高級生化復習資料習題集

名詞解釋：親和層析：蛋白質分子能對配基專一性地結合成復合物，改變條件，又能分離，利用這種特性而設計的一種層析技術。蛋白質完全水解：即將所有的肽鍵都打斷，使蛋白質完全裂解為氨基酸。蛋白質部分水解：即將蛋白質的部分肽鍵打開，進而部分地分離出所需氨基酸。高效液相層析：采用大幅度降低支持物的顆粒度，同時增加壓力，以維持必要的流速，而設計的層析方法。超二級結構：由若干相鄰的二級結構單元結合在一起，彼此相互作用，形成有規(guī)則的在空間上能辨認的二級結構組合體，充當三級結構的構件。結構域：對于較大的蛋白質分子或亞基，多肽鏈在超二級結構的基礎上組裝成兩個或兩個以上的相對獨立的三維實體，再締合成三級結構，這種相對獨立的三維實體即蛋白質的鹽溶：中性鹽對蛋白質的溶解度可產生兩種影響，低濃度時可增加蛋白質的溶解度，這種現象稱為鹽溶。鹽析：當鹽的濃度增高時，如飽和和半飽和狀態(tài)，蛋白質溶解度降低，從水溶液中沉淀出來。密度梯度區(qū)帶離心：蛋白質顆粒的沉降速度與分子大小和密度相關，在具有密度梯度的介質中離心時。質量和密度大的顆粒比質量和密度小的顆粒沉降的快，并且每種蛋白質顆粒沉降到與自身密度相等的介質密度梯度中。蛋白質組：一個細胞或組織或機體所包含的所有蛋白質，現定義為基因組表達的全部蛋白質。具有三種含義：一個基因組、一種生物、一種細胞所表達的全部蛋白質。蛋白質組學：以蛋白質組為研究對象，分析細胞內動態(tài)變化的蛋白質組成成分、表達水平和修飾狀態(tài)，了解蛋白質間的相互作用與聯(lián)系，在整體水平上研究蛋白質的組成與調控的活動規(guī)律。噬菌體展示技術：是將外源的DNA通過基因工程技術克隆到噬菌體載體上，使外源DNA片段對應的表達產物融合在噬菌體的衣殼蛋白上形成融合蛋白，呈現在噬菌體表面，被展示的多肽或蛋白可保持相對的空間結構和生物活性。外源基因產物在過柱時，如柱上含有目的蛋白質，則可特異性結合相應抗體。生物信息學：在生命科學、計算機科學和數學的基礎上逐步發(fā)展而形成的一門新興交差學科。是為理解各種數據的生物意義，運用數學和計算機科學手段進行生物信息的收集、加工、存儲、傳播和解析的科學。使蛋白質沉淀的方法：1）、鹽析法：中性鹽對球狀蛋白質的溶解度可能產生兩種影響，低濃度時可增加蛋白質的溶解度，這種現象稱為鹽溶。當鹽濃度增大時，如飽和或不飽和狀態(tài)，蛋白質溶解度降低，從水溶液中沉淀出來，這種現象稱為鹽析。鹽析的而主要作用是由于大量的中性鹽的加入，鹽離子與水這種偶極分子作用，使水分子活度降低，原來溶液中的大部分甚至全部的自由水轉變?yōu)辂}離子的水化水，導致蛋白質水合程度的減少，從而使蛋白質溶解度降低。2）、有機溶劑法：有機溶劑中有較低的介電常數，根據庫倫定律，介電常數降低，將增加兩個相反電荷之間的吸引力。在等電點附近，蛋白質分子主要以偶極離子形式存在，這時如果添加有機溶劑，使蛋白質溶液的介電常數減小，增強偶極離子間的靜電引力，從而使蛋白質分子聚合而沉淀。有機溶劑自身的水合作用會破壞蛋白質表面的水合層，也使蛋白質分子變得不穩(wěn)定而沉淀出來。3）、蛋白質沉淀劑法：向蛋白質水溶液中加入沉淀劑，使一些雜蛋白或粘多糖發(fā)生沉淀，這些沉淀物可以通過離心分離而除去。4）、等電點沉淀：不同的蛋白質有不同的等電點，利用不同蛋白質等電點的差異，調節(jié)溶液pH等于所需蛋白質的等電點，則所需蛋白質結絮沉淀。氨基酸個性研究的重要性解釋蛋白質結構與功能的關系， 從一級結構預測高級結構氨基酸個性了解得越深刻，在根據一級結構預測蛋白質的立體結構時，考慮問題也就越全面，預測的正確性也就越高。維持空間構象的因素1 共價鍵蛋白質分子中的共價鍵有肽鍵和二硫鍵。是生物大分子分子之間最強的作用力，化學物質（藥物、毒物等）可以與生物大分子（受體蛋白或核酸）構成共價鍵，共價鍵除非被體內的特異性酶催化斷裂以外，很難恢復原形，是不可逆過程，對酶來講就是不可逆抑制作用。2 非共價鍵生物體系中分子識別的過程不僅涉及到化學鍵的形成，而且具有選擇性的識別。共價鍵存在于一個分子或多個分子的原子之間，決定分子的基本結構，是分子識別的一種方式。而非共價鍵（又稱為次級鍵或分子間力）決定生物大分子和分子復合物的高級結構，在分子識別中起著關鍵的作用。1)靜電作用靜電作用是指荷電基團、偶極以及誘導偶極之間的各種靜電吸引力。酶、核酸、生物膜、蛋白質等生物大分子的表面都具有可電離的基團和偶極基團存在，很容易與含有極性基團的底物或抑制劑等生成離子鍵和其它靜電作用（1)離子鍵生物大分子表面的帶電基團可以與藥物或底物分子的帶電基團形成離子鍵。這種鍵可以解離。(2)離子偶極作用分子中O、S、N和C原子的電負性均不相等，這些原子形成的鍵由于電負性差值可以產生偶極現象。這種偶極部分與永久電荷可以形成靜電作用.離子-偶極相互作用一般比離子鍵小得多，鍵能與距離的平方差成反比，由于偶極矩是個向量，電荷與偶極的取向會影響作用強度。