血栓與止血檢測進展.ppt

1,血栓與止血檢測進展,王鴻利 上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院，上海血液學研究所，200025,2,近年，隨著基礎理論和實驗技術的發(fā)展，血栓和止血檢驗及其臨床應用也有了很大的進展，本文就此作一簡述。,3,（一）血小板微顆粒檢測 血小板被激活后，以出芽方式形成囊泡或以偽足斷裂方式形成直徑為0.11.0m的血小板顆粒（Platelet Microparticle,PMP)。PMP的體積較正常血小板小，但有完整的血小板膜結構和功能。PMP膜上可表達多種血小板膜糖蛋白（GP）b/a（ GP b/a）、 GPb/-、血小板活化因子（PAF）、-樣前體淀粉蛋白、Ca2+依賴性蛋白酶Calpainyi以及有促凝作用的磷脂等。因此檢測血循環(huán)中的PMP可較完整地反映血小板參與血栓形成和血液凝固的功能。,4,5,檢測方法流式細胞術。主要試劑為CD61 parcp:多甲藻素-葉綠素蛋白標記抗血小板GPa的單克隆抗體 參考值6617個/104血小板（山東大學齊魯醫(yī)院報道）。,6,臨床意義PMP主要用于動脈血栓性疾病的檢測，它是動脈血栓形成的敏感和特異的分子標志物。 1.急性冠脈綜合征（ACS）：有證據(jù)顯示，PMP參與動脈粥樣硬化和血管再梗塞的病理過程。Cawaz等對急性心肌梗死（AMI）施行PTCA患者進行系列血小板功能研究，發(fā)現(xiàn)PTCA術后患者的血小板數(shù)因消耗增加而減少，PMP因大量形成而增多，后者又參與冠脈血栓的形成。Katopodis等對行冠脈血栓形成術的ACS患者進行觀察，他們將血小板激活狀態(tài)作為試驗組（近期發(fā)生AMI、不穩(wěn)定性心絞痛者），結果發(fā)現(xiàn)，試驗組患者PMP水平較正常對照組明顯增高。,7,2.腦血栓形成：對大血管血栓、小血管血栓、多發(fā)性腦梗死和阿爾茨海默病患者進行PMP檢測。結果發(fā)現(xiàn)，阿爾茨海默病患者的PMP水平與正常對照組無統(tǒng)計學差異，而其他疾病組患者的PMP水平均顯著高于正常對照組，且治療后有明顯的降低，而且小血管血栓組患者的PMP水平高于大血管血栓組患者。表明PMP水平的增高，主要反映小動脈的血栓形成和血栓阻塞。,8,（二）血小板-白細胞聚集體檢測 血小板被激活后，血小板釋放P-選擇素（P-selectin或GMP-140）。 P-選擇素與白細胞和（或）單核細胞膜上的P-選擇素配體糖蛋白-1（PSLG-1）結合形成血小板-白細胞聚集物（Platelet-Leucocyte Aggre - gate,PLA)和（或）血小板-單核細胞聚集物 （ Platelet-Monocyte Aggregate）。該聚集體是反映動脈血栓形成的特異性標志物之一。,9,檢測方法流式細胞術。主要試劑為FTTC標記的鼠抗人GPIb（CD42b）單克隆抗體，藻紅蛋白標記的抗人白細胞CD45單克隆抗體，F(xiàn)TTC標記的鼠抗人P-selectin （CD62b）單克隆抗體。 參考值瑞典學者報道血小板-白細胞聚集物為15.38.5（PLA/L）。,10,臨床意義動物實驗和臨床研究表明，PLA是更敏感和更特異的血栓標志物。一組93例胸痛患者，其中9例為AMI患者，其血小板-單核細胞聚集物為34.210.3，84 例非AMI胸痛患者的血小板-單核細胞聚集體為19.31.4，二組差異顯著（0.05）； AMI胸痛組和非AMI胸痛組患者的血小板-單核細胞聚集物水平均較10例正常對照組的血小板-單核細胞聚集物水平為高（0.001）。,11,（三）血管性血友病因子裂解蛋白酶活性檢測 生理情況下，由血管內(nèi)皮細胞合成的血管性血友病因子（von Willebrand Factor, vWF）主要受vWF裂解蛋白酶（ vWF C-leaving Proteinase, vWF -CP）的調(diào)節(jié)。