GB4789.3-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù).pdf

中 華 人 民 共 和 國(guó) 國(guó) 家 標(biāo) 準(zhǔn)G B4 7 8 9 .32 0 1 6食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)2 0 1 6 - 1 2 - 2 3發(fā)布2 0 1 7 - 0 6 - 2 3實(shí)施中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)國(guó) 家 食 品 藥 品 監(jiān) 督 管 理 總 局發(fā) 布G B4 7 8 9.32 0 1 6 前 言 本標(biāo)準(zhǔn)代替G B4 7 8 9. 32 0 1 0 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸 菌群計(jì)數(shù) 、G B/T4 7 8 9.3 22 0 0 2 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群的快速檢測(cè) 和S N/T0 1 6 92 0 1 0 進(jìn)出口食品中大腸菌群、 糞大腸菌群和大腸桿菌檢測(cè)方法 大腸菌群計(jì)數(shù)部分。本標(biāo)準(zhǔn)與G B4 7 8 9.32 0 1 0相比, 主要變化如下: 增加了檢驗(yàn)原理; 修改了適用范圍; 修改了典型菌落的形態(tài)描述; 修改了第二法平板菌落數(shù)的選擇; 修改了第二法證實(shí)試驗(yàn); 修改了第二法平板計(jì)數(shù)的報(bào)告。G B4 7 8 9.32 0 1 61 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中大腸菌群(C o l i f o r m s) 計(jì)數(shù)的方法。本標(biāo)準(zhǔn)第一法適用于大腸菌群含量較低的食品中大腸菌群的計(jì)數(shù); 第二法適用于大腸菌群含量較高的食品中大腸菌群的計(jì)數(shù)。2 術(shù)語和定義2.1 大腸菌群 C o l i f o r m s在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖、 產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞桿菌。2.2 最可能數(shù) M o s tp r o b a b l en u m b e r;MP N基于泊松分布的一種間接計(jì)數(shù)方法。3 檢驗(yàn)原理3.1 MP N法MP N法是統(tǒng)計(jì)學(xué)和微生物學(xué)結(jié)合的一種定量檢測(cè)法。待測(cè)樣品經(jīng)系列稀釋并培養(yǎng)后, 根據(jù)其未生長(zhǎng)的最低稀釋度與生長(zhǎng)的最高稀釋度, 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)概率論推算出待測(cè)樣品中大腸菌群的最大可能數(shù)。3.2 平板計(jì)數(shù)法大腸菌群在固體培養(yǎng)基中發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸, 在指示劑的作用下形成可計(jì)數(shù)的紅色或紫色, 帶有或不帶有沉淀環(huán)的菌落。4 設(shè)備和材料除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外, 其他設(shè)備和材料如下:4.1 恒溫培養(yǎng)箱:3 6 1。4.2 冰箱:25。4.3 恒溫水浴箱:4 61。4.4 天平: 感量0.1g。4.5 均質(zhì)器。4.6 振蕩器。4.7 無菌吸管:1m L( 具0.0 1m L刻度) 、1 0m L( 具0.1m L刻度) 或微量移液器及吸頭。4.8 無菌錐形瓶: 容量5 0 0m L。4.9 無菌培養(yǎng)皿: 直徑9 0mm。G B4 7 8 9.32 0 1 62 4.1 0 p H計(jì)或p H比色管或精密p H試紙。4.1 1 菌落計(jì)數(shù)器。5 培養(yǎng)基和試劑5.1 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(l a u r y l s u l f a t e t r y p t o s e,L S T) 肉湯: 見A.1。5.2 煌綠乳糖膽鹽(b r i l l i a n tg r e e nl a c t o s eb i l e,B G L B) 肉湯: 見A.2。5.3 結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(v i o l e t r e db i l ea g a r,V R B A) : 見A.3。5.4 無菌磷酸鹽緩沖液: 見A.4。5.5 無菌生理鹽水: 見A.5。5.6 1m o l/LN a OH溶液: 見A.6。5.7 1m o l/LHC l溶液: 見A.7。第一法 大腸菌群MP N計(jì)數(shù)法6 檢驗(yàn)程序大腸菌群MP N計(jì)數(shù)的檢驗(yàn)程序見圖1。