流式細胞術原理及應用

1、流式細胞術原理及應用,一、什么是流式細胞術？ 流式細胞儀的構造 二、怎樣設計流式實驗？ 三、流式實驗中涉及到的關鍵步驟 四、常見流式細胞術應用,一、流式細胞術基本概念,流式細胞術（flow cytometry）是對于處在快速直線流動中的細胞和生物顆粒進行多參數、快速的定量分析和分選技術. 研究對象為生物顆粒，如各種細胞、微生物及人工合成微球等。 對生物顆粒的物理參數及生物學特性進行定性和定量分析。,流式細胞儀構造圖,流式細胞儀五大系統(tǒng),流動室與液流驅動系統(tǒng) 激光光源及光束成形系統(tǒng) 光學系統(tǒng) 信號檢測與分析系統(tǒng) 細胞分選系統(tǒng),流動室與液流驅動系統(tǒng),流動室，430180um,鞘液,1.空氣加壓進樣

2、 2.蠕動泵精確定量進樣,激光光源與光束成形系統(tǒng),1.氬離子氣體激光器，2266um 2.固體激光器,405nm, 488nm,561nm,635nm,光學系統(tǒng),透鏡、濾光片、小孔； lp：long-pass filter sp：short-pass filter bp：band-pass filter,信號檢測與分析系統(tǒng),物理參數 fsc：前向角散色光， 代表細胞大小 ssc：側向角散色光，代表細胞顆粒度,粒細胞,單核細胞,淋巴細胞,紅細胞、死細胞和碎片,實驗中，常利用fsc和ssc這兩種參數的組合，區(qū)分不同的細胞群體，去除碎片、死細胞和粘連細胞的干擾。,閾值：溶液中的雜質或者死細胞，很容易

3、產生微小的干擾信號，所以必須設置閾值，排除雜質、細胞碎片或體積較小的死細胞。 fsc反映細胞體積的大小，fcm應用時常選取fsc設定閾值。,5%,32%,默認閾值,升高閾值后,熒光信號 細胞自發(fā)熒光 特異熒光素標記激發(fā)的熒光信號 熒光信號的線性測量和對數測量-光電倍增管 1）檢測光子，轉換成電信號 2）將電信號等比例的放大 熒光信號的面積、寬度和高度,由于光信號比較弱，需將其等比例放大，方便計算機分析處理，一般信號的放大可以使用線性或對數兩種方式。 一般fsc和ssc變異范圍較小，故使用線性放大；熒光信號變異范圍較大，多使用對數放大。,線性測量：dna含量、rna含量、總蛋白含量 對數測量：細

4、胞膜表面抗原檢測,直方圖（distribution histogram） 橫坐標：道數 縱坐標：細胞數,散點圖（dot plot） 橫坐標：某細胞參數相對含量 縱坐標：該細胞另一參數含量,等高線圖（contour plot）,細胞分選系統(tǒng),macs 技術：magetic activated cell sorting 免疫學+細胞生物學+磁力學,電荷式分選 超聲振動器(15-100khz) 液流充電系統(tǒng) 高壓偏轉板 收集裝置(流式管、離心管、培養(yǎng)板、載波片等),二、熒光素,熒光的概念：,激發(fā)波長 excitation wavelength,發(fā)射波長(熒光波長) emission waveleng

5、th,激發(fā)光譜：特異性地激發(fā)某種熒光素的一定波長范圍內的光 發(fā)射光譜：某一波長激發(fā)光引起熒光素發(fā)射的熒光,熒光素（fitc/pe/percp/apc等) 抗體偶聯(lián)熒光素； 分子探針結合熒光素annexin v-fitc； 熒光染料/熒光化合物 pi、7-aad等插入核酸鏈中； cfse和蛋白質共價結合； 熒光蛋白-如gfp、rfp、yfp、cfp、mcherry、dsred等，自身發(fā)熒光。,常用熒光素,常用熒光染料,pi（碘化丙啶 535, 623） 可選擇性的插入核酸雙螺旋堿基對中。常用于dna分析，需要用rnase處理細胞排除rna對dna熒光定量的影響；pi不能透過活細胞膜，常用于鑒定死

6、細胞。 7-aad（7-氨基放線菌素d 545, 647 ） 以插入的方式與dna鏈的g-c堿基對結合，不能透過活細胞膜，常用于鑒定死細胞。 dapi（4,4,6-二脒基二苯基吲哚 358, 456） 可以非嵌入方式與dna鏈上的a-t堿基對特異性結合。變異系數明顯小于其他染料，一種理想的dna定量染料。 hoechst（343, 450）常見為hoechst33342和hoechst33258，非嵌入的方式與dna鏈上的a-t堿基對結合。能對活細胞染色，用于活細胞dna定量分析，如精子分選；還用于側群細胞的分選。 py（派若寧 560, 573） rna染料，能進入活細胞。 ao（吖啶橙 5

