DB33T625.3-2007（2016）無公害豆芽第3部分：6-芐基腺嘌呤殘留量和4-氯苯氧乙酸鈉殘留量的測定.doc

DB33/T .32006浙江省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局 發(fā)布2007-03-05實施2007-02-05發(fā)布無公害豆芽第3部分：6芐基腺嘌呤殘留量和4氯苯氧乙酸鈉殘留量的測定DB33/T 625.32007DB33浙江省地方標準ICS67.050C53備案號：1DB33/T 625.32007前 言DB33/ 6252007無公害豆芽分為三個部分：第1部分：生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程；第2部分：質(zhì)量安全要求； 第3部分：6-芐基腺嘌呤殘留量和4-氯苯氧乙酸鈉殘留量的測定。本部分為DB33/ 6252007無公害豆芽第3部分。本部分的附錄A和附錄B為資料性附錄。本部分起草單位：浙江省疾病預防控制中心、寧波市疾病預防控制中心、杭州市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測院、浙江省農(nóng)業(yè)廳農(nóng)作物管理局、寧波市衛(wèi)生監(jiān)督所、寧波市五龍?zhí)妒卟耸称酚邢薰?、寧波市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局。本部分主要起草人：李小平、韓見龍、蔡增軒、金米聰、趙建陽、芮昶、蔣經(jīng)偉、陶禮明、戴建剛。I無公害豆芽第3部分：6芐基腺嘌呤殘留量和4氯苯氧乙酸鈉殘留量的測定第一法 豆芽中6-芐基腺嘌呤殘留量的測定LC-MS/MS法1 范圍本方法規(guī)定了豆芽中6-芐基腺嘌呤的測定方法。本方法適用于豆芽中6-芐基腺嘌呤的測定。本方法檢出限為110-6 mg/kg。2 原理豆芽中殘留的6-芐基腺嘌呤經(jīng)酸化甲醇提取，反相柱分離，電噴霧離子化（ESI）和多離子反應監(jiān)測（MRM）方式進行定量測定。以試樣峰的保留時間、母離子（m/z: 226.20M+H+）與子離子(226.2091.0, 226.20147.90)定性，以子離子(226.2091.0)峰面積外標法定量。3 試劑除非另有規(guī)定，僅使用分析純試劑、蒸餾水或去離子水。3.1 乙酸。3.2 乙腈（HPLC）。3.3 甲醇（HPLC）。3.4 50%的甲醇水溶液。3.5 酸化甲醇：每100 mL甲醇中加入乙酸50L，混勻。3.6 標準溶液的配置：3.6.1 標準儲備溶液精密稱取6-芐基腺嘌呤（含量98.0）0.1000g于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，作為標準儲備溶液。此標準儲備溶液每毫升相當于1.0 mg 6-芐基腺嘌呤。標準使用液用甲醇稀釋至每毫升含1g的6-芐基腺嘌呤。在4冰箱中儲存，有效期1個月。3.6.2 標準工作溶液3.6.2.1 空白豆芽萃取液制備選擇在生產(chǎn)過程中未添加6-芐基腺嘌呤的豆芽菜。按5.1 試樣處理方法提取，經(jīng)0.22m有機濾膜過濾。必要時使用LC-MS/MS分析，以確定在6-芐基腺嘌呤出峰處不存在干擾。3.6.2.2 標準工作溶液系列配制準確吸取標注使用液1L、2L、4L、6L、8L、10L于進樣瓶中，加空白豆芽萃取液（3.6.2.1）至1 mL。配制成濃度依次為1 ng/mL、2ng/mL、4 ng/mL、6 ng/mL、8 ng/mL、10 ng/mL的標準溶液系列，供LC-MS/MS分析。4 儀器4.1 組織搗碎機。4.2 天平（精度0.01和0.0001g）。4.3 高效液相色譜-電噴霧-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜（LC-ESI-MS/MS）。4.4 均質(zhì)機（速度范圍： 6,00024,000 rpm）。4.5 離心機(最高轉(zhuǎn)速:15,000 RPM)。5 分析步驟5.1 試樣處理稱取豆芽樣品500g用食物粉碎機粉碎后，取5g樣品（精確至0.01g）于50 mL聚丙烯離心管中，加入10 mL酸化甲醇，用均質(zhì)機勻質(zhì)3 min,10000 rpm離心10min，上清液轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中，樣品再用10 mL酸化甲醇重復提取一次。合并上清液，用水定容至刻度，搖勻，吸取2mL于10容量瓶中，用50%甲醇水溶液定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.2m 濾膜過濾，供LC-MS/MS分析。5.2 色譜參考條件色譜柱：Waters SunFire C18柱（2.1mm150mm， 5m 顆徑）。流動相A：水（0.1%甲酸）。流動相B：甲醇（0.1%甲酸）。流速：0.30 mL/min。進樣量： 10 uL。柱溫：35。表1 梯度洗脫條件時間（min）流動相A流動相B變化曲線0.0050%50%3.0044%56%63.250%0%64.250%0%14.5050%50%68.0050%50%1注：變化曲線：1為立即變化，6為線性變化5.3 質(zhì)譜參考條件離子化方式ESI+。毛細管電壓 (kV)3.00。錐孔電壓 (V) 57。RF Lens 135.0。