原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交PPT演示課件

.,原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交,.,三個(gè)問題,1 . 什么是植物的原生質(zhì)體？2. 為什么要培養(yǎng)植物的原生質(zhì)體？3. 怎樣進(jìn)行植物的原生質(zhì)體培養(yǎng)？4. 什么是體細(xì)胞雜交？5. 為什么要進(jìn)行體細(xì)胞雜交？6. 怎樣進(jìn)行體細(xì)胞雜交？,.,什么是植物原生質(zhì)體？,植物原生質(zhì)體（protoplast）是去掉細(xì)胞壁的由質(zhì)膜包裹、具有生活力的細(xì)胞是植物細(xì)胞工程和許多理論研究的理想材料 仍保持植物細(xì)胞的全能性 仍能進(jìn)行植物細(xì)胞的各種生命活動(dòng)是植物遺傳轉(zhuǎn)化的理想受體 膜較薄，易從外界攝入DNA、染色體、細(xì)胞器、細(xì)胞核、甚至 病毒顆粒等,.,原生質(zhì)體,.,第一節(jié) 原生質(zhì)體的分離與純化,一、材料的選擇1. 幾乎植物體的每一部分都可分離得到原生質(zhì)體2. 葉片、愈傷組織、懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞都可制備原生質(zhì)體3. 葉片是最常用的材料4. 一般選用結(jié)構(gòu)疏松并處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞培養(yǎng)體系分離原生質(zhì)體效果較好5.一般選用生長(zhǎng)旺盛、生命力強(qiáng)的組織作為分離原生質(zhì) 體的材料,.,二、材料的預(yù)處理(1)暗處理 在分離原生質(zhì)體前,將在溫室內(nèi)生長(zhǎng)5-7周的豌豆枝條取下后,置于維持一定濕度的暗室中預(yù)培養(yǎng)1-2天。獲得的原生質(zhì)體存活率較高,并能繼續(xù)分裂。(2)預(yù)培養(yǎng) 把羽衣甘藍(lán)葉撕去下表皮，置于又到愈傷組織的培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)7天，然后再用酶液脫壁。 得到的原生質(zhì)體量雖低于未經(jīng)處理的對(duì)照組，但培養(yǎng)時(shí)分裂頻率提高，并很快形成能生根的愈傷組織,.,(3)預(yù)萎蔫 將葉片置于日光或燈光下2-8h使葉片稍萎蔫，則有利于撕除下表皮和酶解葉肉細(xì)胞壁分離原生質(zhì)體。(4)預(yù)質(zhì)壁分離 把材料先放到與酶溶液中糖濃度相同的糖溶液中預(yù)培養(yǎng)1h左右，是細(xì)胞質(zhì)壁分離，然后再放入酶液去壁。加快原生質(zhì)體的釋放，提高原生質(zhì)體的活力。,.,三、分離方法,（一） 機(jī)械分離法：先將細(xì)胞放在高滲糖溶液中預(yù)處理，待細(xì)胞發(fā)生輕微質(zhì)壁分離，原生質(zhì)體收縮成球形后，再用機(jī)械法磨碎組織，從傷口處可釋放出完整的原生質(zhì)體。缺點(diǎn)：獲得完整的原生質(zhì)體的數(shù)量比較少，能夠用此法產(chǎn)生原生質(zhì)體的植物種類受到限制。優(yōu)點(diǎn)：該方法可避免酶制劑對(duì)原生質(zhì)體的破壞作用。,.,（二）酶解分離法： 指將材料放入能降解細(xì)胞壁的混合等滲酶液中保溫一定時(shí)間，在酶液的作用下，細(xì)胞壁被降解，從而獲得大量有活力的原生質(zhì)體的方法。