原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細胞雜交PPT演示課件

.,原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細胞雜交,.,三個問題,1 . 什么是植物的原生質(zhì)體？2. 為什么要培養(yǎng)植物的原生質(zhì)體？3. 怎樣進行植物的原生質(zhì)體培養(yǎng)？4. 什么是體細胞雜交？5. 為什么要進行體細胞雜交？6. 怎樣進行體細胞雜交？,.,什么是植物原生質(zhì)體？,植物原生質(zhì)體（protoplast）是去掉細胞壁的由質(zhì)膜包裹、具有生活力的細胞是植物細胞工程和許多理論研究的理想材料 仍保持植物細胞的全能性 仍能進行植物細胞的各種生命活動是植物遺傳轉(zhuǎn)化的理想受體 膜較薄，易從外界攝入DNA、染色體、細胞器、細胞核、甚至 病毒顆粒等,.,原生質(zhì)體,.,第一節(jié) 原生質(zhì)體的分離與純化,一、材料的選擇1. 幾乎植物體的每一部分都可分離得到原生質(zhì)體2. 葉片、愈傷組織、懸浮培養(yǎng)的細胞都可制備原生質(zhì)體3. 葉片是最常用的材料4. 一般選用結(jié)構(gòu)疏松并處于對數(shù)生長期的細胞培養(yǎng)體系分離原生質(zhì)體效果較好5.一般選用生長旺盛、生命力強的組織作為分離原生質(zhì) 體的材料,.,二、材料的預(yù)處理(1)暗處理 在分離原生質(zhì)體前,將在溫室內(nèi)生長5-7周的豌豆枝條取下后,置于維持一定濕度的暗室中預(yù)培養(yǎng)1-2天。獲得的原生質(zhì)體存活率較高,并能繼續(xù)分裂。(2)預(yù)培養(yǎng) 把羽衣甘藍葉撕去下表皮，置于又到愈傷組織的培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)7天，然后再用酶液脫壁。 得到的原生質(zhì)體量雖低于未經(jīng)處理的對照組，但培養(yǎng)時分裂頻率提高，并很快形成能生根的愈傷組織,.,(3)預(yù)萎蔫 將葉片置于日光或燈光下2-8h使葉片稍萎蔫，則有利于撕除下表皮和酶解葉肉細胞壁分離原生質(zhì)體。(4)預(yù)質(zhì)壁分離 把材料先放到與酶溶液中糖濃度相同的糖溶液中預(yù)培養(yǎng)1h左右，是細胞質(zhì)壁分離，然后再放入酶液去壁。加快原生質(zhì)體的釋放，提高原生質(zhì)體的活力。,.,三、分離方法,（一） 機械分離法：先將細胞放在高滲糖溶液中預(yù)處理，待細胞發(fā)生輕微質(zhì)壁分離，原生質(zhì)體收縮成球形后，再用機械法磨碎組織，從傷口處可釋放出完整的原生質(zhì)體。缺點：獲得完整的原生質(zhì)體的數(shù)量比較少，能夠用此法產(chǎn)生原生質(zhì)體的植物種類受到限制。優(yōu)點：該方法可避免酶制劑對原生質(zhì)體的破壞作用。,.,（二）酶解分離法： 指將材料放入能降解細胞壁的混合等滲酶液中保溫一定時間，在酶液的作用下，細胞壁被降解，從而獲得大量有活力的原生質(zhì)體的方法。常用的酶種類：纖維素酶類（纖維素酶、半纖維素酶、崩潰酶Driselase）、果膠酶類（果膠酶和離析酶Macerozyme）、蝸牛酶和胼胝質(zhì)酶。,.,酶解分離法優(yōu)點：獲得量大，適用廣泛。缺點：商品酶制劑均含有核酸酶、蛋白酶、過氧化物酶以及酚類物質(zhì)會影響所獲原生質(zhì)體的活力,.,酶解分離法,.,酶液的配制,使用原則：以用最少的酶制劑種類、最少的量，但能分離得到完整、健康的原生質(zhì)體為準使用前需要對酶進行純化在酶液中必須加滲透穩(wěn)定劑以保護原生質(zhì)體的活力和質(zhì)膜的穩(wěn)定性，一般滲透穩(wěn)定劑濃度為0.35-0.8mol/L適宜PH：5.4-6.0范圍,.,常用的滲透穩(wěn)定劑,1、糖醇和可溶性糖：包括甘露醇（常用）、山梨醇、葡萄糖、蔗糖等2、無機鹽：CaCl2、MgSO4、KCl、KH2PO4或培養(yǎng)基中的無機鹽組成穩(wěn)定劑中附加鈣鹽（0.1%）可以增強質(zhì)膜穩(wěn)定性；葡聚糖硫酸鉀（0.5%-1%）能抑制酶液內(nèi)某些雜酶和RNA酶的活性，也有助于質(zhì)膜穩(wěn)定；加入少量AgNO3能減少酶解時產(chǎn)生的乙烯；加入過氧化氫歧化酶以減輕O2自由基對細胞膜的損傷，從而提高原生質(zhì)體的植板率,.,（3）分離原生質(zhì)體,兩步分離法（順序法）： 先用果膠酶使細胞分離，再用纖維素酶解離細胞壁獲得原生質(zhì)體一步分離法（直接法）： 把一定量的纖維素酶和果膠酶組成混合酶液，對材料進行一次性處理，目前多用。