GB4789.35-2010食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗.pdf

中華人民共和國國家標準中華人民共和國國家標準GB 4789.352010 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗 National food safety standard Food microbiological examination: Lactic acid bacteria 中 華 人 民 共 和 國 衛(wèi) 生 部中 華 人 民 共 和 國 衛(wèi) 生 部 發(fā)布 2010-03-26 發(fā)布 2010-06-01 實施GB 4789.352010 I 前 言 本標準代替GB/T 4789.35-2008食品衛(wèi)生微生物學檢驗 食品中乳酸菌檢驗。 本標準與GB/T 4789.35-2008相比，主要變化如下： 修改了乳酸菌總數(shù)、乳桿菌、雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌的計數(shù)方法。 本標準的附錄A為規(guī)范性附錄。 本標準所代替標準的歷次版本發(fā)布情況為： GB 4789.35-1996、GB/T 4789.35-2003、GB/T 4789.35-2008。 GB 4789.352010 1 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗 1 范圍 本標準規(guī)定了含乳酸菌食品中乳酸菌（lactic acid bacteria）的檢驗方法。 本標準適用于含活性乳酸菌的食品中乳酸菌的檢驗。 2 規(guī)范性引用文件 本標準中引用的文件對于本標準的應(yīng)用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 僅所注日期的版本適用于本標準。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本標準。 3 術(shù)語和定義 3.1 乳酸菌 lactic acid bacteria 一類可發(fā)酵糖主要產(chǎn)生大量乳酸的細菌的通稱。本標準中乳酸菌主要為乳桿菌屬（Lactobacillus） 、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）和鏈球菌屬（Streptococcus） 。 4 設(shè)備和材料 除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下： 4.1 恒溫培養(yǎng)箱：36 1 。 4.2 冰箱：2 5 。 4.3 均質(zhì)器及無菌均質(zhì)袋、均質(zhì)杯或滅菌乳缽。 4.4 天平：感量 0.1 g。 4.5 無菌試管：18 mm180 mm、15 mm100 mm。 4.6 無菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度）、10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸頭。 4.7 無菌錐形瓶：500 mL、250 mL。 5 培養(yǎng)基和試劑 5.1 MRS（Man Rogosa Sharpe）培養(yǎng)基及莫匹羅星鋰鹽（Li-Mupirocin）改良 MRS 培養(yǎng)基：見附錄 A 中 A.1。 5.2 MC 培養(yǎng)基（Modified Chalmers 培養(yǎng)基）：見附錄 A 中 A.2。 5.3 0.5 %蔗糖發(fā)酵管：見附錄 A 中 A.3。 GB 4789.352010 2 5.4 0.5 %纖維二糖發(fā)酵管：見附錄 A 中 A.3。 5.5 0.5 %麥芽糖發(fā)酵管：見附錄 A 中 A.3。 5.6 0.5 %甘露醇發(fā)酵管：見附錄 A 中 A.3。 5.7 0.5 %水楊苷發(fā)酵管：見附錄A中A.3。 5.8 0.5 %山梨醇發(fā)酵管：見附錄A中A.3。 5.9 0.5 %乳糖發(fā)酵管：見附錄A中A.3。 5.10 七葉苷發(fā)酵管：見附錄A中A.4。 