(3)偶極-偶極相互作用兩個原子的電負性不同，產生價鍵電子的極化作用，成為持久的偶極兩個偶極間的作用。偶極偶極相互作用的大小，取決于偶極的大小、它們之間的距離和相互位置。這種相互作用在水溶液中普遍存在。它的作用強度比離子偶極作用小，但比偶極誘導偶極作用大2)氫鍵氫鍵的形成 氫鍵是由兩個負電性原子對氫原子的靜電引力所形成，是一種特殊形式的偶極偶極鍵。它是質子給予體X-H和質子接受體Y之間的一種特殊類型的相互作用。 氫鍵的大小和方向 氫鍵的鍵能比共價鍵弱，比范德華力強3)范德華力這是一種普遍存在的作用力，是一個原子的原子核吸引另一個原子外圍電子所產生的作用力。它是一種比較弱的、非特異性的作用力。這種作用力非常依賴原子間的距離，當相互靠近到大約0.40.6nm時，這種力就表現出較大的集合性質。范德華力包括引力和排斥力。4)疏水作用疏水作用是指極性基團間的靜電力和氫鍵使極性基團傾向于聚集在一起，因而排斥疏水基團，使疏水基團相互聚集所產生的能量效應和熵效應。蛋白質和酶的表面通常具有極性鏈或區(qū)域，這是由構成它們的氨基酸側鏈上的烷基鏈或苯環(huán)在空間上相互接近時形成的。高分子的蛋白質可形成分子內疏水鏈、疏水腔或疏水縫隙，可以穩(wěn)定生物大分子的高級結構蛋白質的時空特性1.蛋白質的空間性 信號肽對蛋白質或肽鏈的定向傳送已成為蛋白質研究的一個很重要的方面。 特征結構：溶酶體酶分子中的甘露糖-6-磷酸 酶原及酶原激活 同形異位突變2.蛋白質的時間性 腫瘤發(fā)生時出現胚胎分化早期所出現的Pr，如肝癌出現的甲胎蛋白。 細胞周期不同時期蛋白質表達的調控是又一個重要研究領域。分離純化依據的性質1大小蛋白質的大小各不相同，可從含幾個氨基酸的小肽（幾百個Da）至含10 000多個氨基酸（上百萬個Da）的巨大蛋白質不等。多數蛋白質的分子量在10 000150 000Da之間。2形狀蛋白質形狀有近似球形的，也有很不對稱的。在離心、凝膠過濾或凝膠電泳過程中都會受到形狀的影響。3電荷蛋白質的靜電荷取決于氨基酸殘基所帶正、負電荷的總和。一蛋白質中，若天冬氨酸和谷氨酸殘基占優(yōu)勢，在pH7.0時帶凈負電荷，則稱之為酸性蛋白；若賴氨酸和精氨酸殘基占優(yōu)勢，則認為是堿性蛋白質。4等電點等電點（pI）是蛋白質上凈電荷為零時的pH值，由蛋白質上帶正、負電荷的氨基酸殘基數目和滴定曲線所決定。5電荷分布 電荷的氨基酸可均勻地分布于蛋白質的表面，亦可成簇地分布，使某一區(qū)域帶強的正電荷而另一區(qū)域帶強負電荷。這種非隨機的電荷分布可用來通過離子交換層析來分離蛋白質。6疏水性多數疏水性氨基酸殘基藏在蛋白質的內部，但也有一些可見于表面。蛋白質表面的疏水性氨基酸殘基的數目和空間分布決定了該蛋白質是否具有與疏水柱填料結合從而利用它來進行分級分離的能力。7溶解度蛋白質在不同溶劑中的溶解度有很大不同，從基本不溶（300 mg/ml)不等。影響蛋白質溶解度的因素包括pH、離子強度、離子的性質、溫度和溶劑的極性。蛋白質在其等電點處一般較不易溶解8密度 多數蛋白質的密度在1.31.4g/cm3之間。分級分離蛋白質時一般不用這個性質。但是，在含有大量磷酸鹽（如卵黃高磷蛋白，密度為1.8）或脂質部分（如脂蛋白，密度為1.03）的蛋白質，與一般蛋白質在密度上確有不同，可用密度梯度法將它們從大部分蛋白質中分離出來。9配體結合能力 有許多酶能相當緊地域底物、效應分子、輔助因子和DNA模板?？衫糜H和層析分離10金屬結合能力 有許多酶能與某些金屬離子（如Cu2+、Zn2+、Ca2+、Co2+和Ni2+)緊密結合。主要是其半胱氨酸或組氨酸殘基可與金屬離子作用，可通過金屬離子螯合柱將酶固定11可逆性締合 在某些溶液條件下，有一些酶能聚集成二聚體、四聚體等。如大腸桿菌RNA聚合酶在0.05mol/L NaCl溶液中形成二聚體，在0.3mol/L NaCl溶液中為單體，可利用這一性質，相繼在不同條件下按大小進行分級分離。12. 翻譯后修飾 許多蛋白質在合成后要通過加入糖基、?；?、磷酸基團或種種其他部分來進行修飾。這些修飾提供了可用于分級分離的依據。如糖蛋白能與含有外援凝集素的柱子結合，外源凝集素是一類能牢固地與某些糖基部分結合的分子。13. 特異性序列或結構 氨基酸殘基在蛋白質表面上的精確的幾何表象可用來作為分離方法的基礎。例如，?？傻玫街荒茏R別蛋白質上的特定部位（表位）的抗體。把只能與待分離蛋白質結合的單特異性抗體連接于填料上，可制備成免疫親和柱。14. 非尋常性質 除上述各種性質外，某些蛋白質還有一些不尋常的性質，如不尋常的熱穩(wěn)定性、抗蛋白酶解的抗性等。例如大腸桿菌堿性磷酸酯酶的純化，將細胞提取物加熱后離心去除凝結的蛋白質，然后用蛋白酶處理含有磷酸酯酶的上清液，該酶消化剩余的雜蛋白，留下基本純凈的堿性磷酸酯酶。15.基因工程構建的純化標記 隨著基因工程技術的進步，克隆編碼某一蛋白質的cDNA已變得比較容易。