藥物的雜質(zhì)檢查二.ppt

藥物的雜質(zhì)檢查(二）,Impurity test of drugs,第一節(jié) 概 述,一、藥物純度及其要求 二、雜質(zhì)的來源與種類 三、雜質(zhì)的限量,第二節(jié) 一般雜質(zhì)的檢查方法 氯化物檢查（ChP2010二部附錄A） 原理: 利用藥物中的微量氯化物在硝酸酸性條件下與硝酸銀反應(yīng)，生成氯化銀交替微粒而顯白色渾濁，與一定量的標(biāo)準(zhǔn)氯化鈉溶液在相同條件下產(chǎn)生的氯化銀渾濁程度比較，判斷供試品中氯化物是否符合限量規(guī)定。,取各藥品項(xiàng)下規(guī)定量的供試品，加水溶解使成25ml，再加稀硝酸10ml；置50ml納氏比色管中，加水使成約40ml，搖勻，即得供試溶液。另取各藥品項(xiàng)下規(guī)定量的標(biāo)準(zhǔn)氯化鈉溶液，置50ml納氏比色管中，加稀硝酸10ml，加水使成40ml，搖勻，即得對照溶液。于供試溶液與對照溶液中，分別加入硝酸銀試液1.0ml，用水稀釋至50ml，搖勻，在暗處放置5分鐘，同置黑色背景上，從比色管上方向下觀察，比較，即得。,操作方法,氯化物 取本品0.60g，依法檢查（附錄A），與標(biāo)準(zhǔn)氯化鈉溶液6.0ml制成的對照液比較，不得更濃（0.01%）。,中國藥典葡萄糖中氯化物的檢查,特別注意：帶色供試品中氯化物檢查 內(nèi)消色法 取供試品溶液兩份，于其中一份中先加入硝酸銀試液，如顯渾濁，可反復(fù)濾過（濾紙事先用含有硝酸的水洗凈其上的氯化物），至濾液澄清，即得無氯化物雜質(zhì)又具有相同顏色的澄清溶液，再加入規(guī)定量的標(biāo)準(zhǔn)氯化鈉溶液與水適量，作為對照溶液；另一份中加入硝酸銀試液1.0ml與水適量使成50ml，作為供試溶液，再依法檢查。,不同溶解性質(zhì)的供試品 溶于水的有機(jī)藥物，可直接依法檢查； 不溶于水的有機(jī)藥物，多數(shù)采用加水振搖，使所含氯化物溶解，濾除不溶物或加熱溶解供試品，放冷后析出沉淀，濾過，取濾液依法檢查； 溶于稀乙醇或丙酮中的有機(jī)藥物，可加稀乙醇或丙酮溶解后依法檢查。,硫酸鹽檢查法（ChP2010二部附錄B） 硫酸鋇白色渾濁納氏比色管比濁 鐵鹽檢查法（ChP2010二部附錄G） 紅色可溶性硫氰酸鐵配離子納氏比色管比色,第二節(jié) 一般雜質(zhì)的檢查方法,重金屬檢查法 Limit Test for Heavy Metals ChP2010二部附錄H,第二節(jié) 一般雜質(zhì)的檢查方法,1.重金屬元素的危害 定義：在實(shí)驗(yàn)條件下能與S2-作用顯色的金屬雜質(zhì)，如銀、鉛、汞、銅、鎘、鉍、銻、錫等。與體內(nèi)酶蛋白上的SH和S=S鍵牢固結(jié)合,從而使蛋白質(zhì)變性失活。 鉛:損害神經(jīng)系統(tǒng)，造血系統(tǒng)，血管和消化系統(tǒng)； 汞:損害腎臟，造成腎功能衰竭。 重金屬以鉛為代表。,2.硫代乙酰胺法（第一法） 1）原理 硫代乙酰胺在弱酸性（pH3.5醋酸鹽緩沖液）條件下水解，產(chǎn)生硫化氫，與微量重金屬離子生成黃色到棕黑色的硫化物均勻混懸液。 CH3CSNH2+H2O CH3CONH2+H2S H2S+Pb2+ PbS+2H+,2）操作方法 取各藥品項(xiàng)下規(guī)定量的供試品，加醋酸鹽緩沖液(pH3.5)2ml與水適量使成25ml，加硫代乙酰胺試液2ml，放置2分鐘后，與標(biāo)準(zhǔn)鉛溶液一定量按同法制成的對照液比較（置白紙上，自上向下透視），以判斷供試品中重金屬離子是否超過限量。 