GB15193.6-2014食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)哺乳動物骨髓細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn).pdf

書 書 書中 華 人 民 共 和 國 國 家 標(biāo) 準(zhǔn)犌犅 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)哺乳動物骨髓細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn) 發(fā)布 實(shí)施中華人民共和國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會發(fā) 布書 書 書犌犅 前言本標(biāo)準(zhǔn)代替 哺乳動物骨髓細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn) 。本標(biāo)準(zhǔn)與 相比，主要變化如下： 標(biāo)準(zhǔn)名稱修改為“食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)哺乳動物骨髓細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)” ； 修改了范圍； 增加了術(shù)語和定義； 修改了試驗(yàn)?zāi)康暮驮恚?修改了試驗(yàn)方法； 修改了數(shù)據(jù)處理。犌犅 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)哺乳動物骨髓細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了哺乳動物骨髓細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)的基本試驗(yàn)方法和技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于評價(jià)受試物對哺乳動物骨髓細(xì)胞的遺傳毒性。術(shù)語和定義 染色體結(jié)構(gòu)畸變通過顯微鏡可以直接觀察到的發(fā)生在細(xì)胞有絲分裂中期的染色體結(jié)構(gòu)變化。如染色體中間缺失和斷片，染色體互換和內(nèi)交換等。結(jié)構(gòu)畸變可分為染色體型畸變（ ）和染色單體型畸變（ ） 。 染色體型畸變?nèi)旧w結(jié)構(gòu)損傷，表現(xiàn)為在兩個染色單體的相同位點(diǎn)均出現(xiàn)斷裂或斷裂重組的改變。 染色單體型畸變?nèi)旧w結(jié)構(gòu)損傷，表現(xiàn)為染色單體斷裂或染色單體斷裂重組的損傷。 染色體數(shù)目畸變?nèi)旧w數(shù)目發(fā)生改變，不同于正常核型。 核內(nèi)復(fù)制在復(fù)制的期之后，細(xì)胞核未進(jìn)行有絲分裂就開始了另一個期的過程。其結(jié)果是染色體有、 倍的染色單體。 裂隙染色體或染色單體損傷的長度小于一個染色單體的寬度，為染色單體的最小錯誤排列。 有絲分裂指數(shù)中期相細(xì)胞數(shù)與所觀察的細(xì)胞總數(shù)之比值。試驗(yàn)?zāi)康暮驮碓谠囼?yàn)動物給予受試物后，用中期分裂相阻斷劑（如秋水仙素或秋水仙胺）處理，抑制細(xì)胞分裂時紡錘體的形成，以便增加中期分裂相細(xì)胞的比例，隨后取材、制片、染色、分析染色體畸變。本試驗(yàn)可檢測受試物能否引起整體動物骨髓細(xì)胞染色體畸變，以評價(jià)受試物致突變的可能性。若犌犅 有證據(jù)表明受試物或其代謝產(chǎn)物不能到達(dá)骨髓，則不適用于本方法。儀器和試劑 儀器實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備、恒溫水浴鍋（ ） 、離心機(jī)、生物顯微鏡。 試劑 秋水仙素（ ） ：置于棕色瓶中，冰箱保存。 氯化鉀溶液（ ） 。 固定液：甲醇與冰醋酸以混合，臨用時現(xiàn)配。 姬姆薩（ ）儲備染液：取 染料 和少量甲醇于乳缽里仔細(xì)研磨，逐漸加入甲醇至 ，待完全溶解后，再加入 甘油，混合均勻。置 恒溫箱中保溫 。保溫期間振搖數(shù)次，促使染料的充分溶解。