通過改變cDNA而在被表達蛋白質的氨基端或羧基端加入少許幾個額外氨基酸，這個加入的“標記”可用來作為一種有些的純化依據。最通行的標記之一是在蛋白質的氨基端加上610個組氨酸，這樣可以使肽鏈能與Ni2+螯合柱緊密結合，經洗脫，再用游離咪唑洗脫或通過將pH降至5.9，使組氨酸充分質子化，與Ni2+分離而使蛋白質得以純化。分離純化的一般步驟（一）前處理1、選材2、破碎3、混合物的分離植物組織和細胞，由于具有由纖維素、半纖維素和果膠等物質組成的細胞壁，一般需要用與石英砂或玻璃粉和適當的提取液一起研磨的方法破碎或用纖維素酶處理也能達到目的。 細菌整個細菌細胞壁的骨架實際上是一個借共價鍵連接而成的肽肽聚糖囊狀大分子，非常堅韌。破碎細菌細胞壁的常用方法有超聲波震蕩，與砂研磨、高壓擠壓或溶菌酶處理（以分解肽聚糖）等。組織和細胞破碎以后，選擇適當的緩沖液把所要的蛋白質提取出來。細胞碎片等不溶物用離心或過濾等方法除去。 如果所要的蛋白質主要集中在某一細胞組分，如細胞核、染色體、核糖體或可溶性的細胞質等，則可利用差速離心方法將它們分開，收集該細胞組分作為下步純化的材料。（二）粗分級分離（1）鹽析（2）等電點沉淀（3）有機溶劑分級分離（4）超濾（5）凝膠過濾（6)冷凍干燥當蛋白質提取液（有時還雜有核酸、多糖之類）獲得后，選用一套適當的方法，將所要的蛋白質與其他雜蛋白分離開來。一般這一步的分級分離用鹽析、等電點沉淀和有機溶劑分級分離等方法。這些方法的特點是簡便、處理量大既能除去大量雜質（包括脫鹽），又能濃縮蛋白質溶液。有些蛋白質提取液體積較大，又不適于用沉淀或鹽析法濃縮，則可采用超過濾、凝膠過濾、冷凍真空干燥或其他方法（如聚乙二醇濃縮法）進行濃縮。（三）細分級分離 一般使用層析法包括凝膠過濾，離子交換層析，吸附層析以及親和層析等。必要時還可選擇電泳法，包括區(qū)帶電泳、等電聚焦等作為最后的純化步驟。用于細分級分離的方法一般規(guī)模較小，但分辨率很高。 結晶是蛋白質分離純化的最后步驟。盡管結晶并不能保證蛋白質一定是均一的，但只有某種蛋白質在溶液中數量上占優(yōu)勢時才能形成結晶。結晶過程本身也伴隨著一定程度的純化，而重結晶又可除去少量夾雜的蛋白質。由于結晶中從未發(fā)現過變性蛋白質，因此蛋白質的結晶不僅是純度的一個標志，也是斷定制品處于天然狀態(tài)的有力指標。3.細分級分離結晶是蛋白質分離純化的最后步驟。盡管結晶并不能保證蛋白質一定是均一的，但只有某種蛋白質在溶液中數量上占優(yōu)勢時才能形成結晶。結晶過程本身也伴隨著一定程度的純化，而重結晶又可除去少量夾雜的蛋白質。由于結晶中從未發(fā)現過變性蛋白質，因此蛋白質的結晶不僅是純度的一個標志，也是斷定制品處于天然狀態(tài)的有力指標。 4. 結晶方法(Crystallization Techniques) 4.1 分批結晶(Batch Crystallization) 這是最老的最簡單的結晶方法，其原理是同步地在蛋白質溶液中加入沉淀劑，立即使溶液達到一個高過飽和狀態(tài)。幸運的話，不需進一步處理即可在過飽和溶液中逐漸長出晶體。一個用于微分批結晶的自動化系統(tǒng)已被Chayen等人設計出（1991，1992），其微分批方法中，他們在1-2l包含蛋白質和沉淀劑的液滴中生長晶體。液滴被懸浮在油（如石蠟）中，油的作用是作為封層以防止蒸發(fā)，它并不干擾普通沉淀劑，但是干擾能溶解油的有機溶劑(Chayen, 1997; see also Chayen, 1998)。 4.2 液-液擴散(LiquidLiquid Diffusion) 這種方法中，蛋白質溶液和含有沉淀劑的溶液是彼此分層在一個有小孔的毛細管中，一個測熔點用的毛細管一般即可（如圖1.2）。下層是密度大的溶液，例如濃硫酸銨或PEG溶液。如果有機溶劑如MPD被用作沉淀劑，它會在上層。以1：1混合，沉淀劑的濃度應該是所期最終濃度的二倍。兩種溶液（各自約5l）通過注射器針頭導入毛細管，先導入下層的。通過一個簡易的搖擺式離心機去除氣泡。再加入上層，進而兩層之間形成一個明顯的界面，它們會逐漸彼此擴散。 Garc?a-Ruiz and Moreno（1994）已經發(fā)展液-液擴散技術至針刺法。蛋白質溶液通過毛細力被吸入狹窄的管中，管的一端是封閉的。接著，開放端被插入置于小容器的凝膠中，凝膠使得管豎直，蛋白質溶液與凝膠接觸。含有沉淀劑的溶液被倒在凝膠上，整個裝置被保存于封閉的盒子以防蒸發(fā)。沉淀劑通過凝膠和毛細管的擴散時間可以由毛細管插入凝膠的深度控制，從而蛋白質溶液中即可形成過飽和區(qū)域，毛細管底部高而頂部低。這也可作為一個篩選最佳結晶條件的額外信息。 4.3 蒸氣擴散（Vapor Diffusion） 4.3.1 懸滴法（The Hanging Drop Method）這種方法中，在一個硅化的顯微鏡蓋玻片上通過混合3-10l蛋白質溶液和等量的沉淀劑溶液來制備液滴。蓋玻片置于一個盤子的凹槽之上，凹槽的一部分填有所需的沉淀劑溶液約1ml。