生物,動物,本科生畢業(yè)論文

骨骼肌TEF1轉(zhuǎn)錄因子下游靶基因Nudt6和Tcta的克隆、測序、SNP檢測及性狀關(guān)聯(lián)分華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)專業(yè)2006級1 前言1.1 研究背景骨骼肌的生長速度是豬的生產(chǎn)性能的主要決定因素之一，動物的產(chǎn)肉力與肌纖維細(xì)胞的數(shù)量、長短、橫截面積和生長密切相關(guān)（Oksbjerg et al.，2004）。因此加快肌肉的生長速度和提高瘦肉率一直都是豬遺傳改良研究的重點。但由于豬的產(chǎn)肉性狀大多是由多基因控制的數(shù)量性狀，通過常規(guī)選育難以進(jìn)一步提高。因此結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇進(jìn)行豬育種改良，可以為豬肌肉經(jīng)濟(jì)性狀的遺傳改良研究注入強大的新動力，已成為一種趨勢。近年來，豬的分子遺傳育種取得了很大的進(jìn)展，許多新基因被分離克隆，并與豬肉質(zhì)性狀、胴體性狀和生長性狀進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，從而為現(xiàn)代分子遺傳標(biāo)記應(yīng)用于豬遺傳育種提供了分子遺傳基礎(chǔ)，并推動了豬育種的發(fā)展。因此對重要經(jīng)濟(jì)性狀候選基因的分離克隆和研究，為加快我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展、加速豬新品種的培育具有非常重要的意義。豬的生長性狀是提高養(yǎng)豬生產(chǎn)效率的重要基礎(chǔ)，是當(dāng)前養(yǎng)豬業(yè)中的一個重點。而豬的生長性狀關(guān)鍵在于肌肉的生長，因此對肌肉生長相關(guān)的候選基因的研究成為必要。1.2 TEF1在肌肉生長發(fā)育中的作用肌纖維細(xì)胞是由胚胎發(fā)育早期的成肌細(xì)胞經(jīng)過增殖和肥大而形成。雖然肌肉的發(fā)育和生長是一個非常復(fù)雜的過程，但主要分為三個階段，即成肌細(xì)胞（myoblast）分化決定階段、成肌細(xì)胞的形成與分化階段和肌管（myotube）形成階段（Scott, 2003）。骨骼肌不同階段的演化涉及到許多細(xì)胞因子（如調(diào)節(jié)因子，成肌決定因子，細(xì)胞周期作用因子和增強因子等），還包括細(xì)胞凋亡過程。目前已經(jīng)鑒定的調(diào)節(jié)因子包括轉(zhuǎn)錄因子、信號分子及生長因子。TEF1是一個重要的轉(zhuǎn)錄因子，在肌肉特異基因的表達(dá)中起著比較重要的作用，TEF1的TEA結(jié)構(gòu)域不但能與肌肉特異基因的M-CAT元件作用，還能與其他因子的MADS結(jié)構(gòu)域作用調(diào)節(jié)其它的肌肉基因的表達(dá)。（邱海芳，2009）1.3 兩個擬分離基因的研究進(jìn)展本實驗室的邱海芳博士（2009）已經(jīng)運用ChIP-on-chip（染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)，chromatin immunoprecipitation assay, ChIP）技術(shù)釣取了小鼠TEF1轉(zhuǎn)錄因子在肌肉組織中的下游靶基因，并進(jìn)行了GO分析和調(diào)控通路分析。篩選了745個靶基因。其中大部分基因參與了轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)的細(xì)胞過程，在肌肉生長發(fā)育過程中發(fā)揮了重要作用。本實驗選取邱海芳博士ChIP芯片中Nudt6和Tcta基因進(jìn)行研究，。1.3.1 Nudt6的研究進(jìn)展核苷二磷酸連接X型基元6基因（nudixtypemotif6，Nudt6），又叫GFG基因；屬于Nudix(nucleosidediphosphatelinkedmoietyX)水解酶超家族。這些水解酶的主要底物是連接了X成分的核苷二磷酸（nucleosidediphosphates）（X代表任意氨基酸）。Nudt6基因人定位于4q28.1，有兩個轉(zhuǎn)錄本，長約1kbp。