vWF CP作用于 vWF分子量為250000多聚體的Try（842）-Met（843）之間的肽鍵，將它們水解成分子量為176000和140000的兩個小分子肽段。此時vWF不能過度地參與血小板的粘附和聚集，因此vWF CP是 限制血栓形成的標志物之一。,12,13,14,檢測方法ELISA。以型膠原包被酶標板，2.5BSA封閉，分別加入未透析的標本和經(jīng)Slide-A-Lyzer透析過的標本，一抗為兔抗人vWF多抗，二抗為辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG，加入底物OPD490nm顯色。結果以透析前后的OPD490比值作為該份標本的殘余膠原結合活性（ vWF:CBA或R- CBA ）表示， R- CBA 越高， vWF-CP活性越低。 參考值83例正常人血漿（n30） vWF:CBA 范圍為2.140.5（21.99.2）；血清（n53） vWF:CBA范圍為2.452.0（20.510.8）（蘇州大學附一院）。,15,臨床意義 1.血栓性血小板減少性紫癜（TTP）：由于患者的vWF-CP基因缺陷或患者血漿中存在抗vWF-CP自身抗體，使vWF-CP血漿水平顯著降低，不能正常裂解超大分子量的vWF多聚體（UL- vWF ）。體內(nèi)聚集的UL- vWF 易于血小板結合，促使血小板粘附和聚集，引起TTP病理過程的發(fā)生和發(fā)展。一組5例TTP患者檢測vWF:CBA結果為48.196.5（78.220.2），較正常對照組明顯增高，反映患者vWF-CP明顯降低。,16,2.血管性血友?。╲WD）：據(jù)報道，21例vWF患者血漿vWF:CBA水平明顯降于30例正常人、15例血友病患者及30例其他出血性疾病患者（0.001）。在vWF中，型患者的vWF:Ag/ vWF:CBA比值1.0；型患者的vWF:Ag/ vWF:CBA比值2.0；型患者的vWF:Ag/ vWF:CBA都極低，其vWF:Ag/ vWF:CBA比值具有可變性。,17,3.惡性腫瘤：惡性腫瘤患者的vWF-CP活性水平顯著低于正常人，伴有遠處轉(zhuǎn)移患者的vWF-CP活性水平更低，接受手術治療后患者的vWF-CP可升高，導致血漿大分子多聚體增多，促使vWF參與血小板粘附和聚集，加劇惡性腫瘤患者的高凝集狀態(tài)和血栓形成，反映vWF是參與惡性腫瘤血栓形成機制之一。,18,(四)單克隆抗體特異性俘獲血小板抗原檢測 （monoclonal antibody specific immobili- zation of platelet antigen,MAIPA） 將待測抗體、單抗和血小板共同溫育，得到血小板膜GP、待測標本和單抗三分子復合物，然后加入酶聯(lián)抗體并以微粒色被抗體固化于微孔中顯色，顯色深淺與待測抗體水平呈正比。 參考值抗GP b/a陽性，A值0.133；抗GPb陽性， A值0.209,19,20,臨床意義檢測血小板相關抗體，其敏感度和特異度高于雙抗體夾心ELISA法。用于檢測ITP和同種免疫血小板減少癥。,21,兩種方法對ITP診斷的比較,22,(五)凝血酶激活的纖溶抑制物（TAFI）檢測 凝血酶-凝血酶調(diào)節(jié)蛋白復合物（T-TM）將由肝臟合成的、分子量為55KD的凝血酶激活的纖溶抑制物（Thrombin Activatable Fibrinolysis Inhibitor,TAFI）的Arg（92）-Ala（93）之間的肽鍵水解后，脫去一個活化肽， TAFI變成活化型的TAFI a。 TAFI具有抑制纖溶酶原轉(zhuǎn)化為纖溶酶的生物活性，但是TAFI也受蛋白C抑制物（PCI）的抑制。,23,24,檢測方法 采用 ELISA測定TAFI：Ag。以鼠抗人TAFI單克隆抗體包被酶標板，加入標準品或樣品后，再加入辣根過氧化物酶標記的抗人TAFI抗體，充分作用后加入鄰苯二胺使之顯色，顯色深淺與樣本TAFI的含量成正比。 