在蓋玻片放好之前，小室的凹槽周圍用油或油脂密封（如圖3）。 4.3.2 沉滴法（The Sitting Drop Method）在懸滴法中，如果蛋白質溶液表面張力很小就會在蓋玻片表面展開。此時，沉滴法更有利，圖4給出了沉滴法的簡圖。 4.4 透析法（Dialysis） 除了上述使得蛋白質結晶的方法，還有許多透析技術。透析的優(yōu)點是沉淀溶液容易改變，對于適量的蛋白質溶液（多于0.1ml），可用透析管完成（如圖1.5a）。透析膜通過橡皮圈連在管子上，但在使用前要用水大量漂洗或最好在水中煮約10min。對微升量的蛋白質溶液而言，可以使用覆有透析膜的厚壁微毛細管（Zeppezauer method）或者樹脂玻璃紐扣（如圖1.5b）。紐扣的缺點是紐扣中的蛋白質晶體不能通過極化顯微鏡觀察到。 另一中微透析方法在圖1.6中有描述，將5l蛋白質溶液注射到一個毛細管中，毛細管覆有透析膜，膜可用塑料管套緊。對蛋白質溶液進行簡單離心，然后用鑄模粘土將毛細管封閉，接著將毛細管放入含有透析液的Eppendorf管中。依據分子大小不同的純化方法1. 透析和超濾透析只用于除鹽類和小分子雜質透析是利用蛋白質等大分子不能通過半透膜的性質，使蛋白質和其它小分子物質如無機鹽單糖等分開。常用的半透膜： 玻璃紙（賽璐玢紙，cellophane paper） 火綿紙（賽璐玎紙, celloidin paper） 其他改型纖維素材料超濾（ultrafiltration） 除小分子雜質，分離、濃縮蛋白質利用壓力、抽濾（A）或離心力（B）等多種形式，強行使水和其它小分子溶質通過半透膜，而蛋白質被截留在膜上，以達到濃縮和脫鹽目的。濾膜有多種規(guī)格，可選擇性的截留相對分子量不同的蛋白質。 為了避免被膜截留的蛋白質在膜表面上堆積，現常用截向流過濾的方法，即液體在泵驅動下沿著與膜表面相切方向流動，在膜上形成壓力，使部分液體透過膜，而另一部分液體切向地流過表面將被膜截留的蛋白質分子沖走。2. 密度梯度離心生物大分子及顆粒的沉降不僅決定于它的大小，而且也取決于它的密度。顆粒在具有密度梯度的介質中離心時，質量和密度大的顆粒沉降的快，并且每種蛋白質顆粒沉降到與自身密度相等的介質密度梯度時，即停止不前，最后各自在離心管中被分離成獨立的區(qū)帶。分成區(qū)帶的樣品可以在管底刺一個小孔逐滴放出，分步收集。常用的介質有蔗糖、氯化銫等。3. 凝膠層析又叫分子篩層析。 分子篩是具有三維空間網狀結構的物質，有天然的，也可人工合成。根據網孔不同可制成不同規(guī)格。具備條件：1惰性，2水不溶性，3能高度水化。常用分子篩： 葡聚糖凝膠（Sephadex） 型號：G200、 G150、 G100、 G75、 G50、 G25、 G15 分離大蛋白質、小蛋白質，除鹽 瓊脂糖凝膠（瑞典Sepharose、美國Bio-GelA） 孔徑大，用于分離大分子物質 聚丙烯酰胺凝膠（ Bio-GelP）原理： 凝膠層析也稱為排阻凝膠層析、凝膠過濾和分子篩層析。它是60 年代發(fā)展起來的，利用凝膠把物質按分子大小不同進行分離的一種方法。由于被分離物質的分子大?。ㄖ睆剑┖托螤畈煌?，洗脫時，大分子物質由于直徑大于凝膠網孔不能進入凝膠內部，只能沿著凝膠顆粒間的孔隙，隨溶劑向下移動，因此流程短，首先流出層析柱，而小分子物質，由于直徑小于凝膠網孔，能自由進出膠粒網孔，使之洗脫時流程增長，移動速度慢而后流出層析柱。依據電荷不同的純化方法1. 電泳概述 電泳分離蛋白質是根據蛋白質在電場中的遷移的差別達到分離目的的。蛋白質樣品加到一塊預先制好的凝膠介質上，只要在凝膠的兩端加上電場，就可以達到分離蛋白質的目的，這樣的電泳稱之凝膠電泳（gel electrophoresis）。凝膠可以是淀粉凝膠（starch gel）、瓊脂糖凝膠（agarose gel）和聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamide gel）。一般凝膠介質中的pH被維持在堿性區(qū)，目的是使大多數蛋白質都帶有負電荷，這樣它們可以向陽極遷移。蛋白質的遷移與蛋白質的質量和帶電荷的多少有關。2. 聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis,簡稱PAGE)，也稱圓盤凝膠電泳或圓盤電泳 (disc gel electrophoresis)，它是在區(qū)帶電泳的基礎上發(fā)展起來的。它以聚丙烯Ift胺凝膠為支持物，一般制成凝膠柱或凝膠板，凝膠是由相連的二部分組成（小的部分是濃縮膠，大的部分是分離膠），這二部分凝膠的濃度（孔徑大小）、緩沖液組分和離子強度,pH以及電場強度都是不同的，即不連續(xù)的。這樣,電泳時樣品首先在不連續(xù)的兩相間積聚濃縮而成很薄的起始區(qū)帶（厚度約為0.1 mm），然后再進行電泳分離。