利用酵母菌生產蛋白質.ppt

第5章 利用酵母菌生產蛋白質,概述 酵母菌的基因組結構及其特點 酵母表達系統(tǒng) 影響酵母菌中外源基因表達的調控因子 外源基因的表達及產物分泌,酵母細胞模式圖,1、概述,細菌細胞,外源蛋白表達系統(tǒng),原核表達系統(tǒng),- 高水平表達 為還原性內環(huán)境，不能形成二硫鍵，某些蛋白不能進行有效折疊,1,外源蛋白表達系統(tǒng),原核表達系統(tǒng),- 高水平表達 為還原性內環(huán)境，不能形 成二硫鍵，某些蛋白不能 進行有效折疊,1,真核表達系統(tǒng),相對高水平表達 可發(fā)生一定程度的翻譯后修飾作 用，有利于實現(xiàn)完整蛋白功能,2,外源蛋白表達系統(tǒng),原核表達系統(tǒng),- 高水平表達 為還原性內環(huán)境，不能形 成二硫鍵，某些蛋白不能 進行有效折疊,1,真核表達系統(tǒng),相對高水平表達 可發(fā)生一定程度的翻譯后修飾作 用，有利于實現(xiàn)完整蛋白功能,2,哺乳細胞系統(tǒng),- 完備的翻譯后修飾系統(tǒng) - 低表達水平,3,蛋白質表達系統(tǒng)的選擇,細菌,哺乳動物細胞,昆蟲細胞,酵母菌,增加,人培養(yǎng)細胞,品質, 細菌 酵母菌 昆蟲細胞 哺乳動物細胞,產量,蛋白質產品,一級結構,二級結構,三級結構,四級結構,螺旋,折疊,高級結構, 切割前體。 前體蛋白中的某些氨基酸序列如信號肽的切出，形成有功能的蛋白質。 蛋白質的糖基化。 是將寡糖連接到一個蛋白質分子上，是真核生物細胞表達基因產物時最重要的一種翻譯后修飾作用。 作用： i. 有利于保證所表達的蛋白質進行適當?shù)恼郫B； ii. 保護蛋白質免受細胞蛋白酶的降解。 最常見的是O-糖基化（加在Ser, Thr上）和N-糖基化（加在Asn上）。酵母菌中的寡糖通常含有大量的甘露糖殘基。,多糖和蛋白質在細胞壁上的連接方式,2. O-glycosidic linkage,1. N-glycosidic linkage,一般酵母菌中的寡糖,1,2,酵母菌突變株mnn9中的寡糖,在酵母菌中的糖基化只能添加富含甘露糖的寡糖，而不形成象高等動物細胞中普遍存在的那種糖蛋白復合物。這種糖基化有時會影響蛋白質的折疊和對蛋白酶的敏感性，更重要的是會影響蛋白質在生物體內的半衰期。, 對氨基酸的修飾作用。 包括磷酸化、甲基化、乙?；?、硫酸化、丙烯酸化、羧酸化、豆蔻酸化及軟脂?；?。,在原核生物中，可分泌蛋白質是由N末端信號序列控制合成的，然后通過細胞膜上的“SecY-SecD-SecE-SecF”組成的蛋白質復合物分泌出去。,（3） 真核細胞與原核細胞的蛋白質分泌途徑,在酵母菌中，分泌蛋白的信號序列為信號識別顆粒（SRF）所識別。SRF包含6種蛋白質分子，并由一個小的RNA分子將其串連在一起。通過SRF與其在膜表面上的受體之間的識別與結合，引導新生蛋白到達蛋白質的輸出結構，該結構位于粗糙內質網(wǎng)的特異性位點上。,在原核生物中LPS的產生。LPS的毒性； 酵母菌：細胞組分和代謝物對人體是安全的。,（4） 安全性,選擇性標記基因 啟動子 轉錄、翻譯終止信號 給mRNA加上poly(A) 復制起始位點,酵母菌表達系統(tǒng),2、釀酒酵母基因組結構及其特點 1996年 完成全長為12Mb釀酒酵母基因組的測序。 釀酒酵母是一種重要的模式生物，也是第一個被測序的真核生物。它有16條染色體，基因組全長為12Mb，含有6000多個基因。它的基因組的測序是作為HGP的一部分于上世紀80年代末期啟動，于1996年完成。1997年Nature專門為釀酒酵母基因組發(fā)行了增刊。,釀酒酵母的基因組很小，僅有16條染色體。,釀酒酵母細胞既可以作為單倍體存在，也可以作為二倍體存在有利于發(fā)現(xiàn)隱性基因。,12068 kb,5109bp,3.5109bp,1.8108bp,4106bp,基因組全長12068kb，有5885個編碼專一性蛋白質的開放閱讀框。