha-氨基用L-丙氨酸來保護。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L-谷氨酰胺供利用。 GlutaMAX-I二肽非常穩(wěn)定，即使在121磅滅菌20分鐘，GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解，如果在相同條件下，L-谷氨酰胺幾乎完全降解。 31 什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅？ 酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為PH值的指示劑：中性時為紅色，酸性時為黃色，堿性時為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用，（特別是雌激素）。為避免固醇類反應，培養(yǎng)細胞，尤其是哺乳類細胞時，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細胞檢測時，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。,升級篇-細胞培養(yǎng)7,32 培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么？ 丙酮酸鈉可以作為細胞培養(yǎng)中的替代碳源，盡管細胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒有葡萄糖的話，細胞也可以代謝丙酮酸鈉。 34二價離子抑制胰蛋白酶活性嗎？使用胰蛋白酶時加入EDTA的目的是什么？ 二價離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細胞前，用EDTA清洗細胞，以消除來自培養(yǎng)基中所有的二價離子。,33 目錄上說，Hanks 平衡鹽溶液(HBS)要在空氣中使用，不需要CO2培養(yǎng)箱。原因是什么？Hanks 平衡鹽溶液(HBS)和Earles平衡鹽溶液(EBS)有什么本質(zhì)的功能差別？ HBS和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平,在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡，以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中，溶液會變堿，Hanks液在CO2培養(yǎng)箱中會變酸。如果希望在CO2培養(yǎng)箱中保存組織，需要用Eagles液，。如果僅僅是清洗將要在細胞培養(yǎng)基中儲存的組織，用Hanks液就可以了。,升級篇-細胞培養(yǎng)8,35 當在無血清培養(yǎng)基中添加抗生素時，降低至少在有血清培養(yǎng)基中所使用濃度的50%。血清蛋白會結(jié)合和滅活一些抗生素。在無血清培養(yǎng)條件下，抗生素不被滅活，可能對于細胞達到毒性水平。 36 一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時，您應該在兩到三周內(nèi)使用它。因為一些抗生素和血清中的基本成分在解凍后就開始降解。 37 大部分添加物和試劑最多可以凍融3次，如果次數(shù)更多都會在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，將會影響它的性能。 38 在溶解的一周內(nèi)使用貯存在4冰箱中的液體胰蛋白酶溶液。胰蛋白酶在4就可能開始降解，如果在室溫下放置超過30分鐘，就會變得不穩(wěn)定。,細胞分離試劑（1）,大部分連續(xù)細胞系，強貼壁細胞系，許多早代細胞 HBSS或無鈣鎂PBS 0.25胰蛋白酶溶解在無鈣鎂平衡鹽溶液中 細胞表面蛋白完整性重要的連續(xù)細胞系 HBSS或無鈣鎂PBS 0.05胰蛋白酶溶解在0.53mM EDTA 弱貼壁表皮細胞轉(zhuǎn)化成纖維細胞（要求細胞表面完整性），原代細胞 HBSS或無鈣鎂PBS EDTA,甘油 溶解在檸檬酸鈉中 強貼壁早代細胞系 HBSS或無鈣鎂PBS 0.25胰蛋白酶溶解在1mM EDTA，Dispase 0.6-2.4單位/ml 溶解在PBS,細胞分離試劑（2）,上皮細胞 0.5mM -1mM EDTA 0.5mM -1mM EDTA，Dispase 0.6-2.4單位/ml 溶解在PBS 強貼壁細胞，上皮細胞，一些腫瘤細胞 0.5mM -1mM EDTA 0.25胰蛋白酶1mM EDTA，Dispase 0.6-2.4單位/ml 溶解在無鈣鎂PBS 厚培養(yǎng)物，多層富含膠原的密集培養(yǎng) 1mM EDTA 0.25胰蛋白酶，200單位/ml膠原酶，1mM EDTA溶解在無鈣鎂平衡鹽溶液中,培養(yǎng)液pH 值變化太快 CO2 張力不對。培養(yǎng)瓶蓋擰得太緊。NaHCO3 緩沖系統(tǒng)緩沖力不足。培養(yǎng)液中鹽濃度不正確。細菌、酵母或真菌污染。 （1）按培養(yǎng)液中NaHCO3 濃度增加或減少培養(yǎng)箱內(nèi)CO2 濃度，2.0g/L 到3.7g/L 濃度NaHCO3 對應CO2 濃度為5 到10。（2）改用不依賴CO2 培養(yǎng)液。 松開瓶蓋1/4 圈。 加HEPES 緩沖液至10 到25mM 終濃度。 在CO2 培養(yǎng)環(huán)境中改用基于Earles 鹽配制的培養(yǎng)液，在大氣培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)改用Hanks 鹽配制的培養(yǎng)液。 丟棄培養(yǎng)物或用抗生素除菌。,培養(yǎng)液出現(xiàn)沉淀，但pH值不變 用洗滌劑清洗后殘留磷酸鹽將培養(yǎng)基成分沉淀下來。冰凍保存培養(yǎng)液。 用去離子水反復沖洗玻璃器皿，然后除菌。 將培養(yǎng)液加熱到37，搖動使其溶解如沉淀仍然存在，丟棄培養(yǎng)液。 培養(yǎng)液出現(xiàn)沉淀， 同時pH 發(fā)生變化 細菌或真菌污染 丟棄培養(yǎng)物?；蛴每股爻?培養(yǎng)細胞不貼壁 胰蛋白