第一法適用于溶于水、稀酸和乙醇的藥物，為最常用方法。,3）討論 （1）適宜目視比色范圍為每25ml溶液中含10g -20g的Pb，相當(dāng)于每1ml含10gPb的標(biāo)準(zhǔn)鉛溶液1ml-2ml。 （2）溶液的pH值在3-3.5，硫化鉛沉淀較完全。用醋酸鹽緩沖液（pH3.5）控制溶液pH值。 （3）供試品如有色： 在對照溶液管中滴加少量稀焦糖溶液或其它無干擾的有色溶液 ； 取兩倍量供試品，分成兩等份，在一份中加硫代乙酰胺試液，用濾膜濾除金屬硫化物沉淀后，加入標(biāo)準(zhǔn)鉛溶液作為對照溶液，再與另1份供試溶液比較。,（4）鐵鹽存在 微量高鐵鹽：加抗壞血酸或鹽酸羥胺 供試品中若有微量高鐵離子存在，在弱酸性溶液中將氧化硫化氫而析出硫，產(chǎn)生渾濁，影響比色?？上燃涌箟难?.51.0g，使高鐵離子還原為亞鐵離子，再按常規(guī)步驟檢查。,重金屬與有機(jī)藥物結(jié)合怎么辦？ 重金屬不溶于酸水怎么辦？ 重金屬量很低怎么辦？,重金屬檢查法,3.熾灼后的硫代乙酰胺法（第二法） 適用于含芳環(huán)、雜環(huán)及難溶于水、稀酸及乙醇的有機(jī)藥物。 1）操作方法：精密稱取規(guī)定量供試品置坩堝中，在電爐上緩緩熾灼至完全炭化，放冷，加硫酸0.5-1.0ml，使恰濕潤，用低溫加熱至硫酸除盡，加硝酸0.5ml，蒸干，至氧化氮蒸氣除盡后，放冷，在500-600（馬福爐）熾灼使完全灰化，放冷，加鹽酸2ml，置水浴上蒸干后加水15ml，微熱溶解，轉(zhuǎn)移入納氏比色管，滴加氨試液至對酚酞指示液顯中性，再加醋酸鹽緩沖液（pH3.5）2ml，依第一法檢查。,2）討論 （1）熾灼溫度：溫度太低，灰化不完全；溫度太高，重金屬損失越多，如鉛在700經(jīng)6小時(shí)熾灼，回收率僅為32%。應(yīng)控制在500600熾灼使完全灰化。 （2）熾灼殘?jiān)酉跛峒訜崽幚砗螅仨氄舾沙M氧化氮，否則亞硝酸可使硫化氫氧化析出硫。 （3）為了消除鹽酸或其他試劑中可能夾雜重金屬的影響，對照溶液應(yīng)取同樣、同量試劑在坩堝中蒸干后，依法檢查。(空白試驗(yàn)) （4）含鈉鹽或含氟的有機(jī)藥物在熾灼時(shí)能腐蝕瓷坩堝，應(yīng)改用鉑坩堝。,4.硫化鈉法（第三法） 適用于溶于堿性水溶液而難溶于稀酸或在稀酸中即生成沉淀的藥物。 操作方法：取規(guī)定量的供試品，加氫氧化鈉試液5ml和水20ml使溶解后，加硫化鈉試液5滴，再與一定量標(biāo)準(zhǔn)鉛溶液經(jīng)同樣處理后的顏色進(jìn)行比較。,司可巴比妥鈉中重金屬的檢查 取本品1.0g，依法檢查（附錄H第三法），含重金屬不得過百萬分之二十（20ppm）。 硫化鈉試液對玻璃有一定的腐蝕性。 硫化氫試液有惡臭和毒性，不穩(wěn)定，濃度也難以控制，應(yīng)臨用新配。,5.微孔濾膜法（第四法）,重金屬限量低時(shí)，用納氏比色管難以觀察，用微孔濾膜濾過，重金屬硫化物沉積于微孔濾膜上形成色斑，與一定量的標(biāo)準(zhǔn)鉛溶液同法處理后產(chǎn)生的色斑比較，確定重金屬是否超過限量。 EUROPEAN PHARMACOPOEIA 6.0, (2008) HEAVY METALS METHOD E,濾器上蓋部分,連接頭,濾器下蓋部分,濾膜,墊圈,尼龍墊網(wǎng),待測液 注射器轉(zhuǎn)移、壓濾,微孔濾膜過濾法檢重金屬裝置,第一法：硫代乙酰胺法，適用于溶于水、稀酸和乙醇的藥物。 第二法：有機(jī)破壞法，適用于含芳環(huán)、雜環(huán)以及難溶于水、稀酸、乙醇的有機(jī)藥物。 第三法：堿溶解法，適用于溶于堿性水溶液而難溶于稀酸或在稀酸中即生成沉淀的藥物。 