藥分高效液相色譜法介紹.ppt

一、高效液相色譜法介紹,高效液相色譜法是以液體作為流動(dòng)相，并彩用顆粒極細(xì)的高效固定相的柱色譜分離技術(shù)。高效液相色譜對樣品的適用性廣，不受分析對象揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，因而彌補(bǔ)了氣相色譜法的不足。在目前已知的有機(jī)化合物中，可用氣相色譜分析的約占20%，而80%則需用高效液相色譜來分析。,二、高效液相色譜法分類,根據(jù)分離機(jī)理可分為： 吸附色譜 鍵合相色譜 離子交換色譜 大小排阻（凝膠）色譜 液-液分配色譜法,（一）吸附色譜分離,吸附色譜法是當(dāng)組分分子流經(jīng)固定相（吸附劑，如硅膠或氧化鋁）時(shí)，不同組分分子、流動(dòng)相分子就要對吸附劑表面的活性中心展開競爭。這種競爭能力的大小，決定了保留值大小，即被活性中心吸附得越牢的分子，保留值越大。,（二）鍵合相色譜分離,鍵合相色譜法是將類似于氣相色譜中的固定液的液體，通過化學(xué)反應(yīng)鍵合到硅膠表面，從而形成固定相。采用化學(xué)鍵合固定相的色譜法稱為鍵合相色譜。若采用極性鍵合相、非極性流動(dòng)相，則稱為正相色譜；采用非極性鍵合相、極性流動(dòng)相，則稱為反相色譜。這種分離的保留值大小，主要決定于組分分子與鍵合固定液分子間作用力的大小。,（三）離子交換色譜分離,離子交換色譜法是流動(dòng)相中的被分離離子，與作為固定相的離子交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時(shí)，它們對交換劑的基體離子親和力大小的不同而達(dá)到分離的。組分離子對交換劑基體離子親和力越大，保留時(shí)間就越長。,（四）大小排阻色譜分離,大小排阻色譜法的固定相是一類孔徑大小有一定范圍的多孔材料。被分離的分子大小不同，它們擴(kuò)散滲入多孔材料的容易程度不同。小分子最易擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)孔中，保留時(shí)間最長；大分子完全排斥在孔外，隨流動(dòng)相很快流出，保留時(shí)間最短。,（五）液-液分配色譜法 分離,液-液分配色譜的固定相和流動(dòng)相是互不相溶的兩種溶劑,分離時(shí),組分溶入兩相,不同的組分因分配系數(shù)(K)的不同而被分離.目前廣泛使用的化學(xué)鍵合固定相是將固定液的官能團(tuán)鍵合在載體上而制成的,使用化學(xué)鍵合固定相的色譜方法(簡稱鍵合相色譜法)可以用分配色譜的原理加以解釋.鍵合相色譜法在HPLC中占有極其重要的地位,是應(yīng)用最廣的色譜法.按照固定相和流動(dòng)相極性的不同,分配色譜法又可分為正相色譜法和反相色譜法兩類.,1.正相色譜法 固定相極性大于流動(dòng)相極性的分配色譜法稱為正相分配色譜法,簡稱為正相色譜法。氰基鍵合硅膠,氨基鍵合硅膠等極性的化學(xué)鍵合固定相是正相色譜常用的固定相,正相色譜的流動(dòng)相一般為極性較小的有機(jī)溶劑.在正相色譜中,極性小的組分由于K值較小先流出,極性較大的組分后流出.正相色譜法用于溶于有機(jī)溶劑的極性及中等極性的分子型物質(zhì)的分離。,2.反相色譜法 流動(dòng)相極性大于固定相極性的分配色譜法稱為反相分配色譜法,簡稱為反相色譜法。反相色譜法使用非極性固定相,最常用的非極性固定相是十八烷基硅烷鍵合硅膠,還有辛烷基硅烷鍵合硅膠等。流動(dòng)相常用水與甲醇,乙腈或四氫呋喃的混合溶劑。在反相色譜中極大的組分因K值較小先流出色譜柱,極性較小的組分后流出.流動(dòng)相中有機(jī)溶劑的比例增加,流動(dòng)相極性減小,洗脫力增強(qiáng).反相色譜法是目前應(yīng)用最廣的高效液相色譜法。,三、高效液相色譜儀簡介,高效液相色譜儀主要由： 輸液系統(tǒng) 進(jìn)樣系統(tǒng) 色譜柱系統(tǒng) 檢測系統(tǒng) 數(shù)據(jù)記錄處理系統(tǒng)等組成。,高效液相色譜儀流程圖,1貯液罐（濾棒，可濾去顆粒狀物質(zhì)） 2高壓泵（輸液泵） 3進(jìn)樣裝置 4色譜柱分離 5檢測器分析 6廢液出口或組分收集器 7記錄裝置,(一)輸液泵 高效液相色譜的流動(dòng)相采用高壓泵輸送,有不同類型的輸液泵,按輸液性質(zhì)可分為恒壓泵和恒流泵.目前使用較多的是柱塞式往復(fù)泵。 (二)進(jìn)樣器 進(jìn)樣器是將試樣送入色譜柱的裝置.一般要求進(jìn)樣裝置的密封性好,死體積小,重復(fù)性好,保證中心進(jìn)樣,進(jìn)樣時(shí)對色譜系統(tǒng)的壓力,流量影響小。,(三)色譜柱 色譜柱是色譜分離的核心.為了保證色譜柱的柱效高,使用壽命長,一般使用由專業(yè)化工廠生產(chǎn)的商品柱.色譜柱管多由不銹鋼制成,內(nèi)裝一定的固定相.色譜往長一般1030cm,內(nèi)徑25mm. 化學(xué)鍵合相是廣泛使用的固定相,其中又以十八烷基硅烷鍵合硅膠的應(yīng)用最為廣泛。