取出過濾，室溫保存，兩周后使用。 應(yīng)用染液：取份 儲備染液與份磷酸鹽緩沖液（ ）混合而成。臨用時配制。 磷酸鹽緩沖液（ ） 。 磷酸氫二鈉溶液（ ） ：磷酸氫二鈉（） 溶于 去離子水中。 磷酸二氫鉀溶液（ ） ：磷酸二氫鉀（） 溶于 去離子水中。 取磷酸氫二鈉溶液（ ） 與磷酸二氫鉀溶液（ ） 混合。 陽性對照物：常用環(huán)磷酰胺，絲裂霉素等。試驗(yàn)方法 受試物受試物應(yīng)使用原始樣品，若不能使用原始樣品，應(yīng)按照受試物處理原則對受試物進(jìn)行適當(dāng)處理。 實(shí)驗(yàn)動物 動物選擇常用健康年輕的成年大鼠或小鼠，如使用小鼠，可選擇周齡 周齡，試驗(yàn)開始時動物體重的差異不應(yīng)超過平均體重的 。動物應(yīng)隨機(jī)分組，每組雌性和雄性動物至少各只。如果試驗(yàn)設(shè)有幾個采樣時間點(diǎn)，則要求每組每個性別每個采樣時間點(diǎn)都有只能用于分析的動物。 動物準(zhǔn)備試驗(yàn)前動物在實(shí)驗(yàn)動物房至少應(yīng)進(jìn)行環(huán)境適應(yīng)和檢疫觀察。 動物飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)條件應(yīng)符合 、飲用水應(yīng)符合 、飼料應(yīng)符合 的有關(guān)規(guī)定。試驗(yàn)期間動物自由飲水和攝食，每籠動物數(shù)應(yīng)滿足實(shí)驗(yàn)動物最低需要的空間，以不影響動物自由活動和觀察動物的體征為宜。犌犅 劑量應(yīng)進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)以選擇最高劑量。如果受試物具有毒性，應(yīng)設(shè)個劑量，最高劑量組原則上為動物出現(xiàn)嚴(yán)重中毒表現(xiàn)和（或）個別動物出現(xiàn)死亡的劑量，一般可取 ，低劑量組應(yīng)不表現(xiàn)出毒性，分別取 和 作為中、低劑量。對于在低或無毒劑量下具有特異生物學(xué)活性的物質(zhì)（如激素和絲裂源）可以抑制骨髓細(xì)胞有絲分裂指數(shù)（ 以上）為指標(biāo)確定最高劑量，按等比級數(shù)向下設(shè)置中、低劑量組。急性毒性試驗(yàn)給予受試物最大劑量（最大使用濃度和最大灌胃容量）動物無死亡而求不出 ，并且根據(jù)結(jié)構(gòu)相關(guān)物質(zhì)資料不能推斷受試物具有遺傳毒性時，則不必設(shè)個劑量。按以下順序只設(shè)一個劑量：） 體重；）人的可能攝入量的 倍；）一次最大灌胃劑量，連續(xù)染毒 。另設(shè)溶媒對照組和陽性對照組，如果沒有文獻(xiàn)資料或歷史性資料證實(shí)所用溶媒不具有有害作用或致突變作用，還應(yīng)設(shè)空白對照組。陽性對照物可用絲裂霉素（ 體重 體重）或環(huán)磷酰胺（ 體重）經(jīng)口或腹腔注射給予。 試驗(yàn)步驟 給予受試物方式經(jīng)口給予受試物，受試物溶液一次灌胃量不應(yīng)超過 體重。采用一次染毒或多次染毒方式。一次染毒應(yīng)分兩次采集標(biāo)本，即每組動物分兩個亞組，亞組于染毒后 處死動物采集第一次標(biāo)本，亞組于亞組動物處死后 采集第二次標(biāo)本。如果采用多次染毒方式，可給予受試物次次，每次間隔 ，在末次染毒后 采集一次標(biāo)本。處死動物前，按 體重腹腔注射秋水仙素。 取材頸椎脫臼法處死動物，迅速取出股骨，剔去肌肉，擦凈血污，剪去兩端骨骺，用帶針頭的注射器吸取生理鹽水，插入骨髓腔，將骨髓洗入 離心管，然后用吸管吹打骨髓團(tuán)塊使其均勻，將細(xì)胞懸液以 離心 ，棄去上清液。 低滲離心后的沉淀物加入 氯化鉀溶液，用滴管將細(xì)胞輕輕吹打均勻，放入 水浴中低滲 。 預(yù)固定立即加入固定液（甲醇冰醋酸） ，以 離心 ，棄去上清液。 固定加入固定液，混勻，固定 后，以 離心 ，棄去上清液，用同法再加固定液次次，棄去上清液。 滴片加入數(shù)滴新鮮固定液，用滴管充分混勻。將細(xì)胞懸液均勻的滴于冰水玻片上，輕吹細(xì)胞懸液擴(kuò)散平犌犅 鋪于玻片上。每個標(biāo)本制張張玻片，空氣中自然干燥。 染色用 染液染色 ，去離子水沖洗，空氣中自然干燥。 