在小鼠中，Nudt6定位于3號染色體，長約1.1kbp。在結(jié)構(gòu)上，Nudt6基因與bFGF在3端有460個左右核苷酸有互補性。它編碼一個35kDa的GFG蛋白。GFG蛋白在多種組織表達(dá)，但是目前關(guān)于其具體作用還知之甚少。Nudt6基因的mRNA是FGF2反義鏈轉(zhuǎn)錄而來，所以又叫反義FGF。FGF的反義轉(zhuǎn)錄本1989年首次在非洲蟾蜍中鑒定。Nudt6基因在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控FGF2基因的表達(dá)。在細(xì)胞內(nèi)，F(xiàn)GF2基因的正義鏈mRNA和反義鏈mRNA以穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)存在。Nudt6基因在轉(zhuǎn)錄后直接結(jié)合到FGF mRNA的3非翻譯區(qū)端，形成雙鏈結(jié)構(gòu)。而3端非翻譯區(qū)在決定bFGF的mRNA穩(wěn)定和翻譯起始有重要作用。所以，反義鏈mRNA可以穩(wěn)定FGF2基因的mRNA，調(diào)控FGF2的翻譯。在mRNA轉(zhuǎn)錄水平，Nudt6基因不影響FGF2基因，但是可以抑制細(xì)胞內(nèi)的FGF2蛋白，而且這種轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控作用直接和Nudt6的mRNA表達(dá)量正相關(guān)。過表達(dá)其RNA可以抑制細(xì)胞內(nèi)總FGF2，核內(nèi)聚集FGF2減少。細(xì)胞周期停留在G期，延遲進(jìn)入S期，達(dá)到調(diào)控細(xì)胞周期，控制發(fā)育的作用。在某些腫瘤病人，Nudt6的表達(dá)水平與提高生存率，降低復(fù)發(fā)率有重要聯(lián)系，特別是bFGF表達(dá)異常的病人。朱綱華等（2007）研究了Nudt6在小鼠內(nèi)耳的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Nudt6和FGF2在耳蝸損傷后修復(fù)過程中起著重要作用。Shuo Cheng Zhang等（2007）研究了Nudt6在人的多種組織以及食管癌中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Nudt6和FGF2的過表達(dá)可以減少食管癌的復(fù)發(fā)率。而在豬上面還沒有關(guān)于該基因的報道。1.3.2 Tcta的研究進(jìn)展1995年Aplan等在T細(xì)胞白血病易位斷點t（1；3）（p34；p21）克隆并鑒定了一個新的基因，并命名為Tcta（T細(xì)胞白血病易位相關(guān)基因），定位到3p21。Tcta的mRNA在各種組織中都有表達(dá)，尤其在腎臟中表達(dá)最高。Tcta基因的功能還不清楚。但是在進(jìn)化過程中，從低等真核生物（如果蠅）和脊椎動物中，各物種的Tcta基因高度保守。從ATG起始密碼子開始，Tcta基因僅有103個氨基酸殘基的開放閱讀框，編碼了相對分子質(zhì)量11300的蛋白質(zhì)，這個蛋白質(zhì)不與任何之前報到的蛋白質(zhì)同源。在4個小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系的Southern雜交中，有3個細(xì)胞系Tcta表達(dá)減弱，表明Tcta基因的兩個拷貝中，有一個缺失了。Tcta的mRNA在人的正常組織中廣泛表達(dá)，預(yù)示著它不可能涉及特定細(xì)胞的變異。Tcta的mRNA在腎臟的表達(dá)水平比其他組織的高，預(yù)示它編碼的蛋白質(zhì)有橫跨膜的作用，但還沒有發(fā)現(xiàn)明確的特征。2005年又報到Tcta可以在蛋白質(zhì)組圖譜水平，影響SMAD4蛋白。2009年 Shigeru Kotake等發(fā)現(xiàn)Tcta蛋白是人破骨細(xì)胞生成必須的。但是Tcta的功能依然不清楚。1.4 SNP在豬育種中的應(yīng)用單核苷酸的多態(tài)性（SNP）是指由于一個核苷酸突變導(dǎo)致的DNA序列多態(tài)性，包括單堿基的轉(zhuǎn)換(同型堿基的置換，一個嘧啶置換另一個嘧啶；一個嘌呤替換另一個嘌呤)、顛換(異型堿基的置換，即一個嘌呤替換另一個嘧啶；一個嘧啶置換另一個嘌呤)，以及單堿基的插入或缺失等。