GB1886.231-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑乳酸鏈球菌素.pdf

中 華 人 民 共 和 國 國 家 標(biāo) 準(zhǔn)G B1 8 8 6.2 3 12 0 1 6食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑 乳酸鏈球菌素2 0 1 6 - 0 8 - 3 1發(fā)布2 0 1 7 - 0 1 - 0 1實(shí)施中華人民共和國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)發(fā) 布G B1 8 8 6.2 3 12 0 1 61 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑 乳酸鏈球菌素1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)適用于經(jīng)乳酸乳球菌(L a c t o c o c c u s l a c t i ss u b s pl a c t i s) 發(fā)酵后提取而制得的食品添加劑乳酸鏈球菌素。2 分子式、 結(jié)構(gòu)式和相對(duì)分子質(zhì)量2.1 分子式C1 4 3H2 3 0O3 7N4 2S7(N i s i nA)C1 4 1H2 2 8O3 8N4 1S7(N i s i nZ)2.2 結(jié)構(gòu)式N i s nA: 第2 7位氨基酸為組氨酸(H i s) ;N i s nZ: 第2 7位氨基酸為天冬酰胺(A s n)2.3 相對(duì)分子質(zhì)量N i s i nA:3 3 5 4.3 5( 按2 0 1 3年國際相對(duì)原子質(zhì)量)N i s i nZ:3 3 3 0.3 1( 按2 0 1 3年國際相對(duì)原子質(zhì)量)3 技術(shù)要求3.1 感官要求感官要求應(yīng)符合表1的規(guī)定。G B1 8 8 6.2 3 12 0 1 62 表1 感官要求項(xiàng)目要求檢驗(yàn)方法色澤淺棕色至乳白色狀態(tài)粉末將適量試樣均勻置于白瓷盤內(nèi), 在自然光線下觀察其色澤和狀態(tài)3.2 理化指標(biāo)理化指標(biāo)應(yīng)符合表2的規(guī)定。表2 理化指標(biāo)項(xiàng) 目指 標(biāo)檢驗(yàn)方法效價(jià)/ (I U/m g)9 0 0附錄A中的A.3干燥減量,w/%3.0G B5 0 0 9.3氯化鈉,w/%5 0.0G B/T5 0 0 9.4 2鉛(P b) / (m g/k g)1.0G B5 0 0 9.7 5 注:商品化的乳酸鏈球菌素產(chǎn)品應(yīng)以符合本標(biāo)準(zhǔn)的乳酸鏈球菌素為原料, 可添加氯化鈉、 乳固體等輔料而制成,其效價(jià)符合聲稱。3.3 微生物指標(biāo)微生物指標(biāo)應(yīng)符合表3的規(guī)定。表3 微生物指標(biāo)項(xiàng) 目指 標(biāo)檢驗(yàn)方法菌落總數(shù)/ (C F U/g)1 0G B4 7 8 9.2大腸菌群/ (MP N/g)3.0G B4 7 8 9.3大腸埃希氏菌/ (MP N/g)3.0G B4 7 8 9.3 8沙門氏菌不得檢出G B4 7 8 9.4G B1 8 8 6.2 3 12 0 1 63 附 錄 A檢 驗(yàn) 方 法A.1 一般規(guī)定本標(biāo)準(zhǔn)除另有規(guī)定外, 所用試劑的純度應(yīng)為分析純, 所用標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液、 雜質(zhì)測定用標(biāo)準(zhǔn)溶液、 制劑及制品, 應(yīng)按G B/T6 0 1、G B/T6 0 2、G B/T6 0 3的規(guī)定制備, 試驗(yàn)用水應(yīng)符合G B/T6 6 8 2中三級(jí)水的規(guī)定。試驗(yàn)中所用溶液在未注明用何種溶劑配制時(shí), 均指水溶液。A.2 鑒別試驗(yàn)A.2.1 試劑和材料A.2.1.1 鹽酸溶液:0.0 2m o l/L。A.2.1.2 氫氧化鈉溶液:5m o l/L。A.2.1.3 脫脂牛奶: 脂肪含量1%。A.2.1.4 石蕊牛奶培養(yǎng)基。A.2.1.5 檢測菌: 乳酸乳球菌(AT C C 1 1 4 5 4,N C I MB8 5 8 6) 。A.2.2 分析步驟A.2.2.1 試樣儲(chǔ)備液制備取1g試樣, 溶于1L鹽酸溶液中, 溶液效價(jià)約為10 0 0I U/m L。A.2.2.2 對(duì)酸溶液的穩(wěn)定性試驗(yàn)用鹽酸溶液將試樣儲(chǔ)備液稀釋至約5 0I U/m L, 制成試樣溶液。將該試樣溶液煮沸5m i n, 按效價(jià)測定方法測煮沸過的試樣溶液中N i s i n效價(jià)。計(jì)算煮沸過的試樣中N i s i n的效價(jià), 計(jì)算結(jié)果在其效價(jià)值的(1 0 0%5%) 內(nèi), 表明無顯著活性損失。A.2.2.3 對(duì)堿溶液的穩(wěn)定性試驗(yàn)用鹽酸溶液將試樣儲(chǔ)備液稀釋至約5 0I U/m L, 制成試樣溶液。將該試樣溶液煮沸5m i n, 用氫氧化鈉溶液調(diào)p H至1 1.0將溶液加熱到6 5保持3 0m i n, 冷卻。