Aperture (V)0.0。RF Lens 20.3。源溫度 ()120。脫溶劑溫度 ()350。錐孔反吹氣流 (L/Hr)50。脫溶劑氣流 (L/Hr)454。LM 1 Resolution12.0。HM 1 Resolution12.0。離子能量 10.5。LM 2 Resolution12.0。HM 2 Resolution12.0。離子能量 21.0。光電倍增管 (V)650。碰撞池氣壓(mbar)3.03e-3。5.4 測定準確吸取10.0L標準系列溶液和試樣溶液注入液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀中，按照本標準5.2和5.3項條件進行檢測，以保留時間及子離子226.2091.0，147.90進行定性，以子離子226.2091.0的峰面積外標法定量。參見附錄A。5.5 結(jié)果計算按外標法計算試樣中6-芐基腺嘌呤的含量。見下式：式中：X試樣中6-芐基腺嘌呤的含量，mg/kg；A試樣中定量子離子面積對應的6-芐基腺嘌呤的質(zhì)量，g；f試樣的稀釋倍數(shù)；m試樣的取樣量，g。計算結(jié)果表示到三位有效數(shù)字。6 精密度在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果絕對差值不得超過算術(shù)平均值的20%。7附錄A （資料性附錄）226.2091.0，147.90子離子流圖226.2091.0，147.90子離子流見圖A.1。圖A.1 226.2091.0，147.90子離子流圖第二法 4-氯苯氧乙酸鈉殘留量的測定1 范圍本方法規(guī)定了豆芽中4-氯苯氧乙酸鈉的測定方法。本方法適用于豆芽中4-氯苯氧乙酸鈉的測定。本方法檢出限為0.10 mg/kg。2 原理豆芽中的4-氯苯氧乙酸鈉用稀堿提取，酸化后用乙醚萃取，高效液相色譜紫外檢測器測定，保留時間定性，外標法定量。3 試劑除非另有規(guī)定，僅使用分析純試劑、蒸餾水或去離子水。3.1 氫氧化鈉。3.2 鹽酸。3.3 乙醚。3.4 甲醇（HPLC）。3.5 冰醋酸。3.6 氫氧化鈉溶液（0.01mol/L）： 稱取0.40g 氫氧化鈉，溶于水并稀釋至1000 mL。3.7 鹽酸溶液（1：1）：取100mL鹽酸，加水稀釋至200mL。3.8 氯化鈉酸性溶液（40 g/L）：于100mL氯化鈉溶液（40 g/L）中加1.0mL 鹽酸酸化。3.9 磷酸鹽緩沖液（0.01mol/L）：稱取1.56 g的磷酸二氫鈉（NaH2PO4.2H2O）加水溶解，并定容至1000mL，用50%的H3PO4溶液調(diào)節(jié)pH至4.0。3.10 4-氯苯氧乙酸標準溶液：精密稱取4-氯苯氧乙酸(含量99.0%，中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司)0.1000g，用甲醇溶解并移入100mL容量瓶中，稀釋至刻度。此溶液每毫升相當于1.00mg4-氯苯氧乙酸。在4冰箱中儲存，有效期1個月。臨用時用甲醇稀釋至每毫升相當于0.10mg4-氯苯氧乙酸。4 儀器4.1 組織搗碎機。4.2 天平（精度0.01和0.0001g）。4.3 超聲波儀。4.4 均質(zhì)機（速度范圍： 6,500 24,000 rpm）。4.5 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。4.6 酸度計。4.7 高效液相色譜儀（帶紫外檢測器）。5 分析方法5.1 樣品處理稱取經(jīng)組織搗碎機搗碎的豆芽試樣10g（精確至0.01g）于50 mL比色管中，加入30mL氫氧化鈉（3.6），用均質(zhì)機均質(zhì)（10,000 rpm）混勻3min，8000r/min離心10min，上清液轉(zhuǎn)入50mL容量瓶中，樣品再用少量氫氧化鈉（3.6）重復提取1次，離心后。合并上清液，并用氫氧化鈉（3.6）定容至刻度，搖勻。取此液10.0mL于150 mL分液漏斗中，加鹽酸溶液（3.7）2.0mL，用50mL乙醚（3.3）萃取3次，每次振搖1min，合并乙醚層，用5.0mL氯化鈉酸性溶液（3.8）洗滌，棄去水層，乙醚層用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸至近干，用甲醇溶解并定容至1.0mL，過0.45m濾膜后，供高效液相色譜分析。5.2 標準曲線準確吸取每毫升相當于0.10mg的 4-氯苯氧乙酸0.20mL、0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL、4.00mL于100 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度。制成濃度依次為0.20mg/L、0.50 mg/L、1.00 mg/L、2.00 mg/L、4.00mg/L的標準溶液，供高效液相色譜分析。5.3 色譜參考條件色譜柱：ZORBAX SB C18柱（ 4.6mm250mm 5m）。檢測波長：228nm。流動相：甲醇+0.01mol/L磷酸鹽緩沖液（40+60）。流速：1.0mL/min。柱溫：30。5.4 測定吸取10.0L標準使用液和試樣液注入高效液相色譜儀，按照5.3項條件進行檢測，以保留時間定性，標準曲線法定量。5.5 結(jié)果計算按外標法計算試樣中4-氯苯氧乙酸鈉的含量。見下式：式中：X試樣中4-氯苯氧乙