5.11 革蘭氏染色液：見附錄A中A.5。 5.12 莫匹羅星鋰鹽（Li-Mupirocin）：化學純。 GB 4789.352010 3 6 檢驗程序 乳酸菌檢驗程序見圖1。 圖1 乳酸菌檢驗程序圖 7 操作步驟 7.1 樣品制備 7.1.1 樣品的全部制備過程均應(yīng)遵循無菌操作程序。 7.1.2 冷凍樣品可先使其在 2 5 條件下解凍，時間不超過 18 h，也可在溫度不超過 45 的條件解凍，時間不超過 15 min。 乳桿菌計數(shù) 乳酸菌總數(shù)減去雙歧桿菌與嗜熱鏈球菌計數(shù)之和 挑取雙歧桿菌或乳桿菌菌落接種于 MRS 瓊脂平板，嗜熱鏈球菌接種于 MC 瓊脂平板（可選做） 報告 菌種鑒定 樣品 25 g（mL）+225 mL 無菌生理鹽水 10 倍系列稀釋 選擇 2 個3 個適宜稀釋度，各以 0.1 mL 加入到 MRS 平板 進行涂布 選擇 2 個3 個適宜稀釋度，各以 0.1 mL 加入到 MC 平板進行涂布 選擇 2 個3 個適宜稀釋度，各以 0.1 mL 加入到莫匹羅星鋰鹽（Li-Mupirocin）改良 MRS 平板進行涂布厭氧， 36 1 ， 48 h2 h 需氧， 36 1 ， 48 h2 h 厭氧， 36 1 ， 48 h2 h 乳酸菌總數(shù)計數(shù) 雙歧桿菌計數(shù) 嗜熱鏈球菌計數(shù) GB 4789.352010 4 7.1.3 固體和半固體食品：以無菌操作稱取 25 g 樣品，置于裝有 225 mL 生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，于 8000 r/min10000 r/min 均質(zhì) 1 min2 min，制成 1:10 樣品勻液；或置于 225 mL 生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打 1 min2 min 制成 1:10 的樣品勻液。 7.1.4 液體樣品：液體樣品應(yīng)先將其充分搖勻后以無菌吸管吸取樣品 25 mL 放入裝有 225 mL 生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內(nèi)預(yù)置適當數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分振搖，制成 1:10 的樣品勻液。 7.2 步驟 7.2.1 用 1 mL 無菌吸管或微量移液器吸取 1:10 樣品勻液 1 mL，沿管壁緩慢注于裝有 9 mL 生理鹽水的無菌試管中 （注意吸管尖端不要觸及稀釋液） ， 振搖試管或換用 1 支無菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成 1:100 的樣品勻液。 7.2.2 另取 1 mL 無菌吸管或微量移液器吸頭，按上述操作順序，做 10 倍遞增樣品勻液，每遞增稀釋一次，即換用 1 次 1 mL 滅菌吸管或吸頭。 7.2.3 乳酸菌計數(shù) 7.2.3.1 乳酸菌總數(shù) 根據(jù)待檢樣品活菌總數(shù)的估計，選擇 2 個3 個連續(xù)的適宜稀釋度，每個稀釋度吸取 0.1 mL 樣品勻液分別置于 2 個 MRS 瓊脂平板，使用 L 形棒進行表面涂布。361，厭氧培養(yǎng) 48 h2 h 后計數(shù)平板上的所有菌落數(shù)。從樣品稀釋到平板涂布要求在 15min 內(nèi)完成。 7.2.3.2 雙歧桿菌計數(shù) 根據(jù)對待檢樣品雙歧桿菌含量的估計，選擇 2 個3 個連續(xù)的適宜稀釋度，每個稀釋度吸取 0.1 mL樣品勻液于莫匹羅星鋰鹽（Li-Mupirocin）改良 MRS 瓊脂平板，使用滅菌 L 形棒進行表面涂布，每個稀釋度作兩個平板。361，厭氧培養(yǎng) 48 h2 h 后計數(shù)平板上的所有菌落數(shù)。從樣品稀釋到平板涂布要求在 15 min 內(nèi)完成。 7.2.3.3 嗜熱鏈球菌計數(shù) 根據(jù)待檢樣品嗜熱鏈球菌活菌數(shù)的估計， 選擇2個3個連續(xù)的適宜稀釋度， 每個稀釋度吸取0.1 mL樣品勻液分別置于 2 個 MC 瓊脂平板，使用 L 形棒進行表面涂布。361，需氧培養(yǎng) 48 h2 h 后計數(shù)。 