蛋白質(zhì)組學及技術(shù)介紹.ppt

1、,蛋白質(zhì)組學,概念 蛋白質(zhì)組是在一個細胞的整個生命過程中由基因組表達的以及表達后修飾的全部蛋白質(zhì)。 蛋白質(zhì)組學是蛋白質(zhì)組概念的延伸。是蛋白質(zhì)的規(guī)?；芯?，從蛋白質(zhì)水平和生命本質(zhì)層次上研究和發(fā)現(xiàn)生命活動的規(guī)律和重要生理、病理現(xiàn)象的本質(zhì)，揭示基因活動的動態(tài)表達。 蛋白質(zhì)水平的分析不僅為生物分子體系提供最有效的實時分析模型而且也獲得了DNA和RNA水平上不易獲得的信息。,研究內(nèi)容,蛋白質(zhì)的研究內(nèi)容主要有兩方面： 1、結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學：主要是蛋白質(zhì)表達模型的研究，包括蛋白質(zhì)氨基酸序列 分析及空間結(jié)構(gòu)的解析種類分析及數(shù)量確定; 2、功能蛋白質(zhì)組學：主要是蛋白質(zhì)功能模式的研究，包括蛋白質(zhì)功能及蛋白質(zhì)間的相互

2、作用。,研究內(nèi)容,蛋白質(zhì)組學可分為三個主要領(lǐng)域： 1、蛋白質(zhì)的微特性以供蛋白質(zhì)的規(guī)?；b定和他們的后翻譯飾； 2、“差異顯示”蛋白質(zhì)組學供蛋白質(zhì)水平與疾病在廣泛范圍的有力應(yīng)用比較； 3、應(yīng)用特定的分析技術(shù)如質(zhì)譜法（包括串聯(lián)質(zhì)譜法、生物質(zhì)譜法）或酵母 雙雜交系統(tǒng)以及其他蛋白質(zhì)組學研究新技術(shù)研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。,研究技術(shù),3,蛋白質(zhì)分離策略： 1、多維色譜法，包括大小排阻色譜法、離子交換色譜法、反相高效色譜法、疏水性相互作用色譜法等； 2、多維電泳技術(shù)，包括二維凝膠電泳法、自由流動電泳法、毛細管區(qū)帶電泳法等； 3、親合法，包括免疫印跡法、親和捕獲； 4、細胞器，膜的復合體分離。,二維凝膠電

3、泳法： 二維凝膠電泳的原理是第一向基于蛋白質(zhì)的等電點不同用等電聚焦分離，第二向則按分子量的不同用SDS-PAGE分離，把復雜蛋白混合物中的蛋白質(zhì)在二維平面上分開。 2-DE有較好的分辨率，SDS-PAGE或單相IEF的最好分辨率僅為100個蛋白，而2-DE大約為3000個蛋白。,蛋白質(zhì)肽段的鑒定: 1、氨基和羧基末端分析，如：Edman 2、質(zhì)譜法，包括肽片段的質(zhì)譜和串聯(lián)質(zhì)譜法、,質(zhì)譜法： 質(zhì)譜（mass spectrum）是化合物分子在真空條件下受電子流的轟擊或強電場等其他方法的作用，電離成離子，同時發(fā)生某些化學鍵有規(guī)律的斷裂，生成具有不同質(zhì)量的帶電荷的離子，這些離子按質(zhì)荷比m/z（離子的質(zhì)

4、量m與其所帶電荷z的比值）的大小被收集并記錄程譜的方法。 生物質(zhì)譜技術(shù)是蛋白質(zhì)組學研究中最重要的鑒定技術(shù)，其基本原理是樣品分子離子化后，根據(jù)不同離子之間的荷質(zhì)比（M/E）的差異來分離并確定分子量。對于經(jīng)過雙向電泳分離的目標蛋白質(zhì)用胰蛋白酶酶解（水解Lys或Arg的-C端形成的肽鍵）成肽段，對這些肽段用質(zhì)譜進行鑒定與分析。目前常用的質(zhì)譜包括兩種：基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）和電噴霧質(zhì)譜（ESI- MS）。,蛋白質(zhì)相互作用 1、免疫共沉淀技術(shù)： 該技術(shù)以抗體和抗原之間的特異性結(jié)合為基礎(chǔ)，不僅能夠確定生理條件下細胞或組織內(nèi)2種目標蛋白質(zhì)是否存在相互作用，還可以探究與

