福林酚法測蛋白

1、福林-酚法的原理 該方法是雙縮脲法的發(fā)展，包括兩步反應(yīng)：(1)在堿性條件下，蛋白質(zhì)與銅作用生成蛋白質(zhì)銅絡(luò)合物。(2)此絡(luò)合物將試劑磷鉬酸磷鎢酸(FolIn試劑)還原，混合物深藍(lán)色(磷鉬藍(lán)和磷鎢藍(lán)混合物)，顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比。此方法操作簡便，靈敏度比雙縮脲法高100倍，定量范圍為5100g蛋白質(zhì)。FolIn試劑顯色反應(yīng)由酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸引起，因此樣品中若含有酚類、檸檬酸和巰基化合物，均有干擾作用。此方法的缺點(diǎn)是有蛋白質(zhì)的特異性影響，即不同蛋白質(zhì)因絡(luò)氨酸、色氨酸含量的不同而使顯色強(qiáng)度稍有不同，標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式。【儀器與用具】試管若干；刻度移液管05Ml 1支，1Ml 1

2、支，10Ml 1支；定量加樣器；圓底燒瓶；冷凝管1套(帶橡膠管)；微量滴定管；小燒杯；微量進(jìn)樣器50l 1支；721分光光度計(jì)；恒溫水浴器；研缽；玻棒；離心機(jī)；離心管?！驹噭縉A2WO42H2O；NA2MoO42H2O；85H3PO4；濃HCl；LI2SO4H2O；溴水；酚酞指示劑；NA2CO3；NAOH；CuSO45H2O；酒石酸鉀鈉；牛血清白蛋白。所用試劑均為化學(xué)純或分析純?！痉椒ā?試劑的配制(1)堿性銅試劑(相當(dāng)于雙縮脲試劑)的制備首先配制A液：4碳酸鈉(NA2CO3)溶液與0.2MolL氫氧化鈉(NAOH)溶液等比例混合(2NA2CO3，01Mol NAOH)；B液：1硫酸銅(Cu

3、SO45H2O)溶液與2酒石酸鉀鈉溶液等比例混合(0.5CuSO45H2O，0.1酒石酸鉀鈉)。在使用前將A液與B液按501的比例混合即成。此為FolIn酚試劑甲液，此試劑只能使用1天。酚試劑(相當(dāng)于FolIn試劑)的配備：稱取鎢酸鈉(NA2WO42H2O)100g、鉬酸鈉(NA2MoO42H2O)25g，加蒸餾水700Ml溶解于1500Ml的圓底燒瓶中。之后加入85的H3PO450Ml，濃HCl 100Ml，安上回流裝置(使用磨口接頭，若用軟木塞或橡皮塞時，就必須用錫鉑紙包起來)，使其慢慢沸騰10H。冷卻后加入硫酸鋰(LI2SO4H2O)150g，水50Ml，溴水23滴，不用回流裝置開口煮沸

4、15Min，以釋放出過量的溴。待冷卻后稀釋至1000Ml，并過濾入棕色瓶中，密閉于冰箱中保存(冷卻后溶液呈黃色，倘若仍呈綠色，須再滴加數(shù)滴液體溴，繼續(xù)煮沸15Min)。使用時用標(biāo)準(zhǔn)NAOH溶液滴定，以酚酞作為指示劑，滴定終點(diǎn)由藍(lán)變灰，滴定后算出酸的濃度。使用時大約加水1倍，使最終濃度相當(dāng)于1MolL H酸，此為FolIn酚試劑乙液(FolIn試劑)。在測定時要注意，因?yàn)榉釉噭﹥H在酸性條件下穩(wěn)定，但此實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)只在PH值為10的情況下發(fā)生，所以當(dāng)加酚試劑時，必須立即混勻，以便在磷鉬酸磷鎢酸試劑被破壞前即能發(fā)生還原反應(yīng)，否則會使顯色程度減弱。（2）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液的配制 稱取25mg牛血清白蛋白，溶

5、于100Ml蒸餾水中，使最終濃度為250gMl。2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制（1）取7支試管，編號后，分別加入0ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，用蒸餾水補(bǔ)足1Ml，使每管含蛋白量分別為0g、25g、50g、100g、150g、200g、250g(必要時可做重復(fù))。(2)在每支試管中用定量加樣器加入5Ml甲液，混勻，于30下放置10Min。(3)在每支試管中噴射加入0.5Ml乙液，立即振蕩混勻，在30下保溫30Min。(4)準(zhǔn)確到30Min后，以不加標(biāo)準(zhǔn)蛋白試管中的溶液為空白，在500nM下用1CM光徑的比色杯對系列標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液進(jìn)行比色，測定光密度值。以蛋白濃度為橫坐標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。3樣品的測定(1)樣品的提?。悍Q取鮮樣05g，用5Ml蒸餾水或緩沖液研磨提取。取10Ml(視蛋白質(zhì)含量適當(dāng)稀釋)樣液加入試管中，然后重復(fù)步驟2的(2)、(3)、(4)，以標(biāo)準(zhǔn)曲線中的0管為空白，測定吸光值。(2)根據(jù)吸光值查標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出比色液中的蛋白質(zhì)含量。4結(jié)果計(jì)算樣品中蛋白的含量(Mgg)CVTV1FW1000(2-1）式中C:查標(biāo)準(zhǔn)曲線值(g)；VT:提取液總體積(Ml)；FW:樣品鮮重(g)；V1:測定時加樣量(Ml)?！咀⒁狻窟€原物質(zhì)，其他酚類物質(zhì)及檸檬酸對此反應(yīng)有干擾。/