酵母基因組中平均每隔2kb就存在一個編碼蛋白質的基因，即整個基因組有72的核苷酸順序由開放閱讀框組成。 酵母基因組的基因間隔區(qū)較短，基因中內含子稀少。其開放閱讀框平均長度為1450bp即483個密碼子，最長的是位于XII號染色體上的一個功能未知的開放閱讀框(4910個密碼子)，還有極少數(shù)的開放閱讀框長度超過1500個密碼子。 酵母基因組中還包含：約140個編碼RNA的基因，排列在XII號染色體的長末端； 40個編碼snRNA的基因，散布于16條染色體； 屬于43個家族的275個tRNA基因也廣泛分布于基因組中。,2.1 釀酒酵母基因組的結構,釀酒酵母基因組的結構,6108,2.2 酵母菌基因組結構的特征,酵母染色體由大范圍的GC豐富DNA序列和GC缺乏DNA序列鑲嵌組成。GC含量高的區(qū)域一般位于染色體臂的中部，這些區(qū)域的基因密度較高；GC含量低的區(qū)域一般靠近端粒和著絲粒，這些區(qū)域內基因數(shù)目較為貧乏； 酵母基因組另一個明顯的特征是含有許多DNA重復序列，其中一部分為完全相同的DNA序列，如rDNA與CUP1基因、Ty因子及其衍生的單一LTR序列等。,S. cerevisiae基因組的測序被稱為現(xiàn)代分子生物學歷史上最為分散的實驗。包括美國、加拿大、歐洲、日本等國家在內的100多個實驗室，超過600多名科學家都參與了這項工作。 酵母菌研究社群(the yeast community)，在Andre Goffeau教授(the Universite Catholique de Louvain in Belgium)的領導下，樹立了一個效率，合作，組織的典范。這樣一種國際合作也是基因組學研究的一個重要特點。,3、釀酒酵母基因表達系統(tǒng) 釀酒酵母作為受體菌的優(yōu)勢： （1）為單細胞真核生物，對其遺傳學和生理學的研究較為深入； （2）能快速生長； （3）具有啟動活性強的酵母基因啟動子； （4）具有內源表達載體和眾多的商業(yè)化載體（如Invitrogen）； （5）可以對所表達的蛋白質進行多種翻譯后修飾； （6）其自然分泌的蛋白質很少，產物處理方便簡單； （7）具有較高的安全性。被美國食品和醫(yī)藥管理局（FDA）確認 為一種安全的生物（generanlly recognized as safe, GRAS）。,3.1 酵母菌標記基因leu2的克隆 leu2編碼-異丙基蘋果酸脫氫酶（ - isopropylmalate dehydrogenase），該酶在亮氨酸的合成途徑中有重要作用。 克隆步驟： （1）提取酵母菌染色體DNA，經適當酶切，建立基因文 庫（質粒載體，在E. coli中可復制）； （2）將攜帶酵母菌基因的質粒電轉化E. coli -異丙基蘋果 酸脫氫酶缺陷型突變株LeuB，用不含Leu的培養(yǎng)基進 行篩選轉化子； （3）抽提轉化子質粒DNA，酶切驗證后，進行序列分析； （4）leu2基因的結構確認（啟動子、RBS、起始序列、終 止序列與堿基數(shù)等）。,釀酒酵母選擇性標記基因leu2的克隆示意圖,3.2 酵母菌表達系統(tǒng)常用載體 釀酒酵母表達系統(tǒng)的常用載體通常有：質粒載體、整合載體和酵母人工染色體。 3.2.1 質粒載體 酵母質粒載體通常又可以分為酵母附加型載體(Yeast episomal plasmid, YEp)、酵母復制質粒（Yeast replicating plasmid, YRp）和酵母著絲粒質粒（Yeast centromere plasmid, YCp）三類。 （1）YEp 由酵母菌內生性質粒改造而成。 釀酒酵母存在一個內生性質粒，大小為6.3kb，長約為2 m，因此又通常稱為2 m質粒。具有以下特點： 在酵母菌穩(wěn)定存在，自主復制與分配； 在酵母細胞中的copy數(shù)可達500100個；, 含有一段長度為599 bp的反向重復序列。