5、己知相互作用的蛋白。 它的基本原理是在非變性條件下裂解細胞，保留細胞內(nèi)相互作用的蛋白質(zhì)，將目的蛋白的抗體加入細胞裂解液中，使目的蛋白在體內(nèi)的相互作用蛋白成電下來。經(jīng)過洗脫，收集沉淀物并進行分離，最后對分離所獲得蛋白進行鑒定。 該方法所研究的蛋白均是在體內(nèi)經(jīng)過翻譯后修飾的，并且是可分離的天然狀態(tài)的相互作用蛋白復合物，能夠反映正常生理條件下的蛋白質(zhì)間相互作用,蛋白質(zhì)相互作用 2、酵母雙雜交系統(tǒng)： 該系統(tǒng)利用真核細胞調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過程中，DN A結(jié)合結(jié)構(gòu)域(binding domain,BD)識別DNA上的特異序列并使轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activation domain, AD)啟動所調(diào)節(jié)的基因的轉(zhuǎn)錄這

6、一原理，將己知蛋白X和待研究蛋白Y的基因分別與編碼AD和BD的序列結(jié)合，通過載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入同一酵母細胞中表達，生成兩個融合蛋白。若蛋白X和Y可以相互作用，則AD和BD在空間上接近就能形成完整的有活性的轉(zhuǎn)錄因子，進而啟動轉(zhuǎn)錄，表達相應(yīng)的報告基因;反之，如果X和Y之間不存在相互作用，報告基因就不會表達。這樣，通過報告基因的表達與否，便可確定是否發(fā)生了蛋白質(zhì)的相互作用。,蛋白質(zhì)相互作用 3、蛋白質(zhì)芯片技術(shù) 蛋白質(zhì)芯片是一種新型的生物芯片，能夠進行高通量的蛋白功能分析。該技術(shù)實現(xiàn)的基礎(chǔ)是蛋白探針在固相支持物(載體)表而的大規(guī)模集成，利用樣品中標記或未經(jīng)標記的靶蛋白分子與探針進行反 應(yīng)，然后通過熒光法、放

7、射性同位素法或無標記檢測法等相應(yīng)的方法進行檢測，最后由計算機分析結(jié)果，獲得高豐度表達蛋白。,蛋白質(zhì)組學的應(yīng)用,疾病研究 植物學 藥物研究 食品科學 遺傳病學 微生物學,在疾病及藥物研究中的應(yīng)用,1.發(fā)現(xiàn)新的疾病標志物，鑒定疾病相關(guān)蛋白質(zhì)作為早期臨床診斷標志。 例如：Lei等通過2-DE和基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜等蛋白質(zhì)組學相關(guān)技術(shù)對膀胱癌患者的尿蛋白進行分離鑒定，獲得14個差異表達的蛋白質(zhì)，這些差異表達的蛋白可能是診斷和檢測膀胱癌的潛在尿標志物。,在疾病及藥物研究中的應(yīng)用,2.探索疾病的發(fā)病機制和治療途徑。 例：Polprasert等應(yīng)用蛋白質(zhì)組學方法對遺傳性球形紅細胞增多癥的紅細胞膜

8、蛋白變化進行研究，分離鑒定出56個差異表達的蛋白質(zhì)，通過蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)分析出包括細胞死亡、細胞循環(huán)及遺傳性和血液性紊亂3個HS相關(guān)的重要網(wǎng)絡(luò)，為進一步研究和了解HS相關(guān)的發(fā)病機制提供了參考。,在疾病及藥物研究中的應(yīng)用,3.研究膜蛋白及膜相關(guān)蛋白 Liu等利用比較膜蛋白組學方法對H5N1病毒分別感染6,12,14h的人肺腺癌細胞A549進行蛋白分析鑒定，得到24個差異表達的蛋白質(zhì)，其中57%為膜蛋白或膜相關(guān)蛋白，通過siRNA技術(shù)鑒定出與病毒增殖相關(guān)的幾種蛋白質(zhì)。,在疾病及藥物研究中的應(yīng)用,4、為快速，特異，高通量的藥物研究提供了技術(shù)支持。 Lin等應(yīng)用蛋白質(zhì)組學技術(shù)對阿霉素處理的人子宮癌細胞的蛋白

9、表達變化進行研究發(fā)現(xiàn)，有 37 種差異表達的蛋白質(zhì)，為阿霉素抗性的子宮癌細胞的治療提供了診斷和治療標志物。,蛋白質(zhì)組學的研究技術(shù),蛋白質(zhì)分離技術(shù)：雙向凝膠電泳（2DE），雙向熒光差異電泳（2D-DIGE），等電聚焦電泳（IEF）,液相色譜。 多維色譜（MDC），多維液相色譜（MDLC） 蛋白質(zhì)鑒定技術(shù) 一級質(zhì)譜：根據(jù)離子源的不同，分為基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）和電噴霧質(zhì)譜（ESI- MS）。二級質(zhì)譜： 肽質(zhì)量指紋圖譜（PMF）。 新技術(shù)：穩(wěn)定同位素特征標簽生物質(zhì)譜(SIAMS),iTRAQ,定義：同位素標記相對和絕對定量(isobaric tags for