PAGE是用丙烯酰胺(acrylamide，Acr)和交聯(lián)劑亞甲基雙丙烯酰胺(N，N-methylen。bisacrylamide，Bis)在催化劑的作用下聚合而成，聚合反應的催化系統(tǒng)有兩種。 化學聚合:催化劑過硫酸銨(AP)，加速劑TEMED 光聚合:催化劑核黃素，加速劑TEMED 不連續(xù)PAGE三種效應：電荷效應、分子篩效應和濃縮效應聚丙烯酰胺凝膠(PAG)具有三維網狀結構，能起分子篩作用。用它作電泳支持物，對樣品的分離取決于各組分所帶電荷的多少及分子大小。聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)還具有濃縮效應，即在電泳開始階段，由于不連續(xù)pH梯度作用，將樣品壓縮成一條狹窄區(qū)帶，從而提高了分離效果。3. 毛細管電泳毛細管電泳又稱毛細管區(qū)帶電泳，它是在毛細管（f2-75m）中裝入緩沖液，從其一端注入樣品，在毛細管兩端加高壓直流電實現對樣品的分離，分離后的樣品依次通過設在毛細管一端的檢測器檢出。該法克服了傳統(tǒng)區(qū)帶電泳的熱擴散和樣品擴散的問題，實現了快速和高效分離。 毛細管電泳是近年來發(fā)展起來的一項新技術，被認為是90年代最有影響的分離手段之一。目前已廣泛用于氨基酸分析、蛋白質高效分離、指紋圖譜研究、分離合成的寡核苷酸、 DNA序列測定及PCR產物的分析鑒定等。毛細管電泳又稱高效毛細管電泳( High Performance Capillary Electrophoresis, HPCE) 是一種儀器分析方法。通過施加10-40kV的高電壓于充有緩沖液的極細毛細管，對液體中離子或荷電粒子進行高效、快速的分離?，F在，HPCE已廣泛應用于氨基酸、蛋白質、多肽、低聚核苷酸、DNA等生物分子分離分析，藥物分析，臨床分析，無機離子分析，有機分子分析，糖和低聚糖分析及高聚物和粒子的分離分析。人類基因組工程中DNA的分離是用毛細管電泳儀進行的。4. 等電聚焦原理: 在一定抗對流介質（如凝膠）中加入兩性電解質載體(Ampholyte,是一種多氨基多羧基的混合物，由異構物和同系物組成，其pK和pI值各自相異卻又相近），當直流電通過時，便形成一個由陽極到陰極pH值逐步上升的梯度。兩性化合物在此電泳過程中，就被濃集在與其pI相等的pH區(qū)域，從而使不同化合物能按其各自等電點得到分離。應用：高效率分離純化蛋白質 測定蛋白質pH5. 層析聚焦 該法是在等電點聚焦方法基礎上發(fā)展起來的，其分離純化蛋白質的依據是等電點的差異和離子交換行為。蛋白質按其等電點在pH梯度環(huán)境中進行排列的過程叫做聚焦效應。 pH梯度的形成(由多緩沖劑和多緩沖交換劑形成)是聚焦效應的先決條件，如果一種蛋白質加到已形成pH梯度的層析柱上時,由于洗脫液的連續(xù)流動，蛋白質將迅速地 遷移到與它等電點相同的pH處。從此位置開始，該蛋白質將以緩慢的速度進行吸附、解吸附，直到在等電點pH時被洗出。在聚焦層析過程中,一種樣品分次加入時，只要先加入者尚未洗出,并且有一定的時間進行聚焦,剩余樣品還可以加到柱上,其聚焦過程都能順利完成。6. 離子交換層析原理基質 疏水型離子交換劑；親水型離子交換劑應用 制備純化生物物質 定量、定性測定混合物中各組分1. 平衡階段:離子交換劑與反離子結合2. 吸附階段：樣品與反離子進行交換3、 4. 解吸附階段：用梯度緩沖溶液洗脫，先洗下弱吸附物質，后洗下強吸附物質5.再生階段：用原始平衡液進行充分洗滌，既可重復使用亞基與原體四級結構的蛋白質中每個球狀蛋白質稱為亞基。亞基一般只是一條多肽鏈，但有的亞基由二條或多條肽鏈組成，這些多肽鏈之間以SS相連。四級結構有時還指相同的或不同的球蛋白分子所構成的聚合體。對稱的寡聚蛋白質可視為兩個或多個不對稱的相同結構成分組成，這種相同結構成分稱為原體（protomer）。在同多聚體中原體是亞基，但在雜聚體中原體是兩種或多種不同的亞基組成。蛋白質變性后的變化由于外界因素的作用，使天然蛋白質分子的構象發(fā)生變化，導致生物活性喪失及物理化學性質的異常變化，這一過程稱為變性（denaturation）。變性涉及次級鍵的斷裂，但不涉及共價鍵(肽鍵和二硫鍵) 的斷裂,因而一級結構并未破壞。生物活性的喪失 側鏈基團的暴露 物理化學性質的改變: 溶解度.分子形狀. 粘度等. 化學性質的改變 變性后的蛋白質肽鏈松散，內部側鏈基團暴露，易于與有關顯色試劑接觸，使顏色反應增強。生物化學性質的改變:易被蛋白酶水解變性機理溫度：溫度升高，使分子內振動增強，破壞維系空間結構的次級鍵的作用（主要是氫鍵），使蛋白質變性。酸、堿：主要是由于解離基團質子得失后，生成過多正或負電荷，使肽鏈間靜電斥力增加的結果有機溶劑A. 由于有較低的介電常數，常使肽鏈內靜電斥力增加，造成蛋白質分子膨化或松散；B. 在極性較低的有機溶劑環(huán)境中，疏水基團易于從內部向外部轉移，使疏水作用力削弱，促進蛋白質的變性。