第四法：微孔濾膜法，適用于含2-5g重金屬雜質(zhì)的檢查。,重金屬檢查法,砷鹽檢查法 Limit Test for Arsenics ChP2010二部附錄J,第二節(jié) 一般雜質(zhì)的檢查方法,砷元素的危害,砷為毒性雜質(zhì)，擴(kuò)張毛細(xì)血管，麻痹血管舒縮中樞，使腹腔臟器嚴(yán)重充血，引起肝、腎、心等實(shí)質(zhì)器官的損害。,（一）古蔡（Gutzeit）氏法 原理 利用金屬鋅與酸作用產(chǎn)生新生態(tài)的氫，與藥物中微量砷鹽反應(yīng)生成具揮發(fā)性的砷化氫，遇溴化汞試紙產(chǎn)生黃色至棕色的砷斑，與一定量標(biāo)準(zhǔn)砷溶液所生成的砷斑比較，判定藥物中砷鹽的含量。其反應(yīng)式如下： As3+3Zn+3H+ AsH3+3Zn2+ AsO33-+3Zn+9H+ AsH3+3Zn2+3H2O AsH3+2HgBr2 2HBr+AsH(HgBr)2 黃色 AsH3+3HgBr2 3HBr+As(HgBr)3 棕色,溴化汞試紙,醋酸鉛棉花,反應(yīng)液,標(biāo)準(zhǔn)品,樣品,Gutzeit法檢砷裝置,A,B,C,標(biāo)準(zhǔn)砷斑的制備：精密量取標(biāo)準(zhǔn)砷溶液2ml(1g/ml)，置A瓶中，加鹽酸5ml與水21ml，再加碘化鉀試液5ml與酸性氯化亞錫試液5滴，在室溫放置10分鐘后，加鋅粒2g，立即將裝妥的導(dǎo)氣管C密塞于A瓶上，并將A瓶置2540水浴中，反應(yīng)45分鐘，取出溴化汞試紙，即得。 取按各品種項(xiàng)下規(guī)定方法制成的供試品溶液，置A瓶中，照標(biāo)準(zhǔn)砷斑制備方法操作，將供試品砷斑與標(biāo)準(zhǔn)砷斑比較，不得更深。,砷鹽 取本品2.0g，加水5ml溶解后，加稀硫酸5ml與溴化鉀溴試液0.5ml，置水浴上加熱約20分鐘，使保持稍過量的溴存在，必要時(shí)，再補(bǔ)加溴化鉀溴試液適量，并隨時(shí)補(bǔ)充蒸散的水分，放冷，加鹽酸5ml與水適量使成28ml，依法檢查（附錄J第一法），應(yīng)符合規(guī)定（0.0001%）。,中國藥典葡萄糖中砷鹽的檢查,Q1：供試品2.0g與標(biāo)準(zhǔn)砷溶液2ml形成的砷斑比較的做法(1)，供試品1.0g與標(biāo)準(zhǔn)砷溶液1ml形成的砷斑比較的做法(2)，哪個(gè)合適？,Q2：為何加碘化鉀及氯化亞錫？,Q3：醋酸鉛棉花的作用與注意事項(xiàng),Q4：為何選用溴化汞試紙而不選用氯化汞試紙，注意事項(xiàng)有哪些？,（二）二乙基二硫代氨基甲酸銀法 (Ag-DDC法),原理 砷化氫與Ag(DDC)吡啶溶液作用，使Ag(DDC)中的銀還原為紅色膠態(tài)銀，與相同條件下一定量標(biāo)準(zhǔn)砷溶液所呈色用目視比色法或在510nm處測定吸收度，進(jìn)行比較。,（三）次磷酸法 原理 在鹽酸酸性液中，次磷酸將砷鹽還原為棕色的游離砷，與一定量的標(biāo)準(zhǔn)砷溶液用同法處理后所顯顏色比較，來控制藥物中的砷限量。 用于硫化物、亞硫酸鹽及含銻藥物等的砷鹽檢查時(shí)不產(chǎn)生干擾，但靈敏度比古蔡氏法低。,各國藥典砷鹽檢查法 ChP（2010） 古蔡氏法、Ag（DDC）法 Ph.Eur.(2008) 古蔡氏法、次磷酸法 USP（2009） Ag（DDC）法,溶液顏色檢查法（ChP2010二部附錄A） 控制藥物中有色雜質(zhì)的含量。與標(biāo)準(zhǔn)比色液比較、分光光度法或色差計(jì)法。 易炭化物檢查法（ChP2010二部附錄O）檢查藥物中遇硫酸易炭化或易氧化而呈色的微量有機(jī)雜質(zhì)。 