,(四)檢測器樣品經(jīng)色譜柱分離后進(jìn)入檢側(cè)器進(jìn)行檢測.按其適用范圍檢測器可分為通用型和專屬型兩大類,專屬型檢測器只能檢測某些組分的某一性質(zhì),紫外檢測器(UVD),熒光檢測器(ED)屬于這一類,它們只對有紫外吸收或熒光發(fā)射的組分有響應(yīng);通用型檢測器檢測的是一般物質(zhì)均具有的性質(zhì),示差折光檢測器(RID),蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)等.液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)則是用質(zhì)譜作為高效液相色譜的檢測器.,(四)檢測器 樣品經(jīng)色譜柱分離后進(jìn)入檢側(cè)器進(jìn)行檢測.按其適用范圍檢測器可分為通用型和專屬型兩大類,專屬型檢測器只能檢測某些組分的某一性質(zhì),紫外檢測器(UVD),熒光檢測器(ED)屬于這一類,它們只對有紫外吸收或熒光發(fā)射的組分有響應(yīng);通用型檢測器檢測的是一般物質(zhì)均具有的性質(zhì),示差折光檢測器(RID),蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)等.液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)則是用質(zhì)譜作為高效液相色譜的檢測器。,(五)數(shù)據(jù)記錄處理和計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng) 現(xiàn)代HPLC的特征是用微機(jī)控制儀器.HPLC儀器的中心計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng),即能做數(shù)據(jù)采集和分析工作,又能程序控制儀器的各個(gè)部件,還能在分析一個(gè)試樣之后自動(dòng)改變條件而進(jìn)行下一個(gè)試樣的分析,許多色譜儀的軟件系統(tǒng)具有方法認(rèn)證功能,使分析工作更加規(guī)范化.,高效液相色譜的特點(diǎn),高壓壓力可達(dá)150300 kg/cm2。色譜柱每米降壓為75 kg/cm2以上。 高速流速為0.110.0 mL/min。 高效塔板數(shù)可達(dá)5000/米。在一根柱中同時(shí)分離成份可達(dá)100種。 高靈敏度紫外檢測器靈敏度可達(dá)0.01ng。同時(shí)消耗樣品少。,四、高效液相色譜法的應(yīng)用,1.在鑒別中的應(yīng)用 在HPLC法中,保留時(shí)間與組分的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)有關(guān),是定性的參數(shù),可用于藥物的鑒別.如中國藥典收載的藥物頭孢羥氨芐的鑒別項(xiàng)下規(guī)定:在含量測定項(xiàng)下記錄的色譜圖中,供試品主峰的保留時(shí)間應(yīng)與對照品主峰的保留時(shí)間一致.頭抱拉定,頭孢噻酚鈉等頭孢類藥物以及地西泮注射液,曲安奈德注射液等多種藥物均采用HPLC法進(jìn)行鑒別。,2.在雜質(zhì)檢查中的應(yīng)用 HPLC分離效能高,靈敏,在藥物的雜質(zhì)檢查中應(yīng)用廣泛.主要用于藥物中有關(guān)物質(zhì)的檢查。“有關(guān)物質(zhì)”是指藥物中存在的合成原料,中間體,副產(chǎn)物,降解產(chǎn)物等物質(zhì),這些物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)與藥物相似,含量很低,只有采用色譜的方法才能將其分離并檢測.若雜質(zhì)是已知的,又有雜質(zhì)的對照品,可用雜質(zhì)對照品做對照進(jìn)行檢查.若雜質(zhì)是未知的,可以采用主成分自身對照法或峰面積歸一化法進(jìn)行檢查。,面積歸一化法 測定供試品（或經(jīng)衍生化處理的供試品）中各雜質(zhì)及雜質(zhì)的總量限度采用不加校正因子的峰面積歸一法。 計(jì)算各雜質(zhì)峰面積及其總和，并求出占總峰面積的百分率。但溶劑峰不計(jì)算在內(nèi)。 色譜的記錄時(shí)間應(yīng)根據(jù)各品種所含雜質(zhì)的保留時(shí)間決定，除另有規(guī)定外,可為該品種項(xiàng)下主成分保留時(shí)間的倍數(shù)。,主成分自身對照法 當(dāng)雜質(zhì)峰面積與成分峰面積相差懸殊時(shí)，采用主成分自身對照法。 在測定前，先按各品種項(xiàng)下規(guī)定的雜質(zhì)限度，將供試品稀釋成一定濃度的溶液作為對照溶液，進(jìn)樣，調(diào)節(jié)檢測器的靈敏度或進(jìn)樣量，使對照溶液中的主成分色譜峰面積滿足準(zhǔn)確測量要求。然后取供試品溶液，進(jìn)樣，記錄時(shí)間，除另有規(guī)定外，應(yīng)為主成分保