重金屬鹽 在溶液中加入重金屬鹽類也會影響蛋白質構象的穩(wěn)定性。重金屬鹽有可能和蛋白質的極性基團直接作用，使穩(wěn)定性發(fā)生變化，也可能通過改變溶劑的結構間接影響蛋白質的結構。鑒定變性的方法測定蛋白質的比活性測定蛋白質物理化學性質的變化測定蛋白質生物化學性質的變化用免疫法測定蛋白質的抗原性是不是改變蛋白質的溶解度是不是下降。蛋白質組學研究內容蛋白質組學的主要研究內容：1）、蛋白質組表達模式（或蛋白質組組成）的研究，了解某種特定的細胞、組織或器官制造的蛋白質種類2）、蛋白質組功能模式（目前主要集中于蛋白質的相互作用網絡關系）的研究3）、描繪蛋白質的精確三維結構，揭示其結構上的關鍵部位，如與底物結合并且決定其活性的部位研究方法：蛋白質組學研究的策略和趨勢：策略包括窮盡法和差異法；研究趨勢包括：相互作用蛋白質組學、亞細胞蛋白質組學、定量蛋白質組學。分離技術：1）、雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳：第一向進行等電聚焦電泳，根據蛋白質的等電點不同對蛋白質進行初步分離。第二向是SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，按照分子量不同對蛋白質進行再次分離。2）、高效液相層析：其第一向根據分子大小分離蛋白質，第二向反向層析（固定相和流動相所有溶劑相反）。鑒定技術：1）、氨基酸組成分析2）、氨基酸序列分析3）、質譜分析4）、翻譯后修飾結構與功能的關系（一級結構：細胞色素鐮刀型細胞貧血癥;高級結構： 血紅蛋白Hb的結構與功能Hb由4條肽鏈組成：2、2，功能是運載O2 。由于血紅蛋白亞基之間存在大量離子鍵，使其構象呈緊張態(tài)，對氧的親和力很低，第一個亞基與O2結合時，離子鍵的破壞較難，所需要的能量較多。當血紅蛋白的一個亞基結合氧之后引起它的構象從緊張態(tài)（T）變成松弛態(tài)（R），其它的離子鍵也依次破壞，此時破壞離子鍵所需要的能量也少，構象的變化導致血紅蛋白對氧的親和力大大增強，因此第四個亞基結合氧的能力比第一個大幾百倍。Hb與O2結合后，Hb的構象發(fā)生變化，這類變化稱為變構效應，即通過構象變化影響蛋白質的功能。像血紅蛋白這種具有變構效應的蛋白質稱為變構蛋白（allosteric protein）。血紅蛋白的這種變構效應能更有效地行使其運氧的生物學功能。 在pH相對較低和CO2濃度較高時的外周組織中，隨著H和CO2與血紅蛋白的結合，其氧親和力降低，O2被釋放到組織中。相反地，在肺部CO2被排除且血液中pH升高，血紅蛋白的氧親和力增加pH和CO2濃度對血紅蛋白結合及釋放O2的影響稱波爾效應。血紅蛋白每條肽鏈的氨基端的-氨基與CO2以氨甲?；鶊F結合形成氨甲酰血紅蛋白，該反應產生的H參與波爾效應。結合的氨甲酰也能形成鹽橋，有助于T態(tài)的穩(wěn)定且促進釋放O2。O2、H+和CO2與血紅蛋白結合部位不同(變構效應): O2結合在血紅素的Fe原子上；H+結合在蛋白質某些氨基酸殘基上；CO2結合在4個亞基的N末端a-氨基, 形成氨甲酰。Hb四聚體分子只有一個BPG結合部位，位于四聚體中央孔穴內。BPG(甘油酸2,3-二磷酸）結合后，提供了更多的鹽鍵, 通過與兩個鏈形成交聯(lián)，穩(wěn)定T態(tài)構象，即使平衡由松弛型趨于緊張型，促進O2的釋放。在R態(tài)時O2的結合引起Hb構象變化，中央孔穴變小, BPG 被擠出。 總之，各種蛋白質都有特定的空間構象，而特定的空間構象又與它們特定的生物學功能相適應，蛋白質的結構與功能是高度統(tǒng)一的。RNA功能的多樣性：1）、控制蛋白質的合成 2）、作用于RNA轉錄后加工和修飾3）、基因表達與細胞功能的調節(jié)4）、生物催化與其他細胞持家功能5）、遺傳信息的加工與進化6）、染色體、核糖體、核酸等骨架構成成分7）、信號識別與轉導核酸堿基的理化性質：1）、弱堿性2）、紫外吸收特性：260nm3）、嘧啶與嘌呤具有疏水性4）、嘧啶與嘌呤環(huán)上的N、酮基和環(huán)外的氨基具有親水性衛(wèi)星DNA：主要分布在染色體著絲粒部位，由非常短的串聯(lián)多次重復DNA序列組成，因為它的低復雜性又稱簡單序列DNA，又因其不同尋常的核苷酸組成，常在浮力密度離心中從整個基因組DNA中分離成一個或多個“衛(wèi)星”條帶，故稱衛(wèi)星DNA。小衛(wèi)星DNA：一般位于端粒處，由高度重復序列組成的小基因簇。通常有兩種形式。微衛(wèi)星DNA：重復單位序列最短，具高度多態(tài)性，在遺傳上高度保守，可作為遺傳標記。DNA指紋：在人類中VNTRs位點是1.5kb，但人的總DNA提取后用限制線內切酶切成不同的片段，然后以ANTRs中的特異序列為探針進行southern雜交，可發(fā)現陽性片段的大小各不相同，由于不同個體的這種串聯(lián)重復的數目和位置各不相同，所以VNTRs的southern雜交帶譜就具有高度的個體特異性，稱其為DNA指紋，可作親子鑒定。