Mtt說(shuō)明說(shuō)和使用方法

1、產(chǎn)品簡(jiǎn)介： 1. MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(MTT Cell Proliferation and Cytotoxicity Assay Kit)被廣泛應(yīng)用于細(xì) 胞增殖和細(xì)胞毒性的實(shí)驗(yàn)方法。由于細(xì)胞活力與細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)，因此常常用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況。MTT可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成結(jié)晶狀的深紫色產(chǎn)物formazan。在特定溶劑存在的情況下，可以被完全溶解。然后通過(guò)酶標(biāo)儀可以測(cè)定570nm波長(zhǎng)附近的吸光度。細(xì)胞增殖越多越快，則吸光度越高；細(xì)胞毒性越大，則吸光度越低。 2. 本試劑盒采用了獨(dú)特的Formazan溶解液配方，無(wú)需去除原有的培養(yǎng)液，可以直接加入Formazan溶解 液

2、溶解formazan。從而避免了由于去除培養(yǎng)液時(shí)formazan被部分去除而引起的誤差。3. 本試劑盒背景低，靈敏度高，線性范圍寬，使用方便提高了可靠性。4. 本產(chǎn)品為500 次（5個(gè)96孔細(xì)胞培養(yǎng)板）操作。 產(chǎn)品內(nèi)容： MTT染色液 5ml Formazan溶解液 55ml 說(shuō)明書 1份 保存條件： MTT染色液需-20避光保存；Formazan溶解液可以室溫保存。 注意事項(xiàng)： 1. 由于使用96孔板進(jìn)行檢測(cè)，如果你的細(xì)胞要養(yǎng)48 h或更長(zhǎng)，建議不要吝嗇96-孔板的四周邊孔，這32 個(gè)邊孔不能使用，建議加入滅菌PBS以飽和中間64個(gè)孔的水分。因?yàn)榧?xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，邊孔的水分蒸發(fā)很快，培養(yǎng)液及里

3、面的藥物會(huì)出現(xiàn)濃縮現(xiàn)象，細(xì)胞的狀況就復(fù)雜了 2. MTT溶劑在低溫情況下會(huì)凝固，使用前請(qǐng)室溫放置或20-25水浴溫育片刻至全部融解后使用。 3. MTT一般最好4C避光保存兩周內(nèi)有效，保存在-20度長(zhǎng)期保存，避免反復(fù)凍融，最好小劑量分裝， 用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解，尤其當(dāng)MTT變?yōu)榛揖G色時(shí)就絕對(duì)不能再用了。 4. Formazan溶解液結(jié)凍或產(chǎn)生沉淀時(shí)可以37水浴孵育以促進(jìn)溶解，并且必須在全部溶解并混勻后使 用。 5. 孵育時(shí)，須避光 6. MTT有致癌性，用的時(shí)候小心,有條件最好帶那種透明的簿膜手套.配成的MTT需要無(wú)菌，MTT對(duì)菌 很敏感。 使用說(shuō)明： 1. 收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞

4、，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入100ul,鋪板使待測(cè)細(xì)胞調(diào)密度至1000-10000孔，（邊 緣孔用無(wú)菌PBS填充）。 2. 5%CO2，37孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底（96孔平底板，具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的 大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。加入濃度梯度的藥物，原則上，細(xì)胞貼壁后即可加藥，或兩小時(shí)，或半天時(shí)間，每孔0-10ul，設(shè)3-5個(gè)復(fù)孔.建議設(shè)5個(gè)。 3. 5%CO2，37孵育16-48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察。 4. 每孔加入10微升MTT染色液，繼續(xù)培養(yǎng)4h。若藥物與MTT能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小 心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。 5. 每孔加入1

5、00微升Formanzan溶解液，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè) 儀570nm測(cè)定吸光度。如無(wú)570nm濾光片，可以使用560-600nm的濾光片。 6. 同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT染色液、Formanzan溶解液），對(duì)照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介 質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT染色液、Formanzan溶解液）MTT法1、什么是MTT法? 又稱MTT比色法，是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法。其檢測(cè)原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚

6、，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測(cè)、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及腫瘤放射敏感性測(cè)定等。它的特點(diǎn)是靈敏度高、經(jīng)濟(jì)。 2、MTT法 - 缺點(diǎn)： 由于MTT經(jīng)還原所產(chǎn)生的甲瓚產(chǎn)物不溶于水，需被溶解后才能檢測(cè)。這不僅使工作量增加，也會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響，而且溶解甲瓚的有機(jī)溶劑對(duì)實(shí)驗(yàn)者也有損害。 3、 MTT法 - MTT 溶液的配制方法 通常，此法中的MTT 濃度為5mg/ml。因此，可以稱取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸緩沖液（PBS）

7、或無(wú)酚紅的培養(yǎng)基中，用0.22m濾膜過(guò)濾以除去溶液里的細(xì)菌，放4 避光保存即可。在配制和保存的過(guò)程中，容器最好用鋁箔紙包住。 4、MTT法 - 注意事項(xiàng) MTT法只能用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)數(shù)和相對(duì)活力，但不能測(cè)定細(xì)胞絕對(duì)數(shù)。在用酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果的時(shí)候，為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的線性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范圍內(nèi)。 5、MTT一般最好現(xiàn)用現(xiàn)配，過(guò)濾后4C避光保存兩周內(nèi)有效，或配制成5mg/ml保存在-20度長(zhǎng)期保存，避免反復(fù)凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分裝在EP管里，用的時(shí)候現(xiàn)配，直接往培養(yǎng)板中加，沒(méi)必要一下子配那么多,尤其當(dāng)MTT變?yōu)榛揖G色時(shí)就絕

8、對(duì)不能再用了。 6、MTT有致癌性，用的時(shí)候小心,有條件最好帶那種透明的簿膜手套.配成的MTT需要無(wú)菌，MTT對(duì)菌很敏感；往96孔板加時(shí)不避光也沒(méi)有關(guān)系，畢竟時(shí)間較短，或者你不放心的時(shí)候可以把操作臺(tái)上的照明燈關(guān)掉. 配制MTT時(shí)用用PBS溶解,也有人用生理鹽水配，60水浴助溶。 PBS配方：Nacl 8g Kcl 0.2g Na2HPO4 1.44g KH2PO4 0.24g 調(diào)pH 7.4 定容1L MTT法 - MTT法實(shí)驗(yàn)步驟 貼壁細(xì)胞： 1、收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入100ul,鋪板使待測(cè)細(xì)胞調(diào)密度至1000-10000孔，（邊緣孔用無(wú)菌PBS填充）。2.、5%CO2，

9、37孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底（96孔平底板）,加入濃度梯度的藥物,原則上，細(xì)胞貼壁后即可加藥，或兩小時(shí)，或半天時(shí)間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥.一般5-7個(gè)梯度,每孔100ul,設(shè)3-5個(gè)復(fù)孔.建議設(shè)5個(gè)，否則難以反應(yīng)真實(shí)情況 3.、5%CO2，37孵育16-48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察。 4、每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。若藥物與MTT能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。 5、終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。 6、每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶

10、聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD490nm處測(cè)量各孔的吸光值。 7、同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對(duì)照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜） 懸浮細(xì)胞： 1、收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃(儲(chǔ)存液100 1640）。mg/ml，需預(yù)試尋找最佳稀釋度，1:10-1:20)；需檢測(cè)物10ul；細(xì)胞懸液50ul（即5104cell/孔），共100ul加入到96孔板（邊緣孔用無(wú)菌水填充）。每板設(shè)對(duì)照（加100m度1106/ml，按次序?qū)⒀a(bǔ)足的1640（無(wú)血清）培養(yǎng)基40ul ；加Actinomycin D（有毒性）10ul用培養(yǎng)液稀釋 l 2、置37，5%CO2孵育16-48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察。 3、每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。（懸浮細(xì)胞推薦使用WST-1，培養(yǎng)4 h后可跳過(guò)步驟4），直接酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD570nm（630nm校準(zhǔn)）測(cè)量各孔的吸光值） 4、