TAFI:A采用發(fā)色底物法測定。 參考值 TAFI:Ag （n34）為7728 （21133）； TAFI:A （n34）為24 5g/L（1434g/L）（上海瑞金醫(yī)院）,25,臨床意義 1.深靜脈血栓（DVT）：Tiburg等對腦74例初發(fā)DVT患者的TAFI:Ag 進行檢測，發(fā)現(xiàn)其水平增高?？诜茉兴幍恼Ｉ趮D女，若TAFI：Ag水平超過90，其水平的危險性水平2倍，此時患者的纖溶活性減低。 2.動脈血栓（冠心?。喝鸾疳t(yī)院對19例冠心病患者檢測了TAFI:Ag和TAFI:A，發(fā)現(xiàn)冠心病患者的TAFI:Ag和TAFI:A的水平均高于正常對照組（0.001），與Silveira報道11例冠心病的檢測結果一致，表明患者的纖溶活性明顯降低。此外， TAFI水平增高也見于不穩(wěn)定性心絞痛。,26,3.微血栓（DIC）：瑞金醫(yī)院對15例DIC患者檢測了TAFI:Ag和TAFI:A，發(fā)現(xiàn)患者的水平明顯低于正常對照組（0.001），表明患者纖溶活性明顯升高。 4.其他：TAFI水平升高還見于感染、因子V Leiden突變； TAFI水平減低還見于某些凝血因子缺乏（血友病、F缺乏癥）、急性早幼粒細胞白血病（ TAFI:A減低66，但TAFI:Ag正常）。,27,（六）可溶性血管內(nèi)皮細胞蛋白C受體檢測 可溶性血管內(nèi)皮細胞蛋白C受體（Soluble Endothelial Protein C Receptoe,sEPCR）是由血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生，部分與內(nèi)皮細胞連接稱膜連EPCR，一部分流離于血漿稱sEPCR?？寺〉哪みBEPCR cDNA全長1.3kb,是一種由221個氨基酸組成跨膜糖蛋白。膜連EPCR 通過促進T-TM復合物與蛋白C（PC）的結合，進而放大PC的活性；此外， EPCR還對體內(nèi)急性炎癥反應河DIC的發(fā)生具有保護作用。然而，血漿中sEPCR與膜連的EPCR具有相反的作用。 sEPCR也可與PC和活化蛋白C（APC）結合。抑制PC的活化和抑制APC的抗凝活性，減輕膜連EPCR的增強PC活化和APC的抗凝作用，所以血漿sEPCR水平的增高市反映血管損傷和抗APC抗凝作用的特異性標志物。,28,檢測方法采用 ELISA。以單克隆-抗包被酶標板，分別加入血漿標本和不同稀釋度的sEPCR標準品后，以生物素標記的單克隆二抗作為檢測抗體，加入底物后顯色，繪制標準曲線。 參考值血漿sEPCR為115.220.7g/L,29,臨床意義安徽省立醫(yī)院報道的結果見表1,30,（七）蛋白C Global試驗 凝血酶（T）與血管內(nèi)皮細胞的凝血酶調(diào)節(jié)蛋白（TM）形成復合物（T-TM），后者使PC轉(zhuǎn)化為APC。 APC在蛋白S（PS）的輔助下，滅活因子Va和因子a，還抑制纖溶酶原激活抑制物-1（PAI-1），使纖溶活性增強。然而，Agkistrodon contorix蛇毒可以取代T-TM復合物直接激活PC，使PC轉(zhuǎn)化為APC， APC也受PAI的抑制。,31,檢測方法在待測血漿中加入蛇毒溫育，蛇毒可直接激活PC，使PC轉(zhuǎn)化為AP- C。隨后在檢測系統(tǒng)中加入APTT試劑以檢測依賴PC活性的血漿凝固時間（Protein C Activ-Ity Dependent ClottingTime,PCAT）若待測血漿中的PC系統(tǒng)正常，則加入Ca2+后血漿凝固時間顯著延長。為了避免諸多因素的影響，本試驗設計了對照組，即在實驗過程中以緩沖液代替PC激活劑，血漿不依賴PC活性的血漿凝固時（PCAT/O） ，其結果應短于60s。,32,參考值PCAT為85200s， PCAT/O為 3355s （n234）。 