該序列將該質粒分成2部分，每一部分均含有一個啟動子和該啟動子控制下的2個基因，其中一個基因稱為FLP，編碼一個位點特異性的重組酶（recombinase）。 2 m質粒結構示意圖,2 m質粒的進一步改造： 酵母菌-大腸桿菌穿梭質粒（YEp）：加入部分酵母菌核DNA序列和大腸桿菌的質粒復制子； 位點特異性重組質粒載體：將E. coli的DNA插入到重組酶識別序列的正向重復序列中，經過重組后該序列可以被丟失。,帶polyA序列的磷酸甘油醛 脫氫酶終止子,磷酸甘油醛脫氫酶啟動子,外源蛋白,篩選標記,（2）YRp 由大腸桿菌質粒載體pBR322改造而成：加入一段來自于酵母菌的自主復制序列，從而使YRp能在酵母菌中復制，但是具有不穩(wěn)定性，容易丟失。 （3）YCp 含有酵母著絲粒序列的質粒載體，能夠自主復制，穩(wěn)定遺傳。但是對酵母菌受體菌本身具有較大不利影響。,3.2.2 整合載體（YIp） 整合載體不含有酵母菌自主復制序列，不能在酵母菌中復制分配，但含有轉座子序列或者酵母菌染色體同源序列，可使其攜帶的外源基因通過轉座子的轉座作用或者同源交換作用而整合到酵母菌的染色體上。 酵母菌基因組中含有3040拷貝的轉座子，稱為Ty。Ty與反轉錄病毒在結構和功能上具有很多相似之處：包含由兩個長的ORF和兩個長末端重復序列（LTR)。 外源基因插入位點,畢赤酵母整合表達載體,AOX1p乙醇脫氫酶啟動子； AOX1t帶有polyA序列的乙醇 脫氫酶終止子； HIS4組氨醇脫氫酶基因； oripp畢赤酵母復制區(qū)； oriE大腸桿菌復制區(qū)； Amp氨芐青霉素抗性基因； 3-AOX1為乙醇脫氫酶基因3 端的一段DNA序列； 箭頭處指示發(fā)生染色體整合 的位點。,3.2.3 酵母人工染色體（YAC） 為一種線狀DNA載體，最初由酵母菌復制質粒 pSZ213發(fā)展而來，含有選擇性標記leu2、自主復制序列和端粒序列。 現(xiàn)有多種商品化的酵母人工染色體，用于大片段DNA的克隆與序列分析。,酵母人工染色體克隆系統(tǒng),YAC質粒（pYAC）包括以下元件： （1）Ampr (大腸桿菌抗性標記) （2）oriE（大腸桿菌復制子） （3）酵母菌DNA序列，包括：CEN，具有著絲粒功能；ARS，酵母自主復制序列，相當于酵母菌復制子；URA3，尿嘧啶生物合成基因；TRP1，色氨酸生物合成基因。,酵母人工染色體克隆系統(tǒng),YAC質粒（pYAC）包括以下元件： （1）Ampr (大腸桿菌抗性標記) （2）oriE（大腸桿菌復制子） （3）酵母菌DNA序列，包括：CEN，具有著絲粒功能；ARS，酵母自主復制序列，相當于酵母菌復制子；URA3，尿嘧啶生物合成基因；TRP1，色氨酸生物合成基因。,T 位點是酵母菌染色體的端粒. SmaI 為克隆插入位點. pYAC質粒先用 SmaI和BamHI進行酶切, 然后經堿性磷酸酶處理（防止自連）后連接入外源DNA片段。,4、酵母中外源基因表達的調控因子 在酵母中表達外源基因受到很多調控因子的影響，包括有以下因素： 4.1 質?？截悢?shù) 一般應考慮適用高拷貝數(shù)的YEp質粒作為載體，但應注意過高量的外源蛋白表達對酵母菌具有毒害作用，反而導致最終表達量的降低。低拷貝數(shù)的YEp質粒，甚至YIp能穩(wěn)定地獲得較高外源蛋白表達量。 質粒載體的不穩(wěn)定性也是影響外源蛋白表達的限制因素，因此在商業(yè)生產中必須使用具有很高穩(wěn)定性能的質粒載體。,4.2 啟動子序列 大腸桿菌啟動子與酵母啟動子的比較： 序列：E. coli: TATAAT Yeast：TATATAA 啟動子與轉錄起始位點的距離： E. coli: 10 bps Yeast：40120 bps 酵母菌啟動子的上游存在一個上游激活序列（UAS）， 一般距轉錄起始位點1001000 bps，因此一般酵母菌表 達載體具有很長的“啟動子序列”，通常達到1 kb。 