然后滴加鹽酸調(diào)p H至2.0, 用效價(jià)測定方法測定最終溶液中N i s i n的效價(jià)。在按照上述操作處理后會(huì)出現(xiàn)抑菌活性的幾乎完全損失。A.2.2.4 不同抑菌物質(zhì)中N i s i n的鑒別A.2.2.4.1 乳酸乳球菌的培養(yǎng): 乳酸乳球菌( 工作菌株) (AT C C 1 1 4 5 4,N C I MB8 5 8 6) 在無菌脫脂牛奶中培養(yǎng),3 0培養(yǎng)1 8h。A.2.2.4.2 準(zhǔn)備1個(gè)或多個(gè)裝有1 0 0m L石蕊牛奶培養(yǎng)基的長頸燒瓶, 在1 2 1滅菌1 5m i n, 將0.1g試樣加入該無菌的石蕊牛奶培養(yǎng)基中混勻, 在室溫下靜置2h后加入0.1m L檢測菌,3 0 下培養(yǎng)2 4h。A.2.2.4.3 檢測菌( 乳酸乳球菌) 可在該效價(jià)的試樣( 約10 0 0I U/m L) 中生長, 但不能在相似濃度的其他抑菌物質(zhì)中生長。G B1 8 8 6.2 3 12 0 1 64 A.3 效價(jià)的測定A.3.1 試劑和材料A.3.1.1 乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)品( 效價(jià):11 06I U/g) 。A.3.1.2 鹽酸溶液:0.0 2m o l/L。A.3.1.3 吐溫溶液: 吐溫2 0水=11。A.3.1.4 培養(yǎng)基(S1) : 胰蛋白胨0.8%; 酵母膏0.5%; 葡萄糖0.5%; 氯化鈉0.5%;磷酸氫二鈉0.2%; 瓊脂粉1.2%1.5%, 滅菌后p H6.87.0。A.3.1.5 檢測菌: 黃色微球菌(N C I B 8 1 6 6) 。A.3.2 分析步驟A.3.2.1 檢測菌(N C I B 8 1 6 6) 的培養(yǎng)及菌懸液的制備A.3.2.1.1 檢測菌的培養(yǎng)用無菌接種環(huán)從甘油管或凍干管中取一環(huán)檢測菌(N C I B 8 1 6 6) , 接種在無菌的S1平皿上, 進(jìn)行自然分離, 挑出飽滿、 邊緣光滑的菌落, 擴(kuò)大, 接在S1的試管斜面上, 在3 0恒溫箱中培養(yǎng)2 4h, 放入25冰箱中。A.3.2.1.2 菌株懸浮液的制備取在冰箱中的檢測菌(N C I B 8 1 6 6) , 用無菌生理鹽水洗脫下來, 制成1 08C F U/m L濃度的細(xì)胞懸液,備用。A.3.2.2 平板的制備配制S1培養(yǎng)基2 0 0m L( 按比例先把瓊脂溶化, 依次加入各組分溶解, 磷酸氫二鈉溶解后加入) , 經(jīng)1 2 1、2 0m i n滅菌后, 放冷至7 0左右, 加入4m L吐溫2 0溶液, 充分搖勻, 等冷卻到5 05 5左右, 加入已制備好的菌株懸浮液適量, 使培養(yǎng)基中檢測菌的最終濃度為1.01 06個(gè)/m L, 搖勻, 倒入水平放置的已滅菌的平板中, 等完全凝固后, 用直徑為7mm打孔器, 在平板上打出所需的孔數(shù), 小心挖掉孔內(nèi)瓊脂, 移入潔凈工作臺(tái)中吹風(fēng)1.5h3.0h( 吹風(fēng)時(shí)間按空氣中的濕度大小而定, 同時(shí)控制室內(nèi)溫度最低, 盡量不要讓檢測菌生長) , 吹干后, 置25冰箱中, 到次日使用。A.3.2.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備準(zhǔn)確稱取乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)品( 精確到0.0 0 01g) , 溶于鹽酸溶液中, 使最終濃度為2m g/m L(20 0 0I U/m L) , 搖勻, 用鹽酸稀釋成3 0 0倍、6 0 0倍, 即成高、 低劑量標(biāo)準(zhǔn)溶液。A.3.2.4 試樣溶液的制備稱取一定量的試樣( 精確到0.0 0 01g) , 用鹽酸溶液溶解后, 稀釋成高、 低劑量試樣溶液, 其乳酸鏈球菌素含量, 按估計(jì)單位高、 低劑量與標(biāo)準(zhǔn)品溶液大致相當(dāng)。A.3.2.5 滴加溶液取出存放在冰箱中的平板, 用移液器, 取7 0L8 0L標(biāo)準(zhǔn)品高劑量溶液, 隨機(jī)滴加在平板的孔中, 滴6個(gè)孔, 再取7 0L8 0L標(biāo)準(zhǔn)品低劑量溶液, 隨機(jī)滴加在與高劑量溶液同一平板其余孔的6個(gè)G B1 8 8 6.2 3 12 0 1 65 孔中。試樣溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液滴在同一平板上, 其操作同標(biāo)準(zhǔn)品。A.3.2.6 恒溫培養(yǎng)等孔內(nèi)的溶液滲透完全后, 移入3 0恒溫箱中培養(yǎng)1 6h2 4h后, 測量抑菌圈直徑。A.3.3 結(jié)果計(jì)算用卡尺測量抑菌圈直徑, 取其平均值, 按式(A.1) 計(jì)算效價(jià):CS H=CB Hk(XS H+XS L)-(XB H+XB L)(XS H+XB H)-(XS L+XB L)(A.1) 式中:CS H 試樣溶液的效價(jià), 單位為國際單位每毫克(I U/m g) ;CB H 標(biāo)準(zhǔn)溶液的效價(jià), 單位為國際單位每毫克(I U/m g) ;XS H