臨床意義本試驗對PC活性低于參考值70的檢出率為90；對PS活性低于參考值的60的檢出率為89；對凝血因子Leiden突變的檢出率為100；對凝血酶原（F）20210 CA突變的檢出率為84。本試驗的檢出特異性為79。因此，本試驗多用于PC、PS、F Leiden突變和F20210 CA突變的檢測，起到蛋白C系統(tǒng)篩選檢測作用。但是，本試驗也有假陽性，見于凝血因子、活性升高、口服抗凝劑和狼瘡抗凝物質(zhì)等。,33,（八）蛋白Z抗原檢測 蛋白Z（Protein Z,PZ）是二十世紀90年代發(fā)現(xiàn)的一種血液凝固調(diào)節(jié)蛋白，為一種維生素K依賴的單鏈糖蛋白，由肝臟合成后分泌入血。人PZ的相對分子量為62KD，半壽期為2.5天，其基因位于13q34。在Ca2+和磷脂存在時，PZ可與蛋白Z依賴的蛋白酶抑制物（ Protein Z-Pependent ProtaseInhibItor,ZPI）結合，并進一步與Fa形成a-ZPI-PZ復合物而使因子a在一分鐘內(nèi)便失去95以上的凝血活性。,34,檢測方法 目前多采用法國Stago公司的 ELISA試劑盒檢測。 參考值法國學者報道1.043.57mg/L；國內(nèi)潘學誼報道60例中青年人（2258480）g/L。妊娠期時PZ水平逐漸增高。,35,臨床意義目前PZ在臨床上的意義尚不十分清楚。Wasse等研究發(fā)現(xiàn)PZ缺乏（1.0Mg/L）在缺血性腦卒中和健康對照中分別為20和5，二者具有顯著性差異，PZ缺乏可使缺血性腦卒中的危險性提高4倍。Soft等報道在急性冠脈綜合征病人當中PZ水平明顯低于健康對照，說明PZ缺乏是導致急性冠脈綜合征的獨立的危險因素。此外，尚有報道認為PZ缺乏也會導致臨床出血癥狀，故認為PZ具有血栓和出血雙種作用，機制未明。此外，血透患者和口服避孕藥者PZ水平升高；口服抗凝劑、流產(chǎn)、早產(chǎn)、先兆子癇、胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩等PZ血漿水平降低。,36,蛋白Z依賴的蛋白酶抑制物檢測 (proteinZ-dependent protease inhibitor,ZPI) 原理用抗ZPI的多克隆抗體色被酶標板，待測血漿中的ZPI與固相抗體結合，生物素化抗ZPI單抗與ZPI抗原結合形成固相多抗-抗原-生物素單抗夾心物。后加入鏈霉素親和素-辣根過氧化物酶復合物，其中辣根過氧化物酶作用其特異性底物甲基聯(lián)苯胺 （TMB）生成有色物質(zhì)，顯色程度與ZPI含量呈正比。,37,參考范圍各室需自行建立 臨床意義ZPI應與PZ同時檢測。PZ缺乏時，勢必使ZPI抑制FXa和FXIa的作用明顯減低，易形成血栓。,38,（九）組織因子途徑抑制物-因子Xa復合物檢測 （tissue factor pathway inhibitor-factor-factorXa complex,TFPI-FXa） 利用雙抗體夾心法檢測血漿中TFPI/FXa二元和TF/Fa/ TFPI/FXa四元復合物。將稀釋的血漿樣品加至預先用特異性抗TFPI抗體色被的酶標板中溫育，抗原-抗體結合后用生物素標記的純化雞IgY來檢測，后者可識別TFPI/FXa復合物表面的新抗原決定簇。加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素親和素，形成雙抗體夾心酶聯(lián)免疫復合物。加底物TMB，與過氧化物酶反應生成藍色溶液，最后加0.5mol/LH2SO4終止反應，溶液變成黃色。在波長450nm處測得吸光度值。根據(jù)標準曲線，計算待測血漿中TFPI/FXa復合物的含量。,39,參考值待建立 臨床意義有助于DIC早期和血栓前狀態(tài)的檢測和診斷。,40,（十）抗體芯片技術 抗體芯片（Antibody Microarray）是 蛋白芯片的一種，是將能識別特異性抗原的抗體制成微陣列，檢測生物樣品中抗原蛋白表達模式的方法。