閱片在低倍鏡下檢查制片質(zhì)量，制片應(yīng)為全部染色體較集中，而各個染色體分散、互不重疊、長短收縮適中、兩條單體分開、清楚地顯示出著絲點(diǎn)位置、染色體呈紅紫色。用油鏡進(jìn)行細(xì)胞中期染色體分析，每只動物分析 個中期相細(xì)胞，每個劑量組不少于 個中期分裂相細(xì)胞。在讀片時應(yīng)記錄每個觀察細(xì)胞的染色體數(shù)目，對于畸變細(xì)胞還應(yīng)記錄顯微鏡視野的坐標(biāo)位置及畸變類型。由于低滲等機(jī)械作用的破壞，會導(dǎo)致處于中期的染色體發(fā)生丟失，所以，觀察的中期相染色體數(shù)目應(yīng)控制在狀內(nèi)。 觀察指標(biāo) 染色體數(shù)目的改變 非整倍體：亞二倍體或超二倍體。 多倍體：染色體成倍增加。 核內(nèi)復(fù)制：核膜內(nèi)的特殊形式的多倍化現(xiàn)象。 染色體結(jié)構(gòu)的改變 斷裂：損傷長度大于染色體的寬度。 微小體：較斷片小而呈圓形。 有著絲點(diǎn)環(huán)：帶有著絲點(diǎn)部分，兩端形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)并伴有一雙無著絲點(diǎn)斷片。 無著絲點(diǎn)環(huán)：成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。 單體互換：形成三輻體、四輻體或多種形狀的圖像。 雙微小體：成對的染色質(zhì)小體。 裂隙：損傷的長度小于染色單體的寬度。 非特定性型變化：如粉碎化、著絲點(diǎn)細(xì)長化、黏著等。數(shù)據(jù)處理和結(jié)果評價(jià) 數(shù)據(jù)處理每只實(shí)驗(yàn)動物作為一個觀察單位，每組動物按性別分別計(jì)算染色體結(jié)構(gòu)畸變細(xì)胞百分率。若雌、雄動物之間無明顯的性別差異，可合并計(jì)算結(jié)果?？捎脵z驗(yàn)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。裂隙應(yīng)單獨(dú)記錄和報(bào)告，但一般不計(jì)入總的畸變率。 結(jié)果評價(jià)結(jié)果評價(jià)時應(yīng)從生物學(xué)意義和統(tǒng)計(jì)學(xué)意義兩個方面進(jìn)行分析。劑量組染色體畸變率與陰性對照組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并呈劑量反應(yīng)關(guān)系或一個劑量組出現(xiàn)染色體畸變細(xì)胞數(shù)明顯增高并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并經(jīng)重復(fù)試驗(yàn)證實(shí)，即可確認(rèn)為陽性結(jié)果。若有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但無劑量反應(yīng)關(guān)系時，則應(yīng)進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)。結(jié)果能重復(fù)者可確定為陽性。犌犅 試驗(yàn)報(bào)告 試驗(yàn)名稱、試驗(yàn)單位名稱和聯(lián)系方式、報(bào)告編號。 試驗(yàn)委托單位名稱和聯(lián)系方式、樣品受理日期。 試驗(yàn)開始和結(jié)束日期、試驗(yàn)項(xiàng)目負(fù)責(zé)人、試驗(yàn)單位技術(shù)負(fù)責(zé)人或授權(quán)簽字人、簽發(fā)日期。 試驗(yàn)摘要。 受試物：名稱、批號、劑型、性狀（包括感官、性狀、包裝完整性、標(biāo)識） 、數(shù)量、前處理方法、溶媒。 實(shí)驗(yàn)動物：物種、品系、級別、數(shù)量、體重、性別、來源（供應(yīng)商名稱、實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號） ，動物檢疫、適應(yīng)情況，飼養(yǎng)環(huán)境（溫度、相對濕度、實(shí)驗(yàn)動物設(shè)施使用許可證號） ，飼料來源（供應(yīng)商名稱、實(shí)驗(yàn)動物飼料生產(chǎn)許可證號） 。 試驗(yàn)方法：分組、每組