圖1 大腸菌群MP N計(jì)數(shù)法檢驗(yàn)程序G B4 7 8 9.32 0 1 63 7 操作步驟7.1 樣品的稀釋7.1.1 固體和半固體樣品: 稱取2 5g樣品, 放入盛有2 2 5m L磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi) ,80 0 0r/m i n 1 00 0 0r/m i n均質(zhì)1m i n 2m i n, 或放入盛有2 2 5m L磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中, 用拍擊式均質(zhì)器拍打1m i n 2m i n, 制成11 0的樣品勻液。7.1.2 液體樣品: 以無菌吸管吸取2 5m L樣品置盛有2 2 5m L磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶( 瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠) 或其他無菌容器中充分振搖或置于機(jī)械振蕩器中振搖, 充分混勻, 制成11 0的樣品勻液。7.1.3 樣品勻液的p H應(yīng)在6.57.5之間, 必要時(shí)分別用1m o l/LN a OH或1m o l/LHC l調(diào)節(jié)。7.1.4 用1m L無菌吸管或微量移液器吸取11 0樣品勻液1m L, 沿管壁緩緩注入9m L磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌試管中( 注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面) , 振搖試管或換用1支1m L無菌吸管反復(fù)吹打, 使其混合均勻, 制成11 0 0的樣品勻液。7.1.5 根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì), 按上述操作, 依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次,換用1支1m L無菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢, 全過程不得超過1 5m i n。7.2 初發(fā)酵試驗(yàn)每個(gè)樣品, 選擇3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液( 液體樣品可以選擇原液) , 每個(gè)稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(L S T) 肉湯, 每管接種1m L( 如接種量超過1m L, 則用雙料L S T肉湯) ,3 61培養(yǎng)2 4h2h, 觀察倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生,2 4h2h產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)( 證實(shí)試驗(yàn)) , 如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至4 8h2h, 產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性。7.3 復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)( 證實(shí)試驗(yàn))用接種環(huán)從產(chǎn)氣的L S T肉湯管中分別取培養(yǎng)物1環(huán),移種于煌綠乳糖膽鹽肉湯(B G L B)管中,3 61培養(yǎng)4 8h2h, 觀察產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣者, 計(jì)為大腸菌群陽性管。7.4 大腸菌群最可能數(shù)(MP N) 的報(bào)告按7.3確證的大腸菌群B G L B陽性管數(shù), 檢索MP N表( 見附錄B) , 報(bào)告每g(m L) 樣品中大腸菌群的MP N值。第二法 大腸菌群平板計(jì)數(shù)法8 檢驗(yàn)程序大腸菌群平板計(jì)數(shù)法的檢驗(yàn)程序見圖2。G B4 7 8 9.32 0 1 64 圖2 大腸菌群平板計(jì)數(shù)法檢驗(yàn)程序9 操作步驟9.1 樣品的稀釋按7.1進(jìn)行。9.2 平板計(jì)數(shù)9.2.1 選取2個(gè)3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度,每個(gè)稀釋度接種2個(gè)無菌平皿, 每皿1m L。同時(shí)取1m L生理鹽水加入無菌平皿作空白對(duì)照。9.2.2 及時(shí)將1 5m L2 0m L融化并恒溫至4 6的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(V R B A) 約傾注于每個(gè)平皿中。小心旋轉(zhuǎn)平皿, 將培養(yǎng)基與樣液充分混勻, 待瓊脂凝固后, 再加3m L4m L V R B A覆蓋平板表層。翻轉(zhuǎn)平板, 置于3 61培養(yǎng)1 8h2 4h。9.3 平板菌落數(shù)的選擇選取菌落數(shù)在1 5C F U1 5 0C F U之間的平板, 分別計(jì)數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落( 如菌落直徑較典型菌落小) 。