理論上講，SNP 既可能是二等位多態(tài)性,也可能是3 個或4 個等位多態(tài)性，但實際上，SNP具有偏愛性，后兩者非常少見，幾乎可以忽略。SNP幾乎遍布于整個基因組，非常的豐富。據(jù)估計，在人類基因組中，任何2 個同源染色體間，估計平均每1000個堿基對就有1個SNP。NCBI數(shù)據(jù)庫dbSNP Build 131版中人類（Homo sapiens） SNPs 已有32,017,159個，dbSNP Build128版中豬（Sus scrofa）SNPs已有374,379個/projects/SNP/snp_summary.cgi。單核苷酸多態(tài)性（SNP）是繼限制性片段長度多態(tài)性和微衛(wèi)星之后，新發(fā)展起來的第3代分子標(biāo)記，在人類和動物基因組中普遍存在。具有密度高、雙等位型標(biāo)記、片段較短、遺傳穩(wěn)定性強、易實現(xiàn)高通量自動化檢測和分析、在DNA分子上分布不均勻等特點。作為新的遺傳標(biāo)記，SNP已廣泛應(yīng)用于基因標(biāo)記、基因定位與克隆、性狀關(guān)聯(lián)分析、遺傳多樣性分析、基因組結(jié)構(gòu)與功能研究、連鎖圖譜的構(gòu)建、醫(yī)學(xué)研究和遺傳改良等領(lǐng)域。在動物育種的過程中，為了提高效率，人們一直致力于尋找一些經(jīng)濟(jì)、實用、可靠的分子標(biāo)記。目前，建立在DNA序列基礎(chǔ)上的分子標(biāo)記,具有共顯性、不受環(huán)境和發(fā)育階段的影響等優(yōu)點，已經(jīng)開始在動物育種中運用。由于豬基因組計劃的啟動與運作，并已建立了大量的數(shù)據(jù)庫，公共數(shù)據(jù)庫中已有大量的表達(dá)序列標(biāo)簽（ESTs）、序列標(biāo)簽位點（STSs）、cDNA文庫和基因組測序公開的序列等信息。通過Internet上數(shù)據(jù)庫的序列對比程序（如/BLAST/）對這些來源于不同實驗室不同物種不同個體的序列進(jìn)行比較，刪除由測序造成的堿基錯讀，就可得到候選SNP甚至真實存在的SNP。因為可大大降低檢測SNP的成本，這種策略已被用于構(gòu)建SNP標(biāo)記（Picoult et al., 1999）。而隨著SNP標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)和其定位，家畜遺傳連鎖圖譜標(biāo)記密度將日益升高，這將為家畜育種提供前所未有的便利工具。隨著標(biāo)記密度的升高，基因組掃描能夠?qū)TL定位于更小的染色體區(qū)域內(nèi)，從而為新的主基因的發(fā)現(xiàn)和定位克隆打下良好的基礎(chǔ)；高密度SNP遺傳圖譜的出現(xiàn)使我們可以更精確的進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇（MAS） 和標(biāo)記輔助導(dǎo)入（MAI），降低或消除目的基因之外的遺傳背景對這些技術(shù)帶來的不良影響。而且在不同的動物品種中，SNP的頻率分布存在差異，這些差異可以代表某一品種間的遺傳差異。因此，研究SNP有助于解釋個體的表型差異，不同群體和個體對疾病，特別是對復(fù)雜疾病的易感性，以及對各種藥物的耐受性和對環(huán)境因子的反應(yīng)。1.5 本研究的目的與意義21世紀(jì)豬育種目標(biāo)是在保持和適度提高瘦肉率的前提下，繼續(xù)提高瘦肉組織的生長速度和飼料轉(zhuǎn)化率。（熊遠(yuǎn)著，2000）。骨骼肌生長速度是豬生產(chǎn)性能的主要決定因素。組成動物肌肉的結(jié)構(gòu)單位是肌纖維，此外還含有一定數(shù)量的脂肪和結(jié)締組織。而肌纖維的數(shù)目和大小則主導(dǎo)著豬肉的產(chǎn)量。而且肌肉結(jié)構(gòu)中的脂肪和結(jié)締組織含量及分布與肉品品質(zhì)關(guān)系密切。曾勇慶等(1998)發(fā)現(xiàn)萊蕪豬宰后僵直肌肉肌節(jié)長度與肉品嫩度間呈正相關(guān)，肌節(jié)長度愈大，肌肉愈細(xì)嫩。紅肌纖維含量多的肌肉有較長的肌節(jié)。肌肉表面紋理是肌束大小排列的表現(xiàn)，肌束內(nèi)肌纖維愈細(xì)，肌纖維密度就愈大，則肌肉表面紋絨狀，肉品品質(zhì)優(yōu)良，其肉質(zhì)愈鮮嫩。