穩(wěn)定雙螺旋結構的力：1）、堿基分子內能2）、氫鍵3）、離子鍵4）、堿基堆積力5）、疏水作用增色效應：DNA變性后，它在260nm的吸光值會上升30%以上，這一現象稱為增色效應。DNA具有高度彈性的原因：脫氧核糖和磷酸組成的骨架上的鍵可以自由的移動，隨著熱力學的變化，可使鍵彎曲、伸展或堿基分開，這就使具有同樣堿基配對的DNA雙螺旋可以采取另一些構象，DNA構象的這種差異稱為多態(tài)性。1）、脫氧核糖的五元環(huán)能折疊成各種構象2）、組成磷酸脫氧核糖骨架的連續(xù)的鍵可以轉動3）、C1-N核糖鍵可以自由移動DNA構型的生物學意義：1）、溝（特別是大溝）的特征在遺傳信息表達過程中起關鍵作用2）、溝的寬窄及深淺影響調控蛋白對DNA信息的識別，三種構型的DNA處于動態(tài)轉變之中。3）、DNA二級結構的變化與高級結構的變化是相互關聯(lián)的。這種變化在DNA復制與轉錄中具有重要的生物學意義?；匚慕Y構：又稱為反向重復序列，是一段能自我互補的序列，即同其互補鏈一樣的序列，能形成發(fā)卡結構或十字形結構。鏡像重復：在同一DNA鏈上無互補序列，不能形成發(fā)卡或十字形結構。測定細胞和組織切片中核酸位置的三種方法：1）、對RNA或DNA具有專一性染色的方法： 孚爾根染色法、熒光染料染色法、堿性染料染色法2）、紫外照相法：260nm下具有強烈的紫外吸收，細胞在此下照相，則含有核酸的結構很容易辨認出來。3）、經專一酶處理后染色稀有修飾組分的意義：DNA分子中的稀有組分常在基因信息的表達調控和保護中起作用。RNA特別是tRNA中也富含稀有成分，在RNA的功能中起作用：tRNA中的許多稀有組分與維持特定的三級結構、密碼識別與精確配對有關。與細胞增殖有關與穩(wěn)定核酸的高級結構及酶的識別有關與細胞癌變有關與基因表達調控有關。單體酶：由一條肽鏈組成，一般不需要輔助因子。寡聚酶：由兩個或兩個以上亞基組成的酶。大多是調節(jié)酶，多含偶數個亞基。同工酶：指催化化學反應相同，蛋白質分子結構、理化性質乃至免疫學性質不同的一組酶。酶的比活力：每毫克酶蛋白中所含有的酶活力單位?；厥章剩好看翁峒兒竺钢苿┑谋然盍?提取液總活力。純化倍數：每次提純后酶制劑比活力/提取液比活力。組成酶：是細胞從恒定速率和恒定數量生成的酶類，是細胞中天然存在的，其含量較穩(wěn)定，一般不受外界條件的影響。誘導酶：是細胞中進入特定的誘導底物后，被誘導生成的，其有無及含量的多少受外界條件的影響。酸堿催化：由質子轉移所致的催化作用為酸堿催化作用；由催化劑向反應物提供質子為酸催化，由催化劑從反應物中奪取質子為堿催化。共價催化：在酶催化反應過程中，酶與底物以共價鍵結合成中間物過濾態(tài)以加速反應。即在催化時，親核催化劑或親電催化劑能分別放出點子或汲取電子，并作用于底物的缺電子反應中心或負電中心，迅速形成不穩(wěn)定的共價鍵中間復合物，降低反應活化能，使反應加速。酶的親核標記：根據酶與底物能特異性結合的性質，設計合成一種含反應基因的底物類似物，作為活性部位的標定試劑，它能像底物一樣進入酶的活性部位，并以其活潑的化學基團與酶的活性基團的某些特定基因共價結合，使酶失去活性。Ks型不可逆抑制劑：這類抑制劑主要作用于酶活性部位的必須基團，但也作用于酶非活性部位，取決于抑制劑與酶活性部位必須基團在反應前形成非共價絡合物的解離常數以及與非活性部位同類基團形成非共價絡合物的解離常數之比，即Ks的比值，故稱為Ks型不可逆抑制劑。Kcat型不可逆抑制劑：這類抑制劑不但具有與天然底物相類似的結構，而且本身也是酶的底物，可被酶催化而發(fā)生類似底物的變化。但這類抑制劑還有一種潛伏性的反應基團，這種基團可因酶的催化而暴露或活化，作用于酶活性中心或輔基，使酶共價共價修飾而失活。酶分子修飾：通過各種方法使酶分子的結構發(fā)生某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的過程，稱為酶分子修飾?；瘜W修飾酶：在不引起酶蛋白變性的條件下，某些試劑能與氨基酸殘基的側鏈基團反應，引起共價結合、氧化、還原等修飾反應，使基團的結構和性質發(fā)生改變，稱為化學試劑修飾。具有這種性質的酶稱為化學修飾酶。變構酶與變構調節(jié)：變構酶又稱別構酶，指酶分子的非催化部位與某些化合物可逆地非共價結合后，引起酶的構象的改變，進而改變酶的活性狀態(tài)，酶的這種調節(jié)稱為變構調節(jié)，具有變構調節(jié)的酶稱為變構酶，凡能使酶分子發(fā)生別構作用的物質稱為別構劑，通常用小分子代謝物或輔因子。過濾態(tài)底物類似物：過濾態(tài)底物類似物可作為競爭抑制劑。是指底物和酶結合成中間復合物后被活化的過渡形式，由于能障小，和酶結合后緊密得多，這是酶具有高度催化效率的原因之一。