,.,分離需注意：材料和酶液的體積比： 1:10溫度：25-30黑暗或弱光條件一般靜置進行，每隔一段時間輕輕搖動幾下，也可將培養(yǎng)皿一直放在50r/min的搖床上輕輕振蕩來分離原生質(zhì)體,.,（4）原生質(zhì)體的純化,.,離心沉淀法（沉降法） 步驟：將收集的含有原生質(zhì)體和酶液的濾液低速離心經(jīng)離心后，原生質(zhì)體沉降與管底，上部為含碎片的混合液。棄去含雜質(zhì)的上懸液，重新懸浮原生質(zhì)體，再次離心，如此重復(fù)3次用原生質(zhì)體培養(yǎng)基洗滌一次，收集管底純凈的原生質(zhì)體，用培養(yǎng)基調(diào)整到一定密度后進行培養(yǎng)優(yōu)點：操作簡便缺點：在制備過程中易造成原生質(zhì)體的損傷，而且純度不夠好，常存在少量脫壁不完全的細胞和破碎的原生質(zhì)體,.,漂浮法濾液 原生質(zhì)體漂浮于溶液表面，雜 質(zhì)下沉到管底 反復(fù)離心和重新懸浮2-3次，最后用原生質(zhì)體培養(yǎng)基洗滌1次后調(diào)整到所需密度進行培養(yǎng)。,低速離心,吸出原生質(zhì)體，轉(zhuǎn)入另一離心管中,.,界面法原理：高分子聚合物混合液產(chǎn)生兩相水溶液，通過離心可使原生質(zhì)體處于兩液相的界面之間優(yōu)點：可獲得數(shù)量較大的純凈原生質(zhì)體，同時避免了在收集過程中原生質(zhì)體因相互擠壓而破碎,.,.,（5）原生質(zhì)體活力的測定,形態(tài)識別形態(tài)上完整、含有飽滿的細胞質(zhì)、顏色鮮艷的正常球形在低滲的洗滌液或培養(yǎng)液中，分離時被高滲溶液縮小的原生質(zhì)體又恢復(fù)原態(tài)胞質(zhì)內(nèi)原生質(zhì)環(huán)流或小顆粒內(nèi)含物的布朗運動程度,.,染色法熒光顯微鏡識別(FDA法)：FDA (fluorescein diacetate) 本身不發(fā)熒光也不具有極性，能自由穿過細胞質(zhì)膜?；罴毎麅?nèi)FDA可以被酯酶裂解，將能發(fā)熒光的極性部分釋放出來。熒光素則不能自由穿越質(zhì)膜，在完整的活細胞內(nèi)積累。,使用濃度：0.01%,.,酚藏花紅染色法（0.1%)：酚藏花紅能使無活力的原生質(zhì)體染成紅色，有活力的原生質(zhì)體不著色。 伊凡藍(Evans blue)染色法(0.025%)：有活力但受損傷的細胞和死細胞能夠攝取這種染料，活細胞不攝取。,.,影響原生質(zhì)體數(shù)量和活力的因素1）光:一般在黑暗靜止條件下進行.2）溫度:酶解溫度25-30,兼顧原生質(zhì)穩(wěn)定性及酶活性.3）時間:幾小時到幾十小時,太長影響原生質(zhì)活力,一般小于24小時,如煙草葉片保溫24小時葉肉細胞解離完畢.4）細胞壁降解酶的種類和組合:一般植物細胞使用(纖維素酶0.7-1%,果膠酶0.5-1%),花粉細胞和四分體小孢子,可使用蝸牛酶和胼胝質(zhì)酶。 5）滲透壓的穩(wěn)定劑種類:甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖等，如甘露醇一般為0.5-0.7M。 6）原生質(zhì)膜穩(wěn)定劑 (CaCl2：0.1mM,葡聚糖硫酸鉀 0.2-0.3%；葡聚糖硫酸鉀0.2%-0.3%)7）pH影響 5.4-6.0,.,第二節(jié) 原生質(zhì)體培養(yǎng),一、原生質(zhì)體培養(yǎng) 獲得有活力的原生質(zhì)體后，應(yīng)用合適的方法，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下，可使原生質(zhì)體再生出新的細胞壁，接著細胞進行持續(xù)分裂形成細胞團，并培養(yǎng)形成愈傷組織或胚狀體，分化或發(fā)育成苗，最后形成完整的再生植株。