因此骨骼肌的生長發(fā)育一直以來都是豬遺傳改良工作者研究的重點，但骨骼肌的生長發(fā)育過程十分復(fù)雜，涉及大批基因的表達(dá)及網(wǎng)絡(luò)式調(diào)控。本研究以人中影響肌肉生長發(fā)育的兩個基因作為侯選基因，在豬中進(jìn)行研究，以達(dá)到以下目的：（1）通過比較基因組學(xué)和生物信息學(xué)方法克隆出兩個基因的mRNA序列，并通過測序?qū)ふ覞撛赟NP位點，進(jìn)一步分析SNP位點與經(jīng)濟(jì)性狀間的關(guān)聯(lián)。（2）在我室與通城縣畜牧局合作構(gòu)建的試驗群體中，進(jìn)行標(biāo)記性狀關(guān)聯(lián)分析。上述工作的意義在于：通過對豬肌肉生長發(fā)育相關(guān)基因的克隆與遺傳分析，可以豐富豬基因物理圖譜中基因標(biāo)記信息，為豬分子育種提供基因素材，為標(biāo)記輔助選擇提供分子標(biāo)記。2 材料2.1 DNA樣品用于基因分離的RNA來自通城豬、瑞典長白和英國大白，樣品采自通城原種豬場，RNA已由本研究室提取，于- 20保存?zhèn)溆谩Ｓ糜诨蛐誀铌P(guān)聯(lián)分析的試驗豬群是由我室與通城縣畜牧局和種畜場合作組建的通城純種群體（29頭）、大白（30頭）、長白（27頭）、長大通（28頭）和大長通（27頭）?；蚪MDNA 由本室從血液中采用酚仿抽提法得到，于20保存?zhèn)溆谩?.2 主要儀器設(shè)備主要儀器設(shè)備包括Personal Cycle PCR儀（德國Biometrra公司）、梯度PCR儀（德國Eppendorf）、MJ-100PCR儀（美國MJ公司）、美國產(chǎn)超低溫冰箱，英國Syngene公司產(chǎn)凝膠成像系統(tǒng)、意大利產(chǎn)F100 Icematic制冰機、國產(chǎn)超凈工作臺、自動雙重純水蒸餾器、高壓滅菌鍋、自動搖床、國產(chǎn)冰箱、高壓滅菌鍋、微量移液器、電子天平、國產(chǎn)恒溫培養(yǎng)箱和北京六一儀器廠的各種型號的電泳儀和電泳槽。2.3 主要試劑（1）PCR反應(yīng)所需Taq酶、10PCR buffer、2PCR buffer和dNTPs等從上海伯奧生物科技公司購買。（2）100bp DNA ladder和限制性內(nèi)切酶為MBI Fermentas公司產(chǎn)品；（3）Oligo dT11和其它引物均由北京奧科生物公司合成；（4）0.2mL及0.5mL EP管、水飽和蒸酚、dNTP、電泳用的瓊脂糖、異丙醇和氯仿、氯化鈉、乙醇、礦物油、等其他試劑均為國產(chǎn)；（5）瓊脂糖凝膠DNA快速純化回收試劑盒由原平皓（天津）生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。（6）三羥甲基氨基甲烷（TrisBase）、二水乙二胺四乙酸二鈉鹽（EDTA-Na22H2O）購自Sigma公司。（7）低熔點瓊脂糖購自北京華綠淵生物技術(shù)發(fā)展中心。2.4 主要試劑的配置（1）50TAE儲備液：將242 g Tris堿溶解到750 mL雙蒸水中，加入57.1 mL乙酸和100 mL 的0.5 mol/L 的EDTA（pH8.0），用雙蒸水定容至1000 mL；（2）LB液體培養(yǎng)基：稱取0.5 g酵母浸出物，1g胰蛋白胨，1 g NaCl，溶于90 mL 雙蒸水中，攪拌完全溶解后，用1 mol/L HCl 和1 mol/L NaOH將pH值調(diào)至7.0，定容至100mL，120攝氏度30分鐘高壓滅菌后備用；（3）LB固體培養(yǎng)基：加1.5 g瓊脂粉到100 mL LB液體培養(yǎng)基中，120攝氏度30分鐘高壓滅菌后，在超凈工作臺上鋪平板，每板約5 mL ，冷卻后備用；（4）5Tris-甘氨酸電泳緩沖液：將15.1 g Tris堿和94 g甘氨酸融解到900 mL雙蒸水中，然后加入50 mL 10 (m/V)的SDS貯存液，雙蒸水定容到1L；（5）氨芐青霉素（Amp）：為Sigma公司公司產(chǎn)品，用滅菌雙蒸水溶解成儲存濃度50 mg/mL，-20保存?zhèn)溆茫唬?）瓊脂糖電泳上樣緩沖液：0.25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯青FF，25%聚蔗糖水溶液；2.5 載體和菌株pMD18-T載體由寶生物工程（大連，Takara）有限公司生產(chǎn)大腸桿菌DH13和BL21為華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院病毒室惠贈。