簡述酶分離提純的一般過程及注意事項：因為酶也是蛋白質的一種，其分離提純過程同蛋白質的分離提純過程，一般分為：1）、前處理：包括破壞組織，將細胞的亞細胞顆粒碎片與溶液分開，并用適當的緩沖液將蛋白質提取出來。2）、粗分級分離：采用適當的方法，將需要的蛋白質與其他蛋白質分開。常用方法：鹽析法、有機溶劑法、等電沉淀法等。3）、細分級分離：進一步用層析法或電泳對所需蛋白質進行純化。注意事項：1）、選材：選擇酶含量豐富的新鮮生物材料。一種酶含量豐富的組織或器官往往與含量較低的組織或器官相差上千倍或上萬倍，目前常用微生物為材料制各種酶制劑。2）、破碎：動物組織較易破碎，一般通過研磨器、勻漿器、高速組織搗碎機即可達到目的，微生物及植物細胞壁較厚，需用超聲波、細菌磨、凍融、溶菌酶或用某些化學試劑加以破碎，制成組織勻漿。3）、抽提：在低溫下，以H2O或低鹽緩沖液，從組織勻漿中提取酶，得到酶的粗提液。4）、分離與純化：酶是生物活性物質，在分離純化時必須注意必須盡量降低酶活性損失，操作條件要溫和，全部操作一般在05間進行。何謂酶活力：指酶催化某化學反應的能力，其大小可以用在一定條件下所催化的某一化學反應的反應速率來表示，兩者呈線性關系。測定酶活力的原理：通過測定酶促反應的初速度來測定酶活力。酶促反應的初速度越大，酶的活力就越強，反之，反應速度越小，酶的活力越若。酶活性的測定方法：1）、測壓法：底物或產物之一是氣體或酸的，可以用測壓計來測定氣體體積的變化。2）、分光光度法：底物或產物在紫外光、可見光或紅外光區(qū)域具有光的吸收。3）、熒光法：4）、電化學法：PH測定法、電位測定、電流測定等5）、旋光測定法：若底物和產物的旋光性不同，可通過測定反應混合物的旋光性6）、同位素測定法：用放射性同位素標記底物，酶反應后分離產物。溫度影響酶活性的機理：1）、溫度影響反應體系中的活化分子數，：溫度增加，活化分子數增加，反應速度增加。化學反應中溫度每增加10度反應速度增加的倍數稱為溫度系數Q10 。酶促反應的Q10為12 。2）、溫度影響酶的活性：過高的溫度使酶變性失活，反應速率下降。PH影響酶活力機理： 1）、PH影響酶和底物的解離。 2）、PH影響酶分子的構象。 過酸或過堿環(huán)境可以使酶的空間結構破壞，引起酶構象的改變，酶活性喪失；當PH值變化不是太劇烈時，酶雖未變性，但活力受到影響；Ph影響維持酶分子空間結構的有關基團解離，從而影響了酶活性部位的構象，進而影響酶的活性。酶的活性部位、特點、研究其方法、原理：與底物接觸并且發(fā)生反應的部位就稱為酶的活性中心，也稱為酶的活性部位。通常包括結合中心和催化中心兩部分。特點：1）活性部位在酶分子的總體只占有相當小的部分，催化中心一般由23個殘基組成，結合部位的殘基數因酶而異。2）酶的活性部位是一個三維實體；可能是一級結構較遠而空間結構較近。3）活性中心構象不是固定不變的。4）活性部位位于酶分子表面的疏水性裂縫中，但也含有極性氨基酸，負責結合與催化。5）底物通過次級鍵結合到酶上。6）酶的活性部位具有柔性或可運動性。研究技術和原理：1）、X射線衍射法：X射線撞擊原子中電子后，產生衍射圖，分析結構，把純酶的射線晶體衍射圖譜與酶與底物反應后的X射線圖譜比較，即可確定酶的活性中心。2）、切除法：對于小分子且結構已知的酶多用此法。用專一性的酶切除一段肽鏈后剩余的肽鏈仍有活性，說明切除的肽鏈與活性無關。3）、酶分子上側鏈基團的化學修飾：在不引起酶蛋白變性的條件下，某些試劑能與氨基酸殘基的側鏈基團反應，引起共價結合、氧化、還原等修飾反應，使基團的結構和性質發(fā)生改變，稱為化學試劑修飾。包括非特異性共價修飾和特異性共價修飾。4）、差示標記法：利用競爭性抑制劑或底物預先占據活性中心，使非特異性試劑只修飾活性中心以外的基團，然后透析出去保護劑，再用同位素標記的非特異性試劑修飾活性中心的基團。經氨基酸分析可知哪些基團位于活性中心。5)、動力學分析法：改變PH，通過參數Vmax或Km與PH關系試驗，可以提供與反應有關解離基團的pK值，可知哪個氨基酸與酶活性有關。6）、親和標記：根據酶和底物的特異性結合的性質，設計合成一種含反應基團的底物類似物，作為活性部位的標記試劑，它能像底物一樣進入酶的活性部位，并以其活潑的化學基團與酶的活性基團的某些特定基團共價結合，使酶失去活性。7）、定位誘變法：直接修飾基因片段或個別密碼子，有目的的改變氨基酸殘基，與野生型酶對比，判斷被誘變殘基在結合底物、催化底物反應中的作用。使酶具有高效催化效率的因素（酶催化機理）及機制：1）、鄰近與定向效應：鄰近效應是指酶與底物形成中間復合物后，使底物與底物之間，酶催化基團與底物之間結合于同一分子，使有效濃度大大提高，使反應速率大大加快。定向效應是指反應物的反應基團之間和催化基團與反應基團之間的正確取位產生的效應。鄰近、定向效應影響反應速率的原因：1）、酶對底物起軌道向導作用，減少反應所需活化能；2）、酶使分子間反應分子內反應；3）、鄰近定向