嗜熱鏈球菌在 MC 瓊脂平板上的菌落特征為： 菌落中等偏小， 邊緣整齊光滑的紅色菌落， 直徑 2 mm1 mm，菌落背面為粉紅色。從樣品稀釋到平板涂布要求在 15 min 內(nèi)完成。 7.2.3.4 乳桿菌計數(shù) 7.2.3.1 項乳酸菌總數(shù)結(jié)果減去7.2.3.2 項雙歧桿菌與7.2.3.3 項嗜熱鏈球菌計數(shù)結(jié)果之和即得乳桿菌計數(shù)。 7.3 菌落計數(shù) 可用肉眼觀察，必要時用放大鏡或菌落計數(shù)器，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。菌落計數(shù)以菌落形成單位（colony-forming units，CFU）表示。 7.3.1 選取菌落數(shù)在 30 CFU300 CFU 之間、無蔓延菌落生長的平板計數(shù)菌落總數(shù)。低于 30 CFU 的平板記錄具體菌落數(shù)，大于 300 CFU 的可記錄為多不可計。每個稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個平板的平均數(shù)。 7.3.2 其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計算半個平板后乘以2，代表一個平板菌落數(shù)。 7.3.3 當平板上出現(xiàn)菌落間無明顯界線的鏈狀生長時，則將每條單鏈作為一個菌落計數(shù)。 GB 4789.352010 5 7.4 結(jié)果的表述 7.4.1 若只有一個稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內(nèi)，計算兩個平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每 g（mL）中菌落總數(shù)結(jié)果。 7.4.2 若有兩個連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內(nèi)時，按公式（1）計算： (1) 式中： N樣品中菌落數(shù)； C平板（含適宜范圍菌落數(shù)的平板）菌落數(shù)之和； n1第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）平板個數(shù)； n2第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）平板個數(shù)； d稀釋因子（第一稀釋度） 。 7.4.3 若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均大于 300 CFU，則對稀釋度最高的平板進行計數(shù)，其他平板可記錄為多不可計，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計算。 7.4.4 若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于 30 CFU，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。 7.4.5 若所有稀釋度（包括液體樣品原液）平板均無菌落生長，則以小于 1 乘以最低稀釋倍數(shù)計算。 7.4.6 若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在30 CFU300 CFU之間， 其中一部分小于30 CFU或大于300 CFU 時，則以最接近 30 CFU 或 300 CFU 的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。 7.5 菌落數(shù)的報告 7.5.1 菌落數(shù)小于 100 CFU 時，按“四舍五入”原則修約，以整數(shù)報告。 7.5.2 菌落數(shù)大于或等于 100 CFU 時，第 3 位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后，取前 2 位數(shù)字，后面用 0 代替位數(shù)；也可用 10 的指數(shù)形式來表示，按“四舍五入”原則修約后，采用兩位有效數(shù)字。 