溶液澄清度檢查法（ChP2010二部附錄B） 澄清度是檢查藥品溶液的混濁程度，反映不溶性雜質(zhì)的存在情況（特別是用作注射劑的原料藥純度控制）。,第二節(jié) 一般雜質(zhì)的檢查方法,熾灼殘?jiān)鼨z查法（ChP2010二部附錄N） 有機(jī)藥物經(jīng)熾灼炭化，至完全灰化，使非揮發(fā)性無機(jī)雜質(zhì)（多為金屬的氧化物或鹽類）成為硫酸鹽，稱為熾灼殘?jiān)?700-800) 干燥失重測定法（ChP2010二部附錄L）藥物在規(guī)定條件下經(jīng)干燥后所減失的重量，以百分率表示。主要控制藥物中的水分，也包括其他揮發(fā)性物質(zhì)如乙醇等。 水分測定法（ChP2010二部附錄M ） 藥物中的水分包括結(jié)晶水和吸附水。ChP和USP均收載費(fèi)休氏法和甲苯法測定藥物中的水分。,第二節(jié) 一般雜質(zhì)的檢查方法,殘留溶劑測定法（ChP2010二部附錄P） 苯/benzene bp 80.1 氯仿/chloroform bp 61.2 1,4-二氧六環(huán)/dioxane bp 101.4 二氯甲烷/dichloro-methane bp 40.0 吡啶/pyridine bp 115 甲苯/toluene bp 110.6 環(huán)氧乙烷/ethylene oxide bp 11 種類多，毒性大，檢測要求高。,殘留溶劑測定法,確定殘留溶劑的研究對象 殘留溶劑分類 殘留溶劑表示方法 A.允許日接觸量 PDE B.濃度限度(%)=,藥物中常見殘留溶劑及其限度,第一類溶劑（毒性大且有致癌并對環(huán)境有害，避免使用）,第二類溶劑（對人有一定毒性，限制使用）,第二類溶劑,第二類溶劑,第三類溶劑（對人健康危險(xiǎn)性較小，推薦使用）,第三類溶劑,第四類溶劑（尚無足夠毒性資料的溶劑） 1,1-二乙氧基丙烷 1,1-二甲氧基甲烷 2,2-二甲氧基丙烷 異辛烷 異丙醚 甲基異丙基酮 甲基四氫呋喃 石油醚 三氯乙酸 三氟乙酸,殘留溶劑測定法 氣相色譜法,1.色譜柱 毛細(xì)管柱、填充柱 2.系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 理論板數(shù)N不低于5000（毛細(xì)管柱） 1000（填充柱） 相鄰峰分離度R大于1.5 精密度RSD 內(nèi)標(biāo)法不大于5% 外標(biāo)法不大于10%,殘留溶劑測定法 氣相色譜法,3.供試品溶液的制備 頂空進(jìn)樣 0.1-1g供試品，水、DMF、DMSO 溶液直接進(jìn)樣 水或合適溶劑 4.對照品溶液的制備 水作溶劑或50% DMF、DMSO溶解后再用水逐步稀釋 限量檢查：根據(jù)限量配制對照品濃度 定量測定：接近供試品殘留量的濃度,殘留溶劑測定法 氣相色譜法,5.測定法 第一法 毛細(xì)管柱頂空進(jìn)樣等溫法 檢查有機(jī)溶劑殘留的數(shù)量不多，且極性差異 較小的供試品 第二法 毛細(xì)管柱頂空進(jìn)樣系統(tǒng)程序升溫法 檢查有機(jī)溶劑殘留的數(shù)量較多，且極性差異 較大的供試品 第三法 溶液直接進(jìn)樣法 可采用填充柱，亦可采用適宜極性毛細(xì)管柱,示例,大孔樹脂有機(jī)溶劑殘留 大孔樹脂是一種不溶于酸、堿及各種有機(jī)溶劑的有機(jī)高分子聚合物,應(yīng)用大孔樹脂進(jìn)行分離的技術(shù)是20 世紀(jì)60 年代末發(fā)展起來的繼離子交換樹脂后的分離新技術(shù)之一,物理化學(xué)穩(wěn)定性高 比表面積大 吸附容量大 選擇性好 吸附速度快,解吸條件溫和 再生處理方便 使用周期長 宜于構(gòu)成閉路循環(huán) 節(jié)省費(fèi)用,溶劑殘留的引入,大孔吸附樹脂主要以苯乙烯、- 甲基苯乙烯、甲基丙烯酸甲酯、丙腈等為原料加入一定量致孔劑二乙烯苯聚合而成,多為球狀顆粒,直徑一般在0. 