7、09, 525） dna、rna染料，染色后dna呈黃綠色熒光，rna呈橙黃色熒光，可進行dna/rna雙參數分析。,三、如何設計流式實驗,確定實驗要檢測的marker 選擇合適的熒光素標記的抗體 選擇合適的同型對照抗體,細胞處理（全血，培養(yǎng)的細胞） 染色（室溫，20min） 離心洗滌（全血裂紅） 上機檢測,準備工作：,實驗步驟：,a、根據機器配置選擇熒光素 多色標記熒光素搭配原則：每個通道只能選擇一種熒光素；各個通道之間的熒光素可以隨意搭配。 facscalibur常用四色搭配：fitc、pe、percp、apc。,1)熒光素的選擇：,b、根據抗原表達強弱合理分配熒光素,熒光素的強度： 染色

8、指數 stain index,stain index = d/w,cd4,高表達的抗原可用不太“亮”的染料，更“亮”的熒光素分配給表達低的抗原： cd4-fitc、cd25-apc、foxp3-pe,fsc,ssc,cd4 fitc,ssc,cd25 apc,foxp3 pe,盡量選擇光譜重疊小的熒光素，如fitc/pe-cy7； 選擇不同激光激發(fā)的熒光素，如fitc/apc，pe/apc；,c、選擇光譜重疊小的染料,d、盡量避免偶聯(lián)染料使用帶來的假陽性,0 hour,2 hours,22.5 hours,pe,cd3 pe-cy5,cd8 pe-cy7,樣本曝光時間,3）流式試驗對照設置,a

9、、空白對照 negative control 細胞內物質自身也發(fā)出熒光，能被fcm靈敏的檢測到，這種未染色的細胞自身發(fā)出的一些熒光稱為自發(fā)熒光。 設置空白對照（未染色的細胞），用以區(qū)分細胞的自發(fā)熒光和特異性熒光，避免假陽性的結果。,流式結果中熒光強弱是一個相對值，光電倍增管電壓越大，電子信號越強；電壓越小，信號越弱。 通過調節(jié)電壓，使陰性對照管的熒光強度處于陰性的位置，實驗組的熒光值都是相對對照組。,001,001,002,同型對照抗體：與實驗染色的單克隆抗體特異性無關的免疫球蛋白亞型 （fc段相同，f（ab）2段不同） 與染色的單克隆抗體： 相同種屬來源 相同免疫球蛋白及亞型 相同熒光素標記

10、 相同劑量和濃度 但由未免疫動物血清純化而來 用此消除由于抗體非特異性結合到細胞表面fc受體而產生的背景染色,b、同型對照 isotype control,c、陽性對照 positive control,設置陽性對照是為了檢測熒光抗體是否有效，并不是每次分析時都必須設置： 使用新的熒光素抗體時； 使用存儲時間較長的熒光素抗體時。 設置陽性對照的方法： 用肯定表達有該抗原的細胞來檢測； 已經證明有效的、偶聯(lián)其他熒光素的該抗原的抗體。,什么是熒光補償？糾正熒光素發(fā)射光譜重疊 為什么要進行補償調節(jié)？,520,400,500,600,700,575,665,fitc,pe,pc5,laser,d、 單

11、標對照 single staining control,補償調節(jié)方法：,fl2 - %fl1,fl-1(fitc),fl-2(-),fl-1(-),fl-2(pe),fl1 - %fl2,before compensation,after compensation,fitc 單標,pe 單標,什么樣的補償最合適？,單染管的陰性群體和陽性群體在所需調節(jié)通道的熒光median值相等時為最合適的補償。,uncompensated,compensated,fl1-fitc stain,fl2-no stain,fl1-fitc stain,pe-medianneg pe-medianpos,pe-me

12、dianneg= pe-medianpos,pe-medianneg pe-medianpos,fl1-fitc stain,overcompensated,準確補償的重要性,補償調節(jié)要合適,未補償,正確補償,fitc-pe補償太大,pe-fitc補償太大,使用單種熒光素標記的單克隆抗體和其余熒光素對應的同型對照抗體分別染色 n色分析就要制備n 個補償對照管,舉例：雙染實驗,設門與數據分析,門(gate，簡寫g)是流式細胞術中的一個重要術語，fcm數據分析過程實際上就是選門和設門的過程。,流式結果,十字門,線性門,細胞功能 細胞表面、胞漿、核的特異性抗原 細胞活性 細胞內細胞因子 酶活性 細胞

13、受體 細胞內鈣離子,流式細胞儀檢測范圍,hiv免疫分型，cd4絕對計數 白血病和淋巴瘤的免疫分型 腫瘤的細胞周期和倍體分析 網織紅細胞計數 細胞移植的交叉配型和免疫狀態(tài)監(jiān)測 干細胞計數 殘量白血病細胞檢查 hla-b27檢查 血小板功能及相關疾病,醫(yī)學應用,科研應用,在免疫學研究中的應用: 鑒定免疫細胞類型 抗原特異性t細胞研究 細胞因子分泌細胞研究 全血細胞研究 凋亡檢測 細胞增殖檢測 干細胞向免疫細胞分化的研究 轉染熒光蛋白細胞系研究 稀有細胞檢測 。,在神經生物學研究中的應用： 神經干細胞和神經祖細胞的特性研究； 不同類型的神經細胞的鑒定和功能研究； 星形膠質細胞和膠質細胞的鑒定和功能研