這種抗體微陣列可以在一次簡單實驗中同時檢測樣品中的數(shù)百甚至數(shù)千種蛋白質(zhì)的表達情況，并且可以在一張芯片上對兩種樣品的表達模式進行比較分析。這使抗體芯片在毒性實驗、疾病研究和藥物開發(fā)上有著廣泛的應用前景。,41,抗體芯片的檢測操作并不要求特殊的技能，一般常規(guī)的操作就可以完成以往極為復雜耗時的工作。整個檢測操作流程包括：從組織或細胞、體液中提取蛋白質(zhì)，并用Cy5和Cy3兩種不同顏色的熒光分子分別標記被檢測樣品和對照樣品，去除多余的標記分子后與芯片雜交孵育，最后掃描分析結果。整個過程從樣品制備到結果分析只要一天即可完成。在抗體芯片制作方面，如何獲得高質(zhì)量的抗體、提高特異性、減少交叉反應是制作高質(zhì)量抗體芯片的主要考慮因素。,42,抗體芯片技術在血栓與止血檢驗領域 有著很好的應用前景。目前正在研發(fā)過程中的凝血疾病診斷抗體芯片，是將針對各種凝血因子和抗凝血因子的單克隆抗體分別固定在合適的片基上，來檢測血清標本中各種凝血因子和抗凝血因子的抗原，從而可以迅速診斷遺傳性易栓癥和出血性疾病。,43,（十一）血栓彈力圖 （ Thrombelastograph hemostasis system,TEG ） 的檢測及其臨床應用,凝血-血小板-纖溶的篩選作用,44,參數(shù)定義,45,參數(shù)定義,46,-3+3,48,5472,47,高凝,48,-3+3,48,5472,4774,49,50,-3+3,EPL 015 Ly30 08,4774,51,纖溶亢進,52,53,54,（十二）旋轉(zhuǎn)血栓彈力圖（ROTEM） 是在傳統(tǒng)的TEG基礎上，減少振動的干擾，增加了流動性和電腦分析系統(tǒng)，使測量間的波動減少，更為準確、明了。,55,常用參數(shù)及其意義/應用 EXTEM是加入重組的TF(rTF)激活外源凝血系統(tǒng)，很快形成血凝塊(相當于PT)，即為EXTEM-CT。EXTEM-CT的截斷閾值出現(xiàn)在實驗開始后的80s，提示需輸注PCC或FFP； EXTEM-MCF：提供血凝塊最大強度和穩(wěn)定的信息，與血小板計數(shù)和Fg水平有關。,56,FIBTEM-MCF：實驗中加入一種血小板抑制劑（細胞松弛素D）即代表Fg對血凝塊的強度；MCF截斷閾值出現(xiàn)于實驗開始后的1015分鐘，其降低提示須輸注Fg制品； FIBTEM-MCF值正常而EXTEM-MCF值減低提示須輸注血小板，因此二者須同時檢測。,57,INTEM是實驗中加入鞣花酸活化物，激活內(nèi)源凝血系統(tǒng)（類似APTT）；加入肝素酶（HEPTM）用肝素樣抗凝物檢查。比較INTEM-CT和HEPTEM-CT，可用于對肝素化和魚精蛋白糾正的定量，二者需同時檢測。,58,針對圍手術期大出血患者床旁ROTEM檢查，應包括EXTEM、FIBTEM、APTEM以及必要時用INTEM、HEPTEM等。 對于心臟手術（體外循環(huán)）被肝素化的患者，推薦將INTEM-CT和HEPTEM-CT作為首選的ROTEM檢查。,59,推薦檢查的時間點 手術之前 有明顯出血，但尚未作糾正治療時 置換一個血容之后 術后檢測有無高凝狀態(tài),60,血制品的輸注和止血藥的應用 1、Fg/冷沉淀輸注：Fg1.0g/L，或ROTEM檢測EXTEM-MCF50mm及FIBTEM-MCF12mm。應輸注Fg/冷沉淀。 EXTEM-MCF和FIBTEM-MCF的目標值（參考值）分別為5060mm和1620mm。若行施肝移植和心臟手術患者，其EXTEM-MCF可為45mm，F(xiàn)IBTEM-MCF可為8mm；若無出血EXTEM-MCF的臨界值可35mm。,61,2、血小板輸注：BPC 50109/L或EXTEM-MCF45mm + FIBTEM-MCF12mm，應輸血小板制品。