31. 25 mm 之間,通常分為非極性、弱極性和中極性。 主要存在正己烷、苯、甲苯、對二甲苯、鄰二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯（對于樹脂的檢測） 洗脫過程采用不同比例的乙醇，因此也存在乙醇的殘留（主要存在于產(chǎn)品中）,乳癖消原料藥（提取物）中 有機(jī)溶劑殘留的測定,乳癖消原料藥的制備 取昆布、漏蘆等14味藥材按處方比例稱取后加水煎煮兩次，合并兩次提取液濾過，濾液減壓回收濃縮，上樣D-101大孔樹脂，靜止吸附，采用梯度洗脫：水20乙醇75乙醇。收集醇洗部分，減壓回收乙醇后噴霧干燥，成細(xì)粉。 可能殘留的溶劑乙醇第三類溶劑，限度0.5,實(shí)驗(yàn)部分,色譜條件 儀器：島津GC-14B氣相色譜儀 色譜條件： SIMPLICITY-5 30m0.32mm0.25m毛細(xì)管柱 FID檢測 分流比30:1，進(jìn)樣量1l。 進(jìn)樣分析開始毛細(xì)管60恒溫6min，而后程序升溫40C /min至200C，并維持1min。,實(shí)驗(yàn)部分,系統(tǒng)適用性試驗(yàn)： 理論塔板數(shù)以乙醇、正己烷、苯、甲苯、對二甲苯、苯乙烯和二乙烯苯色譜峰計(jì)算應(yīng)不低于5000； 乙醇、正己烷、苯、甲苯、對二甲苯、苯乙烯和二乙烯苯與內(nèi)標(biāo)物正庚烷的色譜峰分離度應(yīng)大于1.5； 以內(nèi)標(biāo)法測定時(shí)，所得待測物與內(nèi)標(biāo)物色譜峰面積之比的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于5%。,tR5.355 對二甲苯 tR5.982 苯乙烯 tR9.008、9.097 9.338、9.462 二乙烯苯,tR2.170 乙醇 tR2.410 正己烷 tR2.682 苯 tR2.845 正庚烷（內(nèi)標(biāo)） tR3.487 甲苯,乙醇、正己烷、苯、甲苯、對二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯 和正庚烷氣相色譜分離系統(tǒng)評價(jià),線性范圍與最低檢測限,取標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程制備項(xiàng)下的最低濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過不同比例稀釋后進(jìn)行測定，在信噪比值約為3的條件下，最后一次測得積分值的濃度為最低檢出濃度，其中乙醇最低檢測限約為5.190g/ml,線性范圍與最低檢測限,乙醇標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程(n=5) Y=-0.0024+0.0029C r=0.9999 正己烷標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程(n=5) Y=0.0159+0.0048C r=0.9997 苯標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程(n=5) Y=-0.000016+0.0077C r=0.9998 