14、究； 檢測細胞活性，細胞凋亡和細胞周期； 神經細胞發(fā)育過程研究 干細胞向神經細胞分化研究 。,在腫瘤研究中的應用： 細胞凋亡的檢測； 細胞周期分析； 細胞增殖研究； 熒光蛋白分析； 腫瘤干細胞的鑒定和功能分析； 循環(huán)腫瘤細胞的鑒定和功能分析； 實體瘤細胞的檢測分析（腫瘤組織解離成單細胞后）； 腫瘤細胞系表型分析； 細胞活性的檢測； 。,在細胞生物學和分子生物學研究中的應用： 檢測細胞轉染效率； 檢測轉導效率； 分析細胞中熒光蛋白的表達； 分析蛋白蛋白之間的相互作用（fret） 分析細胞活性，細胞凋亡，和細胞周期； 研究細胞的分化過程； 研究細胞增殖； 。,在高通量檢測和新藥研發(fā)中的應用： 細胞

15、功能變化的研究； 細胞周期和活性； 細胞凋亡； 細胞增殖； 新藥研發(fā)； 培養(yǎng)基研發(fā)； 。,海洋生物學 富集和分析細菌，藻類，浮游植物等 微生物學 細菌和酵母檢測； 熒光蛋白檢測。 生物燃料 bodipy和/或 nile red中脂類的定量 藻類，藍藻細菌，酵母和細菌等生物的富集,4.1 細胞周期檢測,處于不同細胞周期的細胞dna含量不同，g0/g1期細胞含有二倍體量的dna，g2/m期細胞含有四倍體量的dna，而s期細胞dna含量處于二倍體和四倍體量之間。 dna熒光染料能與dna結合，dna含量的多少與熒光染料的結合量成正比，熒光強度反應了dna吸收熒光分子的多少。通過流式檢測就能反映細胞內

16、dna的含量，區(qū)分細胞周期的g0/g1期、s期和g2/m期細胞比例。,四、常見流式細胞術應用,細胞周期分析核酸染料 細胞膜非通透性染料：pi(碘化丙啶)、eb(溴化乙啶)，不能進入完整細胞膜，標記時需要通過固定等方法增加細胞膜的通透性。 細胞膜通透性染料：hoechst、dpai等能染活細胞的dna，但需紫外激光激發(fā)。 pi標記法檢測細胞周期 需要乙醇固定增加細胞膜的通透性； 需要加rnase，去除rna對dna的干擾。,pi法檢測細胞周期一般步驟： 收集單細胞懸液(1 106個)，緩慢加入1 ml預冷的70乙醇，于4固定過夜，或-20長期固定。 離心收集細胞，再以1ml pbs徹底洗去乙醇；

17、 去上清后加入染色液(包含50ug/ml pi，100ug/ml rnase a，0.2% triton x-100)，37 染色30min后上機檢測。,細胞周期檢測結果,通過流式檢測，能得出g0/g1期、s期和g2/m期細胞比例。 增殖指數(proliferous index, pi)：指處于s期和g2/m期細胞之和占總細胞的比例，反映了細胞的增殖能力。 cv值(變異系數)：衡量儀器測量分辨率和精度的指標。,脾臟細胞,培養(yǎng)腫瘤細胞,dna倍體檢測,病變腫瘤細胞常出現結構和染色體異常，流式檢測dna含量能反映異倍體情況。 dna指數(dna index, di)：(樣本的g0/g1期峰平均熒光

18、道數)/(正常二倍體細胞g0/g1期峰平均熒光道數)。 倍體(ploidy)：染色體數目。二倍體 di=1；四倍體 di=2；二倍體四倍體之外統(tǒng)稱異倍體。,二倍體,四倍體,異倍體,小鼠精子單倍體細胞,亞二倍體(sub-g1)峰的檢測,凋亡細胞核小體崩解，dna含量減少，加之由于dna的降解，與熒光染料的結合減少，因此dna染料的著色能力下降，熒光強度降低，表現在g1峰前出現亞二倍體峰，即亞g1峰(凋亡峰)。,細胞凋亡峰 sub-g1,四倍體峰,二倍體峰,pi,number,4.2 annexin v/pi雙染法檢測細胞凋亡,正常細胞膜是不對稱性的，胞漿面含有帶負電的磷脂(如磷脂酰絲氨酸, ps)。早期凋亡時，細胞表面不對稱性發(fā)生改變，ps外翻到胞外側 annexin v是一種ca2+依賴性的對ps有高度親和力的磷脂結合蛋白，可作為探針識別膜表面是否有ps，從而識別凋亡細胞。,pi常用于鑒別死細胞。凋亡細胞的細胞膜仍然是完整的，所以pi不能進入早期凋亡細胞核內。,annexin v-fitc,pi,活