常用的酶種類：纖維素酶類（纖維素酶、半纖維素酶、崩潰酶Driselase）、果膠酶類（果膠酶和離析酶Macerozyme）、蝸牛酶和胼胝質(zhì)酶。,.,酶解分離法優(yōu)點(diǎn)：獲得量大，適用廣泛。缺點(diǎn)：商品酶制劑均含有核酸酶、蛋白酶、過氧化物酶以及酚類物質(zhì)會(huì)影響所獲原生質(zhì)體的活力,.,酶解分離法,.,酶液的配制,使用原則：以用最少的酶制劑種類、最少的量，但能分離得到完整、健康的原生質(zhì)體為準(zhǔn)使用前需要對(duì)酶進(jìn)行純化在酶液中必須加滲透穩(wěn)定劑以保護(hù)原生質(zhì)體的活力和質(zhì)膜的穩(wěn)定性，一般滲透穩(wěn)定劑濃度為0.35-0.8mol/L適宜PH：5.4-6.0范圍,.,常用的滲透穩(wěn)定劑,1、糖醇和可溶性糖：包括甘露醇（常用）、山梨醇、葡萄糖、蔗糖等2、無機(jī)鹽：CaCl2、MgSO4、KCl、KH2PO4或培養(yǎng)基中的無機(jī)鹽組成穩(wěn)定劑中附加鈣鹽（0.1%）可以增強(qiáng)質(zhì)膜穩(wěn)定性；葡聚糖硫酸鉀（0.5%-1%）能抑制酶液內(nèi)某些雜酶和RNA酶的活性，也有助于質(zhì)膜穩(wěn)定；加入少量AgNO3能減少酶解時(shí)產(chǎn)生的乙烯；加入過氧化氫歧化酶以減輕O2自由基對(duì)細(xì)胞膜的損傷，從而提高原生質(zhì)體的植板率,.,（3）分離原生質(zhì)體,兩步分離法（順序法）： 先用果膠酶使細(xì)胞分離，再用纖維素酶解離細(xì)胞壁獲得原生質(zhì)體一步分離法（直接法）： 把一定量的纖維素酶和果膠酶組成混合酶液，對(duì)材料進(jìn)行一次性處理，目前多用。,.,分離需注意：材料和酶液的體積比： 1:10溫度：25-30黑暗或弱光條件一般靜置進(jìn)行，每隔一段時(shí)間輕輕搖動(dòng)幾下，也可將培養(yǎng)皿一直放在50r/min的搖床上輕輕振蕩來分離原生質(zhì)體,.,（4）原生質(zhì)體的純化,.,離心沉淀法（沉降法） 步驟：將收集的含有原生質(zhì)體和酶液的濾液低速離心經(jīng)離心后，原生質(zhì)體沉降與管底，上部為含碎片的混合液。棄去含雜質(zhì)的上懸液，重新懸浮原生質(zhì)體，再次離心，如此重復(fù)3次用原生質(zhì)體培養(yǎng)基洗滌一次，收集管底純凈的原生質(zhì)體，用培養(yǎng)基調(diào)整到一定密度后進(jìn)行培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便缺點(diǎn)：在制備過程中易造成原生質(zhì)體的損傷，而且純度不夠好，常存在少量脫壁不完全的細(xì)胞和破碎的原生質(zhì)體,.,漂浮法濾液 原生質(zhì)體漂浮于溶液表面，雜 質(zhì)下沉到管底 反復(fù)離心和重新懸浮2-3次，最后用原生質(zhì)體培養(yǎng)基洗滌1次后調(diào)整到所需密度進(jìn)行培養(yǎng)。,低速離心,吸出原生質(zhì)體，轉(zhuǎn)入另一離心管中,.,界面法原理：高分子聚合物混合液產(chǎn)生兩相水溶液，通過離心可使原生質(zhì)體處于兩液相的界面之間優(yōu)點(diǎn)：可獲得數(shù)量較大的純凈原生質(zhì)體，同時(shí)避免了在收集過程中原生質(zhì)體因相互擠壓而破碎,.,.,（5）原生質(zhì)體活力的測(cè)定,形態(tài)識(shí)別形態(tài)上完整、含有飽滿的細(xì)胞質(zhì)、顏色鮮艷的正常球形在低滲的洗滌液或培養(yǎng)液中，分離時(shí)被高滲溶液縮小的原生質(zhì)體又恢復(fù)原態(tài)胞質(zhì)內(nèi)原生質(zhì)環(huán)流或小顆粒內(nèi)含物的布朗運(yùn)動(dòng)程度,.,染色法熒光顯微鏡識(shí)別(FDA法)：FDA (fluorescein diacetate) 本身不發(fā)熒光也不具有極性，能自由穿過細(xì)胞質(zhì)膜?