甲苯標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程(n=5) Y=0.0009+0.0055C r=0.9999 對二甲苯標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程(n=5) Y=0.0037+0.005C r=0.9999 苯乙烯標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程(n=5) Y=0.0024+0.0044C r=0.9999 二乙烯苯標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程(n=5) Y=0.006+0.0063C r=0.9999,最低檢測限 乙醇約為5.190g/ml 正己烷約為5.380g/ml 苯約為0.7350g/ml 甲苯約為5.000g/ml 對二甲苯約為5.420g/ml 苯乙烯約為6.340g/ml 二乙烯苯約為6.400g/ml,精密度試驗(yàn)(重復(fù)性),取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液系列中的4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)溶液，按氣相色譜測定條件連續(xù)進(jìn)樣5次，計(jì)算乙醇、正己烷、苯、甲苯、對二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯和內(nèi)標(biāo)物正庚烷的峰面積比值,5,樣品測定,取3個(gè)批號(hào)的樣品1.21.3g，用N,N-二甲基甲酰胺超聲溶解，過濾，收集濾液，并定容至50ml容量瓶內(nèi)，上機(jī)測定 比值 濃度（ g/ml ） 限量（） 對照 0.0613 20.25 批號(hào)1 0.0453 14.96 0.062（1.213g） 批號(hào)2 0.0498 16.45 0.067（1.226g） 批號(hào)3 0.0553 18.27 0.073（1.247g） 實(shí)際樣品中主要?dú)埩舻氖且掖?第三節(jié) 特殊雜質(zhì)檢查 檢查藥物中存在的微量雜質(zhì)，首要的 問題是選擇一個(gè)專屬性強(qiáng)的方法。 一、利用藥物和雜質(zhì)在物理性質(zhì)上的差異 二、在化學(xué)性質(zhì)上的差異 三、在色譜性質(zhì)上的差異 四、在光譜性質(zhì)上的差異,一、色譜分析法,色譜法具有高分離效能，專屬性強(qiáng)，是檢查有關(guān)物質(zhì)的首選方法。 TLC HPLC GC ,TLC 1.雜質(zhì)對照品法 制備一定濃度的供試品溶液和相應(yīng)的(濃度符合限度規(guī)定的)雜質(zhì)對照品溶液或系列雜質(zhì)對照品溶液，點(diǎn)樣、展開、檢測并比較。供試品溶液色譜圖中除主斑點(diǎn)外的其他斑點(diǎn)(雜質(zhì)斑點(diǎn))與相應(yīng)的雜質(zhì)對照品溶液或系列雜質(zhì)對照品溶液色譜圖中的主斑點(diǎn)比較，顏色(或熒光)不得更深。,TLC 2.自身稀釋對照法 制備一定濃度的供試品溶液；取供試品溶液一定量，按照限度規(guī)定，稀釋制成另一低濃度溶液或系列溶液，作為對照溶液，點(diǎn)樣、展開、檢測并比較。供試品溶液色譜圖中除主斑點(diǎn)外的其他斑點(diǎn)(雜質(zhì)斑點(diǎn))與相應(yīng)的自身稀釋對照溶液或系列自身稀釋對照溶液色譜圖中的主斑點(diǎn)比較，顏色(或熒光)不得更深。