蛋白免疫印跡法Western blot 原理及步驟.ppt

1、蛋白免疫印跡法,Western blot,Western Blot的原理,Western Blot ：首先利用SDS-PAGE對(duì)蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行分離，然后轉(zhuǎn)移到固相載體（例如NC膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。轉(zhuǎn)移后的NC膜就稱為一個(gè)印跡（blot）,用于對(duì)蛋白質(zhì)的進(jìn)一步檢測(cè)。印跡首先用蛋白溶液（如5%的BSA或脫脂奶粉溶液）處理以封閉NC膜上剩余的疏水結(jié)合位點(diǎn)，而后用所要研究的蛋白質(zhì)的抗體（一抗）處理，印跡中只有待研究的蛋白質(zhì)與一抗特異結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，而其它的蛋白質(zhì)不能與一抗結(jié)合，這樣清洗除去未結(jié)合的一抗后，印跡中只有待研究的蛋白

2、質(zhì)的位置上結(jié)合著一抗。處理過(guò)的印跡進(jìn)一步用適當(dāng)標(biāo)記的二抗處理，二抗是指一抗的抗體。處理后，帶有標(biāo)記的二抗與一抗結(jié)合形成抗體復(fù)合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白質(zhì)的位置。印跡用酶連二抗處理后，再用適當(dāng)?shù)牡孜锶芤禾幚?，?dāng)酶催化底物生成有顏色的產(chǎn)物時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生可見(jiàn)的區(qū)帶，指示所要研究的蛋白質(zhì)位置。該技術(shù)主要應(yīng)用于檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)。,SDS-PAGE原理,SDS-PAGE ：是在蛋白質(zhì)樣品中加入SDS和含有巰基乙醇的樣品處理液，SDS是一種很強(qiáng)的陰離子表面活性劑，它可以斷開(kāi)分子內(nèi)和分子間的氫鍵，破壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。 強(qiáng)還原劑巰基乙醇等可以斷開(kāi)二硫鍵破壞蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)。使蛋白質(zhì)分子

3、被解聚成肽鏈形成單鏈分子。解聚后的側(cè)鏈與SDS充分結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物 蛋白質(zhì)分子結(jié)合SDS陰離子后，所帶負(fù)電荷的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了它原有的凈電荷，從而消除了不同種蛋白質(zhì)之間所帶凈電荷的差異。蛋白質(zhì)的電泳遷移率主要決定于亞基的相對(duì)分子質(zhì)量，而與其所帶電荷的性質(zhì)無(wú)關(guān)。,Western blot 內(nèi)容,蛋白樣品的制備 SDS-PAGE 轉(zhuǎn)膜 封閉 一抗雜交 二抗雜交 底物顯色,步驟,蛋白樣品的制備 1，在冰上收細(xì)胞，用PBS清洗兩次，洗去培養(yǎng)基。1500r,5min離心，棄去上清液。 2，裂解細(xì)胞（裂解液:PI:PMSF=100:1:1）,根據(jù)所需蛋白濃度加細(xì)胞裂解液?；靹?。于冰上裂解

4、20min。 3，14000r,10min離心。上清液即為所需蛋白樣品液。 4，用Bradford蛋白分析法測(cè)蛋白濃度。 5，按100ul裂解液加30ul的6X的loading buffer 的比例，向蛋白樣品液中添加loading buffer 。 6，于95 ，5min條件下對(duì)蛋白樣品進(jìn)行高溫變性。,SDS-PAGE: 1，灌膠： （1）保證玻璃板干燥潔凈，玻璃板對(duì)齊后放入夾中卡緊，垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠。 （2）配好分離膠，加入TEMED，混勻后即可灌膠。灌膠過(guò)程中膠要沿著玻璃板流下，防止有氣泡產(chǎn)生。將膠灌至接近綠帶中線即可。 （3）用去離子水進(jìn)行液封，膠凝速度會(huì)更快（加水時(shí)速度要慢，防

5、止膠被沖變形） （4）待水與膠之間有一條折射線的時(shí)，說(shuō)明膠已經(jīng)凝固。此時(shí)，可完全除去膠上層的水。 （5）配制濃縮膠，加入TEMED,混勻后將剩余空間灌滿濃縮膠。然后插入梳子。待濃縮膠凝固后小心拔出梳子。 （6）用水沖洗一下膠板，裝入電泳槽中（小玻板面向內(nèi)，大玻板向外；若只跑一塊板，槽的另一邊要放一塊塑料板，有字的一面向外）,2，電泳 向電解槽中加入適量的Running Buffer,將蛋白樣品以50ug的標(biāo)準(zhǔn)換算出的體積進(jìn)行上樣。以電壓120V或160V進(jìn)行電泳，電泳至前沿跑至最底端即可進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。 轉(zhuǎn)膜 用硝酸纖維素膜（NC膜），進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。組裝轉(zhuǎn)膜“三明治”的過(guò)程在Transfer buffe

6、r中進(jìn)行：黑的一面在下，依次放上濾紙、凝膠、NC膜、濾紙，然后合上三明治。整個(gè)過(guò)程必須保證無(wú)氣泡。接著把轉(zhuǎn)膜“三明治”放入轉(zhuǎn)膜槽中，注意正負(fù)極放置正確。倒入適量的Transfer buffer。在冰浴中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜條件：120V,1.5h或者150V，1h 封閉 轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取出NC膜，按照所需蛋白的位置，裁剪NC膜。使其浸潤(rùn)于封閉液中，緩慢搖蕩1h,一抗雜交 封閉過(guò)后，把NC膜放入塑料袋中，按膜的大小加入適量的一抗溶液（一抗：封閉液=1:1000），密封，在搖床上緩慢搖蕩孵育4h。 二抗雜交 一抗孵育完成后，取出NC膜，交替加入TBST和TBS進(jìn)行洗膜，一共洗三次，每次710min。然后，再將NC膜放入塑料袋中，加入酶標(biāo)二抗（一抗的抗體，含辣根過(guò)氧化物酶HRP）（二抗：封閉液=1:1000），密封，在搖床上緩慢搖蕩孵育45min1h。最后再次洗膜（同上） 底物顯色 取上述處理過(guò)的NC膜，于干燥潔凈的的玻璃板上，適當(dāng)晾干。按照體積比1:1取魯米諾和過(guò)