2.6 主要分子生物學(xué)軟件、統(tǒng)計軟件和相關(guān)網(wǎng)站（1）Primer 1.0和Premier 5.0用于引物設(shè)計，Premier 5.0用于酶切位點分析， DNAstar 5.01用于DNA序列處理，Chromas 2.22用于測序峰圖分析。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析軟件是SAS 8.0。（2）GenBank: / （可滿足各方面的序列數(shù)據(jù)庫查詢要求）（3）Entrez系統(tǒng)： /gquery/gquery.fcgi?itool=toolbar （提供整體信息的搜索和訪問）；（4）PubMed數(shù)據(jù)庫：/entrez/query.fcgi?db=PubMed （參考文獻(xiàn)的追蹤和獲得）；（5）BLAST程序：/BLAST/ （序列比對）3 方法3.1 豬 Nudt6 和 Tcta 基因的分離方法3.1.1 豬EST信息的獲取和整理表達(dá)序列標(biāo)簽（expressed sequence tags,ESTs）序列是基因表達(dá)的短cDNA序列（通常只有300-500bp），通常來源于不同的物種不同的組織，它們攜帶著完整基因的某些片段的信息。到2010年5月，GenBank數(shù)據(jù)庫中人的EST序列已達(dá)到8301475條，豬的EST序列已達(dá)到1621000條，它已經(jīng)覆蓋了豬基因組的大部分。利用計算機來協(xié)助克隆的第一步是必須獲得感興趣的EST，在dbEST數(shù)據(jù)庫中找出EST的最有效途徑是以目的基因為種子序列，搜索其在其它物種中的同源序列。因此，本研究從GenBank數(shù)據(jù)庫中尋找所需的人和小鼠基因的cDNA的參考序列。并以此為信息探針（種子序列），利用NCBI中的Nucleotide-nucleotide BLAST工具（/BLAST/），在GenBank EST數(shù)據(jù)庫中做同源序列篩選，獲得一系列同源性大于85%以上的，長度大于100bp的豬的EST全部下載到電腦上，進(jìn)行克隆研究。如圖3-1中所示。3.1.2 引物設(shè)計以拼接的EST序列作為引物設(shè)計的模板序列，利用生物學(xué)引物設(shè)計軟件Primer Premier 5.0，手動調(diào)整引物位置，用軟件自動分析引物結(jié)構(gòu)、GC含量、Tm值等參數(shù)，并對引物對給出整體評分，確保有效引發(fā)與擴增序列保守兩相兼顧。設(shè)計了分離兩個基因部分序列的引物，每個基因設(shè)計了兩對引物。用于分離兩個基因的引物見表3-1，引物由武漢思特競生物技術(shù)公司合成。表3-1 用于分離基因的引物信息與PCR擴增條件Table 3-1 The primer information and PCR conditions used for isolating the four genes基因符號Gene symbols引物序列Primer sequences(5-3 )擴增片段長度Size (bp)退火溫度Tann (C)Nudt6PNuCS1：GCATCTCGGTGAAACTAGACPNuCA2：CGAATACTCAGGAGGGACAT45454PNuCS2：AGCCTGGAGAAGATATTGGAPNuCA1：ATAGCATTTACCATTATCCAGT65054TctaPTcCS1：CGCCACAACTGCCAACTCTGPTcCA2：TGTGTCCAGGCCAGGATTCC94063PTcCS2：GGAATCCTGGCCTGGACACAGPTcCA1：CCTGATGCTGAGTGTGGTGTCG940653.1.3 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（RT-PCR）將已提取的通稱、長白、大白的RNA（RNA已經(jīng)由本實驗室制備本在-20凍存）稀釋至1 g/L。cDNA第一鏈的合成的反應(yīng)體系是50 L，將已稀釋RNA取2 L（含RNA2 g）于滅菌的Ep管中，加入10 M的oligod(T)11 5 L，加入DEPC處理過的H2O至總體積15 L?