,TLC 3.雜質(zhì)對照品法與自身稀釋對照法并用 即特定雜質(zhì)限度采用雜質(zhì)對照品法，其他雜質(zhì)限度采用供試品溶液自身稀釋對照法控制。通常應(yīng)規(guī)定雜質(zhì)的斑點(diǎn)數(shù)和單一雜質(zhì)量，當(dāng)采用系列自身稀釋對照溶液時(shí)，也可規(guī)定估計(jì)的雜質(zhì)總量。,4.對照藥物法 當(dāng)無適合的雜質(zhì)對照品或供試品中雜質(zhì)斑點(diǎn)顏色與主成分斑點(diǎn)的顏色有差異，難以判斷其限量時(shí)，可用與供試品相同的藥物作為對照品，此對照藥物中所含待檢雜質(zhì)需符合限量要求，且穩(wěn)定性好。 ChP采用TLC檢查馬來酸麥角新堿中的有關(guān)物質(zhì) 樣品溶液：供試品溶液（1）5mg/ml、供試品溶液（2）0.2mg/ml ，對照品溶液5mg/ml； 試驗(yàn)結(jié)論：供試品溶液（1）主斑點(diǎn)的位置和顏色應(yīng)與對照品溶液的主斑點(diǎn)相同；如顯雜質(zhì)斑點(diǎn)，其顏色與對照品溶液對應(yīng)的雜質(zhì)斑點(diǎn)比較，不得更深，并不得顯對照品溶液以外的雜質(zhì)斑點(diǎn)；供試品溶液（2）除主斑點(diǎn)外，不得顯任何雜質(zhì)斑點(diǎn)。,HPLC,高效液相色譜法分離效能高、專屬性強(qiáng)和檢測靈敏度高，可以準(zhǔn)確地測定供試品各組分的峰面積，在雜質(zhì)檢查中的應(yīng)用日益增多。特別是選擇HPLC測定含量的藥物，可采用同一色譜條件進(jìn)行雜質(zhì)檢查。,1.峰面積歸一化法,樣品峰,溶劑峰,ChP采用HPLC法對胰島素中相關(guān)蛋白質(zhì)的檢查，按面積歸一化法計(jì)算，A21脫氨胰島素不得大于5.0%，其他相關(guān)蛋白質(zhì)不得大于5.0%。,2.不加校正因子主成分自身對照法 3.加校正因子的主成分自身對照法,樣品液稀釋,樣品液,溶劑峰,樣品峰,HPLC,不加校正因子的主成分自身對照法 ChP采用HPLC法對頭孢克肟中有關(guān)物質(zhì)的檢查，采用不加校正因子的主成分自身對照法，即供試品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)峰，單個(gè)雜質(zhì)峰面積不得大于對照溶液主峰面積的0.5倍（0.5%），各雜質(zhì)峰面積的和不得大于對照溶液主峰面積的3倍（3%），供試品溶液色譜圖中任何小于對照溶液主峰面積0.1倍的峰可忽略不計(jì)。,HPLC,加校正因子的主成分自身對照法 ChP采用HPLC法對紅霉素中紅霉素B、C組分及有關(guān)物質(zhì)的檢查，采用加校正因子的主成分自身對照法，即紅霉素B按校正后的峰面積計(jì)算（乘以校正因子0.7）和紅霉素C峰面積均不得大于對照溶液主峰面積（5.0%）。供試品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)峰，紅霉素烯醇醚、雜質(zhì)1按校正后的峰面積計(jì)算（分別乘以校正因子0.09、0.15）和其他單個(gè)雜質(zhì)峰面積均不得大于對照溶液主峰面積的0.6倍（3.0%）；其他各雜質(zhì)峰面積的和不得大于對照溶液主峰面積（5.0%），供試品溶液色譜圖中任何小于對照溶液主峰面積0.01倍的峰可忽略不計(jì)。,樣品峰,雜質(zhì)峰,雜質(zhì)對照品,4.