7.5.3 稱重取樣以 CFU/g 為單位報告，體積取樣以 CFU/mL 為單位報告。 8 結(jié)果與報告 根據(jù)菌落計數(shù)結(jié)果出具報告，報告單位以CFU/g（mL）表示。 9 乳酸菌的鑒定（可選做） 9.1 純培養(yǎng) 挑取 3 個或以上單個菌落，嗜熱鏈球菌接種于 MC 瓊脂平板，乳桿菌屬接種于 MRS 瓊脂平板，置36 1 厭氧培養(yǎng) 48 h。 9.2 鑒定 9.2.1 雙歧桿菌的鑒定按 GB/T 4789.34 的規(guī)定操作。 9.2.2 涂片鏡檢：乳桿菌屬菌體形態(tài)多樣，呈長桿狀、彎曲桿狀或短桿狀。無芽胞，革蘭氏染色陽性。嗜熱鏈球菌菌體呈球形或球桿狀， 直徑為 0.5 m2.0 m， 成對或成鏈排列， 無芽胞， 革蘭氏染色陽性。 9.2.3 乳酸菌菌種主要生化反應(yīng)見表 1 和表 2。 dnnCN)1 . 0(21+=GB 4789.352010 6 表1 常見乳桿菌屬內(nèi)種的碳水化合物反應(yīng) 表2 嗜熱鏈球菌的主要生化反應(yīng) 菌種 菊糖 乳糖 甘露醇 水楊苷 山梨醇 馬尿酸 七葉苷 嗜熱鏈球菌（S.thermophilus） 注:+表示90以上菌株陽性；表示90以上菌株陰性。 菌種 七葉苷 纖維二糖 麥芽糖 甘露醇 水楊苷 山梨醇 蔗糖 棉子糖 干酪乳桿菌干酪亞種（L.casei subsp. casei） 德氏乳桿菌保加利亞種（L.delbrueckii subsp. bulgaricus） 嗜酸乳桿菌（L.acidophilus） d 羅伊氏乳桿菌（L.reuteri） ND 鼠李糖乳桿菌（L.rhamnosus） 植物乳桿菌（L.plantarum） 注:+表示90以上菌株陽性；表示90以上菌株陰性；d表示11%89%菌株陽性；ND表示未測定。 GB 4789.352010 7 附錄 A （規(guī)范性附錄） 培養(yǎng)基及試劑 A.1 MRS 培養(yǎng)基 A.1.1 成分 蛋白胨 10.0 g牛肉粉 5.0 g酵母粉 4.0 g葡萄糖 20.0 g吐溫 80 1.0 mLK2HPO47H2O 2.0 g醋酸鈉3H2O 5.0 g檸檬酸三銨 2.0 gMgSO47H2O 0.2 gMnSO44H2O 0.05 g瓊脂粉 pH 6.2 15.0 gA.1.2 制法 將上述成分加入到 1000 mL 蒸餾水中， 加熱溶解， 調(diào)節(jié) pH， 分裝后 121 高壓滅菌 15 min20 min。 A.1.3 莫匹羅星鋰鹽（Li-Mupirocin）改良 MRS 培養(yǎng)基 A.1.3.1 莫匹羅星鋰鹽（Li-Mupirocin）儲備液制備：稱取 50mg 莫匹羅星鋰鹽（Li-Mupirocin）加入到 50 mL 蒸餾水中，用 0.22 m 微孔濾膜過濾除菌。 A.1.3.2 制法 將 A.1.1 成分加入到 950 mL 蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)節(jié) pH，分裝后于 121 高壓滅菌 15 min20 min。臨用時加熱熔化瓊脂，在水浴中冷至 48 ，用帶有 0.22 m 微孔濾膜的注射器將莫匹羅星鋰鹽（Li-Mupirocin）儲備液加入到熔化瓊脂中，使培養(yǎng)基中莫匹羅星鋰鹽（Li-Mupirocin）的濃度為 50 g/mL。 A.2 MC 培養(yǎng)基 A.2.1 成分 大豆蛋白胨 5.0 g牛肉粉 3.0 g酵母粉 3.0 g葡萄糖 20.0 g乳糖 20.0 g碳酸鈣 10.0 g瓊脂 15.0 g蒸餾水 1 000 mL1中性紅溶液 pH6.0 5.0 mLGB 4789.352010 8 A.2.2 制法 將前面 7 種成分加入蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)節(jié) pH，加入中性紅溶液。分裝后 121 高壓滅菌 15 min20 min。 A.3 乳酸桿菌糖發(fā)酵管 A.3.1 基礎(chǔ)成分 牛肉膏 5.0 g蛋白胨 5.0 g酵母浸膏 5.0 g吐溫 80 0.5 mL瓊脂 1.5 g1.6%溴甲酚紫酒精溶液 1.4 mL蒸餾水 1 000 mLA.3.2 制法 按 0.5%加入所需糖類，并分裝小