；罴?xì)胞內(nèi)FDA可以被酯酶裂解，將能發(fā)熒光的極性部分釋放出來。熒光素則不能自由穿越質(zhì)膜，在完整的活細(xì)胞內(nèi)積累。,使用濃度：0.01%,.,酚藏花紅染色法（0.1%)：酚藏花紅能使無活力的原生質(zhì)體染成紅色，有活力的原生質(zhì)體不著色。 伊凡藍(lán)(Evans blue)染色法(0.025%)：有活力但受損傷的細(xì)胞和死細(xì)胞能夠攝取這種染料，活細(xì)胞不攝取。,.,影響原生質(zhì)體數(shù)量和活力的因素1）光:一般在黑暗靜止條件下進(jìn)行.2）溫度:酶解溫度25-30,兼顧原生質(zhì)穩(wěn)定性及酶活性.3）時(shí)間:幾小時(shí)到幾十小時(shí),太長(zhǎng)影響原生質(zhì)活力,一般小于24小時(shí),如煙草葉片保溫24小時(shí)葉肉細(xì)胞解離完畢.4）細(xì)胞壁降解酶的種類和組合:一般植物細(xì)胞使用(纖維素酶0.7-1%,果膠酶0.5-1%),花粉細(xì)胞和四分體小孢子,可使用蝸牛酶和胼胝質(zhì)酶。 5）滲透壓的穩(wěn)定劑種類:甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖等，如甘露醇一般為0.5-0.7M。 6）原生質(zhì)膜穩(wěn)定劑 (CaCl2：0.1mM,葡聚糖硫酸鉀 0.2-0.3%；葡聚糖硫酸鉀0.2%-0.3%)7）pH影響 5.4-6.0,.,第二節(jié) 原生質(zhì)體培養(yǎng),一、原生質(zhì)體培養(yǎng) 獲得有活力的原生質(zhì)體后，應(yīng)用合適的方法，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下，可使原生質(zhì)體再生出新的細(xì)胞壁，接著細(xì)胞進(jìn)行持續(xù)分裂形成細(xì)胞團(tuán)，并培養(yǎng)形成愈傷組織或胚狀體，分化或發(fā)育成苗，最后形成完整的再生植株。二、原生質(zhì)體培養(yǎng)的意義建立單細(xì)胞無性系用于原生質(zhì)體融合遺傳轉(zhuǎn)化的良好受體多種基礎(chǔ)理論研究的實(shí)驗(yàn)材料,.,三、原生質(zhì)體培養(yǎng)方法,.,（一）液體淺層培養(yǎng),優(yōu)點(diǎn)：原生質(zhì)體在液體環(huán)境中有較強(qiáng)的吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力，表現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞分裂能力。操作簡(jiǎn)單，對(duì)原生質(zhì)體的損傷小，且易于添加新鮮培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物。 缺點(diǎn)：原生質(zhì)體分布不均勻，常常發(fā)生原生質(zhì)體之間的粘連現(xiàn)象而影響其進(jìn)一步的生長(zhǎng)和發(fā)育。此外，難以跟蹤觀察某一個(gè)細(xì)胞的發(fā)育情況。