雜質(zhì)對照品法測定雜質(zhì)含量,ChP采用HPLC法對二羥丙茶堿有關(guān)物質(zhì)中茶堿的檢查，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)，不得過0.5%。,示例,頭孢克肟中有關(guān)物質(zhì)檢查 取含量測定項(xiàng)下的樣品溶液1ml，用pH7.0的磷酸緩沖液稀釋定容至100ml，制成濃度為樣品溶液的1/100的對照溶液,HPLC,取對照溶液20l注入液相色譜進(jìn)行預(yù)試，調(diào)節(jié)靈敏度，使主成分峰的峰高約為滿量程的2025，與含量測定項(xiàng)下的供試品溶液比較，供試品溶液的色譜圖中如果有雜質(zhì)峰（溶劑峰除外），雜質(zhì)峰面積的綜合不得大于對照溶液主峰面積的3倍（3） 采用自身對照方法 計(jì)算： 有關(guān)物質(zhì)（3） 3,主峰,A,A主峰,HPLC,計(jì)算： 有關(guān)物質(zhì)（3） 3 （121.588-119.6601）/（1.30313）3 1.48,GC,氣相色譜法用來測定藥物中揮發(fā)性特殊雜質(zhì)，特別是藥物中的殘留溶劑的檢查，各國藥典均采用氣相色譜法。 對于選擇GC測定含量的藥物，也可采用同一色譜條件進(jìn)行雜質(zhì)檢查。,GC,檢查方法 內(nèi)標(biāo)法、外標(biāo)法、面積歸一化法和標(biāo)準(zhǔn)溶液加入法。 標(biāo)準(zhǔn)溶液加入法 精密稱(量)取雜質(zhì)對照品適量，配制成適當(dāng)濃度的對照品溶液，取一定量，精密加入到供試品溶液中，根據(jù)外標(biāo)法或內(nèi)標(biāo)法測定雜質(zhì)含量，再扣除加入的對照品溶液含量，即得供試品中某個(gè)雜質(zhì)的含量。,GC示例,ChP采用內(nèi)標(biāo)法對頭孢地嗪鈉中的殘留溶劑進(jìn)行檢查，按內(nèi)標(biāo)法以峰面積比值計(jì)算，含乙醇不得過2.0%； 采用外標(biāo)法對氨芐西林鈉中的殘留溶劑進(jìn)行檢查，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，含二氯甲烷不得超過0.2%，含丙酮、乙酸乙酯、異丙醇、甲基異丁基酮、甲苯和正丁醇均應(yīng)符合規(guī)定； 采用面積歸一化法對恩氟烷中的有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行檢查，按面積歸一化計(jì)算，各雜質(zhì)峰面積的和不得大于總峰面積的8.0%； 采用標(biāo)準(zhǔn)加入法對氨曲南中的殘留溶劑進(jìn)行檢查，按標(biāo)準(zhǔn)加入法以峰面積計(jì)算，含乙醇不得超過2.0%，其他均應(yīng)符合規(guī)定。,GC,由于氣相色譜法的進(jìn)樣量一般僅數(shù)微升，為減小進(jìn)樣誤差，尤其當(dāng)采用手動(dòng)進(jìn)樣時(shí)，由于留針時(shí)間和室溫等對進(jìn)樣量也有影響，故宜采用內(nèi)標(biāo)法為宜；采用自動(dòng)進(jìn)樣器時(shí)，也可采用外標(biāo)法；采用頂空進(jìn)樣技術(shù)時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)溶液加入法可消除基質(zhì)效應(yīng)的影響；當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)溶液加入法與其他定量方法結(jié)果不一致時(shí)，應(yīng)以標(biāo)準(zhǔn)加入法結(jié)果為準(zhǔn)。,二