10、relative and absolute quantitation，iTRAQ) 技術(shù)由AB SCIEX公司研發(fā)的一種體外同種同位素標記的相對與絕對定量技術(shù)。該技術(shù)利用多種同位素試劑標記蛋白多肽N末端或賴氨酸側(cè)鏈基團，經(jīng)高精度質(zhì)譜儀串聯(lián)分析，可同時比較多達8種樣品之間的蛋白表達量，是近年來定量蛋白質(zhì)組學常用的高通量篩選技術(shù)。 原理：iTRAQ 技術(shù)采用4種或8種同位素編碼的標簽，通過特異性標記多肽的氨基基團，而后進行串聯(lián)質(zhì)譜分析，可同時比較4種或8種不同樣品中蛋白質(zhì)的相對含量或絕對含量。,iTRAQ試劑 iTRAQ試劑是一種小分子同重元素化學物質(zhì)，包括三部分： 1.一端是報告部分 repor

11、ter group 2.另一端是肽反應(yīng)部分 peptide reactive group 3.中間部分是平衡部分 balance group reporter group：質(zhì)量為114Da、115 Da、116 Da、117Da，因此iTRAQ試劑共四種； peptide reactive group：將reporter group與肽N端及賴氨酸側(cè)鏈連接，幾乎可以標記樣本中所有蛋白質(zhì)； balance group：質(zhì)量為31 Da、30 Da、29 Da、28 Da，使得四種iTRAQ試劑分子量均為145 Da，保證iTRAQ標記的同一肽段m/z相同。,iTRAQ 試劑結(jié)構(gòu),iTRAQ 試劑

12、標記原理,4個來源不同的相同蛋白樣品在一級質(zhì)譜上表現(xiàn)相同;Balance group在二級質(zhì)譜發(fā)生中性丟失;Reporter group 在二級質(zhì)譜產(chǎn)生個報告離子，分別是114、115、116和117;通過分析報告離子的峰強度比值就可以分析同一個蛋白在不同樣品間的表達量比值.,操作流程,儀器,TripleTOFTM5600+系統(tǒng)是快速評估藥物代謝穩(wěn)定性、藥物在體內(nèi)特征和最終代謝產(chǎn)物鑒定的理想平臺。在最快采集速度條件下，用高分辨和準確質(zhì)量質(zhì)譜數(shù)據(jù)，完成無與倫比的蛋白質(zhì)定性鑒定工作。,技術(shù)特點,定量精確：每組平行比較多達8個樣本，標記效率高達97%，可減少樣本處理、以及不同組上機造成的實驗誤差。

13、高效率樣品分離：進行SCX-HPLC分離，實現(xiàn)自動化操作。 高鑒定率：系統(tǒng)全面地研究組織或細胞中盡可能多的蛋白質(zhì)，可鑒定多達6000種蛋白。 適用范圍廣：無物種特異性限制，理論上可用于所有物種。iTRAQ技術(shù)不僅可發(fā)現(xiàn)胞漿蛋白，還有膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白。 儀器性能優(yōu)良：基于高分辨率（大于105）、高質(zhì)量精度（小于1ppm）質(zhì)譜平臺，可獲得更加準確的結(jié)果。iTRAQ技術(shù)可檢測出低豐度蛋白、強堿性蛋白、小于10KD或大于200KD的蛋白。,熒光差異凝膠電泳,原理 在二維電泳的基礎(chǔ)上進行熒光標記 特點 DIGE熒光差異蛋白表達分析系統(tǒng)在傳統(tǒng)雙向電泳技術(shù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合了多重熒光分析的方法，在同一塊膠上共同分離多個分別由不同熒光標記的樣品，并第一次引入了內(nèi)標的概念，極大地提高了結(jié)果的準確性，可靠性和重復性。在DIGE技術(shù)中，每個蛋白點都有它自己的內(nèi)標，并且軟件全自動根據(jù)每個蛋白點的內(nèi)標對其表達量進行校準，保證所檢測到的蛋白豐度變化是真實的。DIGE技術(shù)可檢測到樣品間小于10%的蛋白表達差異，統(tǒng)計學可信度達到95%以上。,實驗流程,儀器 熒光差異凝膠電泳系統(tǒng)Ettan DIGE 2D 試劑 1.樣品標記 （1）染料 Cy2,Cy3,Cy5 與蛋白的賴氨酸的epsilon-氨基反應(yīng)，產(chǎn)生三種帶正電荷的熒光基團，在不同波長光激發(fā)下產(chǎn)生熒光。,2.一相等點聚焦 （2）IPG膠條水化