一般使用可調控的啟動子，可以增加外源蛋白的表達量。,酵母菌中幾種適用的可調控啟動子： gal1、gal7和gal10等基因的啟動子：受葡萄糖阻遏， 而受半乳糖誘導；另一正調控物為gal4的表達產物 GAL4； ADH2（乙醇脫氫酶）啟動子：受乙醇和葡萄糖調節(jié)； PHO5（酸性磷酸酶）啟動子：由磷酸鹽調節(jié)； CUP1（Cu2+結合蛋白）啟動子：Cu2+水平調節(jié)； 溫度調控啟動子：升溫誘導,4.3 轉錄終止子和mRNA的聚腺苷?；?在高等動物中，轉錄終止子一般出現(xiàn)在編碼序列下游很遠處（幾百bp），然后再進行聚腺苷?；饔?，而在酵母菌中，聚腺苷?；饔猛l(fā)生在緊靠轉錄產物的3端。其終止子序列的精確結構往往還不很清楚。 在構建酵母菌表達載體時，往往需要從已了解的酵母基因轉錄終止的下游序列中克隆一大段終止序列片斷，將其放到需要表達的基因編碼序列的下游。 4.4 mRNA的穩(wěn)定性 在需要表達的外源基因編碼序列的下游有必要克隆一個有效的酵母終止序列，才能增加mRNA的穩(wěn)定性。,4.5 起始密碼子AUG的識別 除了高效轉錄外，高效翻譯也是決定外源蛋白表達量的影響因素。起始密碼AUG必須容易被起始因子和核糖體準確識別，而起始密碼附近序列決定翻譯啟動的效率。一般在緊靠AUG密碼前2040個堿基中G出現(xiàn)的頻率很低（大約5），而如果G在這個區(qū)域大量出現(xiàn)，就會抑制翻譯的啟動。 4.6 酵母菌密碼子的偏愛性 在酵母菌中表達的外源基因可能攜帶有酵母菌很少使用的密碼子，這樣就會減緩翻譯過程，若這些密碼子成串排列，則對翻譯特別有害。 解決辦法：使用酵母菌偏愛密碼子，可以通過分析哪些連續(xù)高水平表達內源基因所采用的密碼加以確定。,4.7 外源蛋白的折疊 許多外源基因在酵母菌中得到高水平表達，并能進行正確折疊，而在細菌中往往形成包含體（Inclusion body）。 原因： 細菌細胞為一個還原環(huán)境，不能形成二硫鍵； 酵母細胞內存在多種分子伴侶。 4.8 蛋白質的穩(wěn)定性 在酵母菌中表達單一外源蛋白也會受到酵母菌蛋白酶的降解，尤其是N端裸露的單一蛋白。 解決辦法：改變N末端的序列，或者和內源蛋白構建融合蛋白，這樣在后處理中再設法去除非必需的融合成分。,4.9 外源蛋白的糖基化作用 通過內質網(wǎng)-高爾基體分泌的動物蛋白一般都會在分泌過程中發(fā)生糖基化作用，這一過程可能有助于蛋白質的正確折疊，增強它們對于蛋白酶的抗性。 但是，在酵母菌中發(fā)生的糖基化只會添加富含甘露糖的寡糖，而不會形成象在高等動物細胞中普遍存在的那種糖蛋白復合物，這種糖基化作用有時會影響到蛋白質的折疊和對蛋白酶的敏感性，更重要的是會影響蛋白質在生物體內的半衰期。 另外，在酵母菌中表達的外源蛋白也可能發(fā)生超糖基化，即每個N-寡糖鏈上都含有100個以上的甘露糖，而正常的高甘露糖寡糖鏈僅含有813個甘露糖。過多的甘露糖可能會影響蛋白質的生物活性及其免疫原性。,5、酵母中外源基因表達及產物分泌 5.1 乙肝病毒表面抗原（HBsAg）在巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）中的表達 構建過程（Merck）： （1）將HBsAg編碼基因克隆到乙醇氧化酶基因（aox1）啟動子的下游；下游加上該基因的終止子和加poly(A)信號； （2）加入可在巴斯德畢赤酵母中復制的復制子、大腸桿菌pBR322的復制子、大腸桿菌的選擇標記、一段幫助該質粒整合到特定染色體位點的序列（3-aox1）以及His合成過程中所需的His脫氫酶基因（his4）。 （3）受體菌采用His脫氫酶缺陷型（His4-），經過雙交換后，染色體上的aox1丟失，而整合入aox1啟動子-HBsAg-aox1終止子及加poly(A)信號序列、his4和3-aox1。