；靹蛏晕㈦x心，于70溫育（以解除RNA的二級結(jié)構(gòu)）5min后，立即置于冰上12min防止二級結(jié)構(gòu)的重新生成。然后加入35 L的其他組分，包括：M-MLV 1 L (40 U)，5buffer 10 L，dNTP 2.5 L，1 L Rnasin (40 U)和DEPC 處理H2O 21 L.混勻離心，置于37溫育1小時，95，5 min滅活。反轉(zhuǎn)錄的cDNA于-20保存。3.1.4 PCR擴增 PCR反應(yīng)體系PCR反應(yīng)總體積為20L，擴增總體系10 L，其中礦物油10L。擴增模板是肌肉組織總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA，且每對引物都要以通稱、長白和大白三個品種的cDNA作為模板擴增。擴增總體系10 L包括25ng/L DNA模板1.00L ，10 pmol/L正反向引物各0.20L，2 U Taq DNA聚合酶0.1 0L，10PCR緩沖液（含20mol/L Mg2+）1L（或2PCR緩沖液5L），加雙烝水至10 L。 PCR反應(yīng)程序引物對（PNuCS1PNuCA2）的反應(yīng)程序為95，5min；38(94，30 s；54，30 s；72 ，25 s)；72 ，7min；15，2min。引物對（PNuCS2PNuCA1）的反應(yīng)程序為95，5min；38(94，30 s；54，30 s；72 ，30 s)；72 ，7min；15，2min。引物對（PTcCS1PTcCA1）的反應(yīng)程序為95，5min；38(94，30 s；63，30 s；72 ，40s)；72 ，7min；15，2min。引物對（PTcCS1PTcCA1）的反應(yīng)程序為95，5min；38(94，30 s；65，30 s；72 ，40s)；72 ，7min；15，2min。 PCR擴增產(chǎn)物檢測制備1-2%瓊脂糖凝膠，將待檢DNA樣品(2L)和瓊脂糖上樣緩沖液混合后加入瓊脂糖凝膠點樣孔，100-120V電壓電泳至目的帶可以區(qū)分，紫外分析儀下觀察結(jié)果，并用凝膠成像系統(tǒng)拍照。3.1.5 PCR產(chǎn)物的純化、克隆和測序 PCR產(chǎn)物回收純化在紫外燈照射下，從瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放入1.5 mL Ependorff管中，加入足夠的溶膠液（約3倍于凝膠），于70溫育至凝膠完全融化，然后用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物，按照試劑盒說明書操作，具體步驟是 ：將融化的凝膠液取出，放入另一個干凈的1.5 mL吸附柱中。12000r/min ，離心2分鐘；倒掉下層溶膠液，加入700L漂洗液，12000r/min ，離心1分鐘；倒掉下層漂洗液，加入500L漂洗液，12000r/min ，離心1分鐘；倒掉下層漂洗液，12000r/min ，離心3分鐘；將吸附柱取出放入另一干凈的1.5 mL Ependorff管中，打開吸附柱管蓋，室溫下放置10分鐘左右，使得乙醇完全揮發(fā)，以免影響后續(xù)試驗。取35-50L提前預(yù)熱的雙蒸水（50-60C預(yù)熱），懸空添加到吸附膜中間，12000r/min ，離心2分鐘?；厥债a(chǎn)物于-20C保存。 純化PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體的連接連接反應(yīng)總體積是10L，其中包括5L 2Solution，0.5 L的pMD18-T載體，3L的純化PCR產(chǎn)物，0.5 L的T4連接酶。在4冰箱中，過夜（約12 h）連接。 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化在超凈工作臺上，取200 L感受態(tài)細(xì)胞到1.5 mL Ependorff管中，加入5 L的連接產(chǎn)物并混勻，在冰上靜置30 min（冰浴過程中不能搖動Ependorff管），42 熱激90 s（熱激過程中不能搖動Ependorff管），取出后冰浴23 min（冰浴過程中不能搖動Ependorff管），加入500 L無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37緩慢振蕩（200-220 r/min）培養(yǎng)45分鐘后，取出低速離心（6000 r/min）棄去500 L上清液，輕輕搖勻，取出勻液涂布于已提前4 h涂布了含濃度為60 g/mL 氨芐青霉素的瓊脂平板上，37平放1 h后倒置培養(yǎng)12 h。 