,62,3、PPC/FFP輸注：APTT/PT 正常對照值的1.5倍或EXTEM-MCF 100mm。提示F、F、F、F的血漿水平減低，應給予PPC或FFP。FFP應輸注2030ml/kg（國內(nèi)1015ml/kg），且可以補充F。,63,4、rFa制品：在Fg 1.0 1.0g/L， BPC 50109/L和APTT/PT接近正常情況下，其療效最佳?？梢赃x用TEG/ROTEM檢查中的R/CT、K/CFT縮短以及MA/MCF升高最能反映rFa的效果，但APTT/PT的縮短不能反映rFa的效果。,64,（十三）血小板功能分析儀 （platelet function analyzer-100,PFA-100) 體外篩選血小板黏附和聚集的儀器。以標有膠原/腺上腺素（CEPI）和膠原/ADP（CADP）兩種纖維膜為誘導劑，以觀察膜孔閉合時間（closure time，CT）為結果。 參考范圍 CEPI為61203s；CADP：48 187s,65,In Vivo Haemostasis,PFA100.avi,capillary 200m,aperture 150m,epinephrine or ADP,platelet,vWF,erythrocyte,FLOW,- 40 mbar,collagen,membrane,PFA-100 Test Principle,lumen,fibrinogen,platelet,collagen fibrils,erythrocyte,endothelial cell,vWF,66,臨床應用 一期止血缺陷的篩選試驗。 敏感性：CEPI/CADP為82.5%/66.9% 特異性： CEPI/CADP為88.7%/85.5% 陰性預測值： CEPI/CADP為83%/75% 陽性預測值： CEPI/CADP為88%/79%,67,vWD：CEPI/CADP的敏感性為88%/87%；特異性為95%/95%。 血小板無力癥：CT延長，可替代BT，準確、可靠。 服用ASA時：CEPI的CT延長，CADP可正常；與其他疾病與藥物誘導血小板功能異常鑒別的敏感性和特異性分別為100%和50%。,68,方法學評價 PFA-100操作簡便、快速、結果準確。CEPI/CADP的變異系數(shù)為12%/8%，與PAgT有良好相關性。 受PLT、貧血（Hct30%）、O型血型、3.8%枸櫞酸鹽和富含核黃素食物等的影響；Fg的裂解肽可影響 Fg-vWF/GPb-a的結合,69,（十四）凝血酶生成 (Thrombin generation，TGT) 的檢測及其臨床應用,乏血小板血漿(PPP)試劑(含TF和磷脂)作用于待測血漿，激活凝血系統(tǒng)，最終生成凝血酶。后者將熒光底物ZGGR-AMC*轉(zhuǎn)化為熒光基團AMC，AMC在390nm激發(fā)光的作用下發(fā)出460nm波長的熒光。熒光讀數(shù)儀實時檢測產(chǎn)生的熒光強度，通過電腦自動繪制凝血酶生成曲線。 * ZGGR-AMC: Z-Gly-Gly-Arg-AminoMethyl coumarin,凝血酶生成試驗的原理,70,CAT檢測法主要有5個指標：,延遲時間(lagtime):即從反應開始到凝血酶開始生成所經(jīng)歷的時間(min為單位)。 峰值(peak):即生成凝血酶的最大量(nM為單位)。 達峰時間(ttpeak):即從反應開始到凝血酶達到最大值所經(jīng)歷的時間(為單位)。 凝血酶生成潛力(Endogenous thrombin potential,ETP): 即凝血酶生成曲線下的微積分面積，反映凝血酶的生成量(nMmin為單位)。 ETP比值：即患者ETP與正常人ETP的比值(%為單位)。,71,72,凝血酶生成試驗的臨床應用,在低分子量肝素(LMWH)治療中的凝血酶生成,73,74,75,76,77,檢測抗凝藥物治療：例如華法林治療(n=78)。,隨著PT-I