二、原生質(zhì)體培養(yǎng)的意義建立單細胞無性系用于原生質(zhì)體融合遺傳轉(zhuǎn)化的良好受體多種基礎(chǔ)理論研究的實驗材料,.,三、原生質(zhì)體培養(yǎng)方法,.,（一）液體淺層培養(yǎng),優(yōu)點：原生質(zhì)體在液體環(huán)境中有較強的吸收營養(yǎng)物質(zhì)的能力，表現(xiàn)出較強的細胞分裂能力。操作簡單，對原生質(zhì)體的損傷小，且易于添加新鮮培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物。 缺點：原生質(zhì)體分布不均勻，常常發(fā)生原生質(zhì)體之間的粘連現(xiàn)象而影響其進一步的生長和發(fā)育。此外，難以跟蹤觀察某一個細胞的發(fā)育情況。,.,（二）固體平板培養(yǎng) 優(yōu)點：使原生質(zhì)體處于固定位置，避免了原生質(zhì)體的漂浮游動，有利于對單個原生質(zhì)體的細胞壁再生及細胞團形成的全過程進行定點觀察。 缺點： 培養(yǎng)基溫度對薄層質(zhì)量和原生質(zhì)體分布有一定影響；另外，固體中單細胞生活能力弱，通氣狀況不良，第一次細胞分裂時間會推遲2d左右。,.,（三）液體-固體雙層培養(yǎng)法 優(yōu)點：固體培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)可以緩慢放到液體培養(yǎng)基中，如果在下層固體培養(yǎng)基中添加一定量的活性炭，則還可能吸附培養(yǎng)物產(chǎn)生的一些有害物質(zhì)，促進原生質(zhì)體的分裂和細胞團的形成。 缺點：不易觀察細胞的發(fā)育過程。,.,四、植株再生過程,植株(原生質(zhì)體)再生過程是指分離、純化的原生質(zhì)體在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)方法和良好的培養(yǎng)條件下，很快恢復(fù)細胞壁，再生細胞持續(xù)分裂形成細胞團，最后或通過愈傷組織或通過胚狀體分化出完整植株的過程。細胞壁再生細胞分裂植株再生,.,1. 細胞壁再生再生所需時間與植物種類和起源細胞的分化程度及生理狀態(tài)有關(guān)。再生過程：先是質(zhì)膜合成細胞壁主要成分微纖維，然后在質(zhì)膜表面進行聚合作用，形成多片層的結(jié)構(gòu)，以后在質(zhì)膜和片層結(jié)構(gòu)之間或在膜上產(chǎn)生小纖維絲，逐漸形成不定向的纖維團，最后形成完整的細胞壁。細胞壁再生是細胞分裂的先決條件,.,2. 細胞分裂3. 植株再生 植株再生有兩種途徑： 通過愈傷組織誘導(dǎo)器官形成途徑 通過誘導(dǎo)胚狀體途徑,.,原生質(zhì)體的分離培養(yǎng)與植株再生(動畫),.,第三節(jié) 植物體細胞雜交,體細胞雜交 兩種異源（種、屬間）原生質(zhì)體，在人工控制條件下，相互接觸從而發(fā)生膜融合，胞質(zhì)融合和核融合并形成雜種細胞的過程。體細胞雜交的意義實現(xiàn)遠緣雜交，形成新的物種創(chuàng)造細胞質(zhì)雜種培育作物新種質(zhì)和新品種,.,.,一、原生質(zhì)體融合的類型,（1）自發(fā)融合 同種細胞在培養(yǎng)時2個靠在一起的細胞自發(fā)合并，稱自發(fā)融合；（2）誘發(fā)融合 指將植物原生質(zhì)體制備出來后，再加入誘導(dǎo)劑或用其他方法促使兩親本原生質(zhì)體融合的方法。,.,二、原生質(zhì)體融合的方法,（一）化學(xué)誘導(dǎo)融合 利用化學(xué)融合劑，促使原生質(zhì)體相互靠近、粘連融合的方法。1. 無機鹽誘導(dǎo)融合法2. 高pH-高Ca2+誘導(dǎo)融合法3. PEG誘導(dǎo)融合法4. PEG-高pH-高Ca2+誘導(dǎo)融合法（二）電誘導(dǎo)融