,.,（二）固體平板培養(yǎng) 優(yōu)點(diǎn)：使原生質(zhì)體處于固定位置，避免了原生質(zhì)體的漂浮游動(dòng)，有利于對(duì)單個(gè)原生質(zhì)體的細(xì)胞壁再生及細(xì)胞團(tuán)形成的全過程進(jìn)行定點(diǎn)觀察。 缺點(diǎn)： 培養(yǎng)基溫度對(duì)薄層質(zhì)量和原生質(zhì)體分布有一定影響；另外，固體中單細(xì)胞生活能力弱，通氣狀況不良，第一次細(xì)胞分裂時(shí)間會(huì)推遲2d左右。,.,（三）液體-固體雙層培養(yǎng)法 優(yōu)點(diǎn)：固體培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可以緩慢放到液體培養(yǎng)基中，如果在下層固體培養(yǎng)基中添加一定量的活性炭，則還可能吸附培養(yǎng)物產(chǎn)生的一些有害物質(zhì)，促進(jìn)原生質(zhì)體的分裂和細(xì)胞團(tuán)的形成。 缺點(diǎn)：不易觀察細(xì)胞的發(fā)育過程。,.,四、植株再生過程,植株(原生質(zhì)體)再生過程是指分離、純化的原生質(zhì)體在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)方法和良好的培養(yǎng)條件下，很快恢復(fù)細(xì)胞壁，再生細(xì)胞持續(xù)分裂形成細(xì)胞團(tuán)，最后或通過愈傷組織或通過胚狀體分化出完整植株的過程。細(xì)胞壁再生細(xì)胞分裂植株再生,.,1. 細(xì)胞壁再生再生所需時(shí)間與植物種類和起源細(xì)胞的分化程度及生理狀態(tài)有關(guān)。再生過程：先是質(zhì)膜合成細(xì)胞壁主要成分微纖維，然后在質(zhì)膜表面進(jìn)行聚合作用，形成多片層的結(jié)構(gòu)，以后在質(zhì)膜和片層結(jié)構(gòu)之間或在膜上產(chǎn)生小纖維絲，逐漸形成不定向的纖維團(tuán)，最后形成完整的細(xì)胞壁。細(xì)胞壁再生是細(xì)胞分裂的先決條件,.,2. 細(xì)胞分裂3. 植株再生 植株再生有兩種途徑： 通過愈傷組織誘導(dǎo)器官形成途徑 通過誘導(dǎo)胚狀體途徑,.,原生質(zhì)體的分離培養(yǎng)與植株再生(動(dòng)畫),.,第三節(jié) 植物體細(xì)胞雜交,體細(xì)胞雜交 兩種異源（種、屬間）原生質(zhì)體，在人工控制條件下，相互接觸從而發(fā)生膜融合，胞質(zhì)融合和核融合并形成雜種細(xì)胞的過程。體細(xì)胞雜交的意義實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣雜交，形成新的物種創(chuàng)造細(xì)胞質(zhì)雜種培育作物新種質(zhì)和新品種,.,.,一、原生質(zhì)體融合的類型,（1）自發(fā)融合 同種細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)2個(gè)靠在一起的細(xì)胞自發(fā)合并，稱自發(fā)融合；（2）誘發(fā)融合 指將植物原生質(zhì)體制備出來后，再加入誘導(dǎo)劑或用其他方法促使兩親本原生質(zhì)體融合的方法。,.,二、原生質(zhì)體融合的方法,（一）化學(xué)誘導(dǎo)融合 利用化學(xué)融合劑，促使原生質(zhì)體相互靠近、粘連融合的方法。1. 無機(jī)鹽誘導(dǎo)融合法2. 高pH-高Ca2+誘導(dǎo)融合法3. PEG誘導(dǎo)融合法4. PEG-高pH-高Ca2+誘導(dǎo)融合法（二）電誘導(dǎo)融