DB51T 1207-2011 桑蠶血液型膿病診斷技術(shù)規(guī)程.doc

65.020.30 B 47DB51四川省地方標(biāo)準(zhǔn)DB 51/T 12072011桑蠶血液型膿病診斷技術(shù)規(guī)程2011 - 01-25發(fā)布2011 - 03-01實(shí)施四川省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布DB51/T 12072011前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T 1.12009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由四川省農(nóng)業(yè)廳提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)由四川省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：四川省蠶業(yè)管理總站、四川省農(nóng)科院生物技術(shù)核技術(shù)研究所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：馬露蕓、吳鋼、蔡平鐘、朱洪順、謝忠良、張學(xué)清。IDB51/T 12072011桑蠶血液型膿病診斷技術(shù)規(guī)程1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了四川省桑蠶血液型膿病診斷的技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于四川省桑蠶血液型膿病的診斷。2 規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過(guò)本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB/T 6682 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法3 術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。3.1核型多角體 nuclear polyhedral body在桑蠶血細(xì)胞和體腔內(nèi)各種組織感染細(xì)胞的細(xì)胞核中產(chǎn)生的包含和保護(hù)病毒粒子的一種蛋白質(zhì)結(jié)晶體，多呈比較整齊的六角形。3.2質(zhì)型多角體 cytoplasmic polyhedral body在桑蠶中腸感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中產(chǎn)生的包含和保護(hù)病毒粒子的一種蛋白質(zhì)結(jié)晶體，多為六角形，或有四角形，偶有三角形。3.3血液型膿病(核型多角體病) nuclear polyhedrosis病毒寄生在桑蠶血細(xì)胞和體腔內(nèi)各種組織細(xì)胞，使其血液渾濁呈乳白的蠶?。徊⒃诩?xì)胞核中形成多角體，又稱核型多角體病。4 試劑4.1 焦寧甲基綠染液A液：焦寧w(C17H19ClN2O)=5 15.5 mL 甲基綠w(C27H35Cl2N3.ZnCl2)=2 10 mL 無(wú)菌水 250 mLB液：醋酸緩沖液 pH4.8使用前將A、B兩液等體積混合。4.2 蘇丹染色劑0.5g蘇丹溶于100 mL 95%乙醇中，過(guò)濾后，加入少許甘油。4.3 氫氧化鉀溶液w(KOH)=2。4.4 鹽酸溶液c(HCl)=1mol/L。4.5 化學(xué)純 乙醇（C2H5OH）。4.6 化學(xué)純 乙醚（C4H10O）。4.7 分析用水按GB/T 6682規(guī)定執(zhí)行。5 儀器、設(shè)備5.1 普通光學(xué)顯微鏡、相差顯微鏡，放大倍數(shù)1540倍或1640倍；恒溫培養(yǎng)箱（565）、冰箱；天平（感量0.1g）。5.2 載玻片、蓋玻片；乳缽、乳棒；解剖剪、鑷子、吸管；量筒、燒杯；樣品袋、凍存管（1.8mL、5mL）。6 診斷6.1 肉眼診斷6.1.1 外觀觀察肉眼觀察蠶在不同發(fā)育階段是否具有下列癥狀。a) 不眠蠶：發(fā)生于各齡眠期。體色乳白，體軀腫脹，狂躁爬行，體壁發(fā)亮，皮破流膿。b) 起節(jié)蠶：發(fā)生于各齡眠起時(shí)。生長(zhǎng)停滯，體色乳白；體壁松弛，體軀縮??；前節(jié)的節(jié)間膜向后套疊。c) 斑蠶：發(fā)生于3齡5齡。焦腳蠶、黑氣門(mén)蠶、焦腳和黑氣門(mén)同時(shí)出現(xiàn)的對(duì)稱性斑蠶。d) 高節(jié)蠶：發(fā)生于4、5齡盛食期。各環(huán)節(jié)間膜或各環(huán)節(jié)后半部靠近節(jié)間膜處隆起，形如竹節(jié)。e) 膿蠶：發(fā)生于5齡后期至上蔟前。環(huán)節(jié)腫大，體壁發(fā)亮，體色乳白；爬行緩慢，皮破流膿。遲發(fā)病蠶死于蔟中或結(jié)薄皮繭后死亡。f) 病蛹：5齡后期感染，部分能營(yíng)繭化蛹。病蛹體色暗褐，體壁易破。6.1.2 解剖觀察將外觀觀察的具有上述病癥的病蠶，用解剖剪剪去尾角或腹足，觀察滴出的血液顏色。6.1.3 判定通過(guò)外觀觀察，不同發(fā)育階段的蠶出現(xiàn)6.1.1表述的癥狀之一時(shí)，可初步診斷為血液型膿病；通過(guò)解剖觀察，滴出的血液呈乳白色濃汁，可診斷為血液型膿病。6.2 顯微鏡診斷6.2.1 樣品采集采集6.1.1描述的典型癥狀蠶、蛹。采集的樣品置于樣品袋或凍存管中，做好記載。6.2.2 樣品處置6.2.2.1 樣品保存樣品每份混合均勻后再分成2份，其中1份作為檢樣制備檢驗(yàn)，另1份作為備樣，保存于0 4 冰箱中。保存期30d60d。6.2.2.2 樣本制備 用解剖剪剪去未病死蠶的尾角或腹足，制成血液樣本。 病死蠶或蛹置于乳缽中，采取整頭（粒）研磨的方法，加入4滴10滴氫氧化鉀溶液w(KOH)= 2，用乳棒研細(xì)，制成磨碎液樣本。6.2.3 顯微鏡檢查6.2.3.1 直接觀察法取待檢樣本一滴涂抹于載玻片上，蓋上蓋玻片，分別置于顯微鏡（1540倍或1640倍）下觀察，每個(gè)樣本觀察不少于20個(gè)視野，觀察有無(wú)多角體。6.2.3.2 多角體與脂肪球鑒別6.2.3.2.1 蘇丹染色法取待鑒樣本一滴涂抹于載玻片上，自然干燥后，加一滴蘇丹染色劑，5min后蓋上蓋玻片鏡檢，脂肪球呈紅色或橙黃色，多角體不著色。6.2.3.2.2 有機(jī)溶劑溶解法取待鑒樣本一滴涂抹于載玻片上，自然干燥后，加一滴乙醇乙醚的等量混合液。待混合液蒸發(fā)后，加無(wú)菌水一滴，蓋上蓋玻片鏡檢，脂肪球溶解消失，多角體存在。6.2.3.3 核型多角體和質(zhì)型多角體鑒別用焦寧甲基綠染色法。經(jīng)6.2.3.2鑒別有多角體存在的磨碎液樣本，取1滴涂抹于載玻片上，自然干燥后，用吸管滴1滴2滴鹽酸溶液c(HCl)=1mol/L，在室溫下放置1 min2 min后，移入60 恒溫箱中放置1 min5 min，取出用少量無(wú)菌水沖洗，加一滴焦寧甲基綠染色液，常溫下染色1 min5 min，用少量無(wú)菌水沖去浮液，鏡檢，核型多角體呈綠色，質(zhì)型多角體呈紅色。6.2.4 判定血液樣本經(jīng)鏡檢發(fā)現(xiàn)多角體存在，