典型菌落為紫紅色, 菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán), 菌落直徑為0.5mm或更大, 最低稀釋度平板低于1 5C F U的記錄具體菌落數(shù)。9.4 證實(shí)試驗(yàn)從V R B A平板上挑取1 0個(gè)不同類型的典型和可疑菌落, 少于1 0個(gè)菌落的挑取全部典型和可疑菌落。分別移種于B G L B肉湯管內(nèi),3 61培養(yǎng)2 4h4 8h, 觀察產(chǎn)氣情況。凡B G L B肉湯管產(chǎn)氣,即可報(bào)告為大腸菌群陽性。G B4 7 8 9.32 0 1 65 9.5 大腸菌群平板計(jì)數(shù)的報(bào)告經(jīng)最后證實(shí)為大腸菌群陽性的試管比例乘以9.3中計(jì)數(shù)的平板菌落數(shù), 再乘以稀釋倍數(shù), 即為每g(m L)樣品中大腸菌群數(shù)。例:1 0-4樣品稀釋液1m L, 在V R B A平板上有1 0 0個(gè)典型和可疑菌落, 挑取其中1 0個(gè)接種B G L B肉湯管, 證實(shí)有6個(gè)陽性管, 則該樣品的大腸菌群數(shù)為:1 0 0 6/1 0 1 04/g(m L)=6.01 05C F U/g(m L) 。若所有稀釋度( 包括液體樣品原液) 平板均無菌落生長(zhǎng), 則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計(jì)算。G B4 7 8 9.32 0 1 66 附 錄 A培養(yǎng)基和試劑A.1 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(L S T) 肉湯A.1.1 成分胰蛋白胨或胰酪胨2 0.0g氯化鈉5.0g乳糖5.0g磷酸氫二鉀(K2H P O4)2.7 5g磷酸二氫鉀(KH2P O4)2.7 5g月桂基硫酸鈉0.1g蒸餾水10 0 0m LA.1.2 制法將上述成分溶解于蒸餾水中, 調(diào)節(jié)p H至6.80.2。分裝到有玻璃小倒管的試管中, 每管1 0m L。1 2 1高壓滅菌1 5m i n。A.2 煌綠乳糖膽鹽(B G L B) 肉湯A.2.1 成分蛋白胨1 0.0g乳糖1 0.0g牛膽粉(o x g a l l或o x b i l e) 溶液2 0 0m L0.1%煌綠水溶液1 3.3m L蒸餾水8 0 0m LA.2.2 制法將蛋白胨、 乳糖溶于約5 0 0m L蒸餾水中, 加入牛膽粉溶液2 0 0m L( 將2 0.0g脫水牛膽粉溶于2 0 0m L蒸餾水中, 調(diào)節(jié)p H至7.07.5) , 用蒸餾水稀釋到9 7 5m L, 調(diào)節(jié)p H至7.20.1, 再加入0.1%煌綠水溶液1 3.3m L, 用蒸餾水補(bǔ)足到10 0 0m L, 用棉花過濾后, 分裝到有玻璃小倒管的試管中, 每管1 0m L。1 2 1高壓滅菌1 5m i n。A.3 結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(V R B A)A.3.1 成分蛋白胨7.0g酵母膏3.0g乳糖1 0.0gG B4 7 8 9.32 0 1 67 氯化鈉5.0g膽鹽或3號(hào)膽鹽1.5g中性紅0.0 3g結(jié)晶紫0.0 0 2g瓊脂1 5g 1 8g蒸餾水10 0 0m LA.3.2 制法將上述成分溶于蒸餾水中, 靜置幾分鐘, 充分?jǐn)嚢? 調(diào)節(jié)p H至7.40.1。煮沸2m i n, 將培養(yǎng)基融化并恒溫至4 55 0傾注平板。使用前臨時(shí)制備, 不得超過3h。A.4 磷酸鹽緩沖液A.4.1 成分磷酸二氫鉀(KH2P O4)3 4.0g蒸餾水5 0 0m LA.4.2 制法貯存液: 稱取3 4.0g的磷酸二氫鉀溶于5 0 0m L蒸餾水中, 用大約1 7 5m L的1m o l/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)p H至7.20.2, 用蒸餾水稀釋至10 0 0m L后貯存于冰箱。稀釋液: 取貯存液1.2 5m L, 用蒸餾水稀釋至10 0 0m L, 分裝于適宜容器中,1 2 1高壓滅菌1 5m i n。A.5 無菌生理鹽水A.5.1 成分氯化鈉8.5g蒸餾水10 0 0m LA.5.2 制法稱取8.5g氯化鈉溶于10 0 0m L蒸餾水中,1 2 1高壓滅菌1 5m i n。A.6 1m o l/LN a O H溶液A.6.1 成分N a OH4 0.0g蒸餾水10 0 0m LA.6.2 制法稱取4 0g氫氧化鈉溶于10 0 0m L無菌蒸餾水中。G B4 7 8 9.32 0 1 68 A.7 1m o l/LH C l溶液A.7.1 成分HC l9 0m L蒸餾水10 0 0m LA.7.2 制法移取濃鹽酸9 0m L, 用無菌蒸餾水稀釋至10 0 0m L。G B4 7 8 9.32 0 1 69 附 錄 B大腸菌群最可能數(shù)(MP N) 檢索表B.1 大腸菌群最可能數(shù)(MP N) 檢索表每g(m L) 檢樣中大腸菌群最可能數(shù)(MP N) 的檢索見表B.1。表B.1 大腸菌群最可能數(shù)(MP N) 檢索表陽性管數(shù)0.1 00.0 10.0 0 1MP N9 5