PCR擴增鑒定陽性克隆取1L菌液為模板進(jìn)行PCR擴增，并對擴增結(jié)果進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果與預(yù)計完全相同并無雜帶者，其菌液中為所要目的重組質(zhì)粒。 序列測定與比對分析將含有PCR擴增鑒定為陽性克隆的重組質(zhì)粒的菌液送至北京奧科生物技術(shù)公司進(jìn)行序列測定。測序公司返還的序列文件，用SeqMan軟件來拼接正反向測序序列，使之成為一段包含正反引物測序序列的完整DNA片斷序列。對于一些較長的測序片段，在550bp以后部分的測序質(zhì)量有所下降，容易出現(xiàn)漏讀與錯讀的錯誤，不能單憑序列文件給出的結(jié)果直接拼接，必須用Chromas 2.22軟件來瀏覽測序峰圖，仔細(xì)核對峰圖和序列，待修正測序錯誤后才可進(jìn)行序列拼接。之后，利用Seqman軟件，對同一對引物的、不同品種（通稱、長白和大白）的測序結(jié)果進(jìn)行比對分析，將沒有雙峰且具有不同堿基的位點，暫定為突變位點。待進(jìn)一步分析。3.2 PCR-RFLP方法檢測豬Nudt6多態(tài)性RFLP是由于堿基的變異可能導(dǎo)致酶位切點的消失或新的切點出現(xiàn)，從而引起不同個體在用同一限制酶切時，DNA片段長度出現(xiàn)差異。這種由于限制性內(nèi)切酶切點變化所導(dǎo)致的DNA片段長度的差異，稱為限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymporphism，RFLP）。RFLP反映了常見的個體間DNA的可遺傳性變異，它按照孟德爾方式遺傳。RFLP是發(fā)展最早的分子標(biāo)記技術(shù)，凡是可以引起酶切位點變異的突變?nèi)琰c突變（新產(chǎn)生和去除酶切位點）和一段DNA的重新組織（如插入和缺失造成酶切位點間的長度發(fā)生變化）等均可導(dǎo)致RFLP的產(chǎn)生。3.2.1 重新設(shè)計引物，進(jìn)行PCR擴增根據(jù)找到的突變位點，重新設(shè)計引物。并根據(jù)突變位點，購買合適的限制性內(nèi)切酶，擴增出包含突變位點的DNA序列。表3-2 用于檢測基因多態(tài)的引物信息與PCR擴增條件Table 3-2 The primer information and PCR conditions used for detection genes SNPs基因符號Gene symbols引物序列Primer sequences(5-3 )限制性內(nèi)切酶擴增片段長度Size (bp)退火溫度Tann (C)酶切溫度(C)Nudt6NuSNP2S：AACTGCCAGACAATTACAAAACNuSNP2A：TCATGAAAATCACAGGCATTAGNlaIII17256373.2.2 酶切取出3LPCR產(chǎn)物加入50L EP管中，加入1.9L雙蒸水，5L 2Buffer以及0.1L限制性內(nèi)切酶，在相應(yīng)酶切溫度下酶切12小時。3.2.3 基因分型用3-4%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果，凝膠成像系統(tǒng)成像，記錄基因型結(jié)果。3.3 多態(tài)標(biāo)記與性狀的關(guān)聯(lián)分析方法將記錄的基因型信息輸入SAS9.0統(tǒng)計軟件,利用最小二乘法擬合線性模型進(jìn)行分析。4 結(jié)果4.1 PCR擴增產(chǎn)物檢測設(shè)計引物后，以大白豬，長白豬和通城豬的肌肉cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴增，將所得的PCR產(chǎn)物回收。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖膠凝膠電泳檢測，結(jié)果如下圖。從圖中可以看出沒有雜帶出現(xiàn)，因此可以用于連接轉(zhuǎn)化。4.2 SNP檢測結(jié)果從豬cDNA中擴增