第二章目的基因連接及導入

1、.,第五節(jié) 目的基因與載體連接,基因工程之,.,二、 目的基因與載體的連接（接）,質(zhì)粒,DNA分子,一個切口 兩個黏性末端,兩個切口 獲得目的基因,DNA 連接酶,重組DNA分子（重組質(zhì)粒）,同一種 限制酶,目的基因與運載體的結(jié)合過程，實際上是不同來源的基因重組的過程。,.,（主要有以下4種連接方式） 1) 粘性末端連接 2） 平頭末端連接 3） 人工接頭法 4） 同源多聚尾連接法,工具酶：基因工程中的工具酶主要包括用于DNA和RNA分子的切割、連接、聚合、逆轉(zhuǎn)錄等相關的各種酶類。,.,DNA連接酶,只能催化互補粘性末端之間的連接,DNA 連接酶（DNA ligase）能催化雙鏈DNA片段緊靠

2、在一起的3-OH 末端與5-P末端之間形成磷酸二酯鍵，使末端連接。,催化互補粘性末端和平末端之間的連接，但平末端之間連接的效率比較低 。,.,將目的基因和載體用同一種限制酶酶切，產(chǎn)生相同粘性末端，再通過DNA連接酶作用將兩者連接起來，構(gòu)成重組DNA分子。,用同一種或兩種 限制性內(nèi)切酶酶切,DNA連接酶,重組質(zhì)粒,質(zhì)粒,目的基因,本法適用于在質(zhì)粒和目的基因上有相同單或雙酶切位點,（一） 粘性末端連接,有些限制酶只能將目的基因和載體DNA切割成平端，此時在T4DNA連接酶的作用下同樣能連接起來。,質(zhì)粒,產(chǎn)生平末端的 內(nèi)切酶,DNA連接酶,產(chǎn)生粘性末端 的內(nèi)切酶,核酸酶S1,目的基因,重組質(zhì)粒,核酸

3、酶S1,本法適用于在質(zhì)粒 和目的基因上沒有相 同的酶切位點！,（二）平頭末端連接,.,（三） 人工接頭法 合成連接子與DNA平頭末端連接限制酶切割,產(chǎn)生粘性末端連接，構(gòu)建重組DNA。,.,用接頭連接,用同一種 限制性內(nèi)切酶酶切,DNA連接酶,重組質(zhì)粒,質(zhì)粒,目的基因,+,+,DNA連接酶,接頭(linker),本法適用于在質(zhì)粒 和目的基因上沒有相 同的酶切位點！,.,（四）同源多聚尾連接法,.,尾接法,DNA連接酶,重組質(zhì)粒,質(zhì)粒,目的基因,內(nèi)切酶,末端轉(zhuǎn)移酶 +dGTP,末端轉(zhuǎn)移酶 +dCTP,本法適用于在質(zhì)粒 和目的基因上沒有相 同的酶切位點,.,基因與載體的平末端連接方法有哪些？,(1)

4、T4DNA連接酶法 連接平末端DNA分子的方法有2種，一種是直接用T4DNA連接酶連接，另一種是先用末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶給平末端DNA分子加上同聚物尾巴之后再用DNA連接酶進行連接。T4DNA連接酶同一般的大腸桿菌DNA連接酶不同。T4DNA連接酶除了能夠封閉具有3-OH和5-P末端的雙鏈DNA的缺口之外,在存在ATP和加入高濃度酶的條件下,它還能夠連接具有完全配對堿基的平末端DNA分子,但其連接效率比粘性端要低的多。,.,（2） 同聚物加尾法 5特意的核酸外切酶處理目的基因及質(zhì)粒的平末端，移去幾個末端核苷酸。運用末端核苷酰轉(zhuǎn)移酶，能夠?qū)⒑塑账幔ㄍㄟ^脫氧核苷三磷酸前體）加到DNA分子單鏈延伸末端的

5、3-OH基因上,它并不需要模板鏈的存在,它一個一個加上核苷酸,構(gòu)成由核苷酸組成的尾巴,長度可達100個核苷酸。在載體中加入dTTP和末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶，在載體3OH末端延伸形成單鏈PolyT尾巴。將兩者混合發(fā)生互補連接，缺口用DNA連接酶封閉。,.,3）用化學合成的銜接物連接 DNA分子用化學合成法合成一段1012個核苷酸，具有限制酶識別位點的寡核苷酸片段，磷酸化后，通過T4DNA連接酶，將片段分別于載體5端和目的基因片段5連接起來。用相應的限制性內(nèi)切酶處理，產(chǎn)生互補的粘性末端。 4）T-A克隆法： TagDNA聚合酶在擴增目的基因DNA的同時，還能不依賴模版在產(chǎn)物3末端加上兩個游離的A。只要載

6、體切口除人工加上的游離T，PCR產(chǎn)物即可于載體連接。,.,T-A克隆 T-vector兩條鏈的5端含有一個游離的T PCR過程中，普通的Taq酶可在產(chǎn)物的3端多加一個A,.,1.用一定的_切割 質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切 口，露出_。 2.用_切斷目 的基因，使其產(chǎn)生_ _。,3.將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的_處， 再加入適量_，形成了一個重組 DNA分子（重組質(zhì)粒）,限制酶,黏性末端,同一種限制酶,的黏性末端,切口,DNA連接酶,相同,質(zhì)粒單酶切點的基因連接如何降低本底和防止自我環(huán)化和提高連接效率？,目的基因片斷與載體由相同的單一限制性核酸內(nèi)切酶（如EcoRI）消化酶切后, 兩者的兩端均具有相同

7、的粘性末端, 稱為單酶切點的粘性末端, 又稱全同源性粘性末端 高背景 載體經(jīng)單一限制性核酸內(nèi)切酶切割后, 載體分子易于自我環(huán)化, 既不利于目的基因的重組連接, 大大降低陽性克隆效率, 又可使非重組性載體造成高背景。為了防止載體的自我環(huán)化，通常用堿性磷酸酶去除載體粘性末端的 5-P以抑制DNA的自我環(huán)化。在連接反應中, 具有5-P的目的基因DNA片斷可有效地與去磷酸化質(zhì)粒DNA載體通過粘性末端發(fā)生互補連接, 盡管產(chǎn)生的重組DNA分子于連接點含有兩個缺口的開環(huán)分子,盡管在轉(zhuǎn)化時其轉(zhuǎn)化效率高于線性低于閉和環(huán), 但轉(zhuǎn)化大腸桿菌后,在菌體內(nèi)其缺口可獲得修復。,., 雙向插入 經(jīng)單一限制核酸內(nèi)切酶（如Ec

8、oRI）切割的目的基因和載體, 因二者的粘性末端是相同的, 因此在連接反應中, 目的基因可發(fā)生雙向插入, 載體對目的基因表達是有方向的, 而目的基因可雙向與之相連, 這種連接若以克隆目的基因片段為目的沒有影響, 若以表達為目的, 我們就要對插入的片段進行方向鑒定, 因目的基因由起始密碼子向終止密碼子方向表達是定向轉(zhuǎn)錄的, 一旦啟動子與目的基因編碼順序方向相反就不能正確轉(zhuǎn)錄目的基因的mRNA。若構(gòu)建表達DNA重組體選用雙酶切切割目的基因和載體，可使目的基因與載體的連接發(fā)生定向連接重組, 以便定向克隆。(YL),.,第六節(jié) 重組DNA導入受體細胞,基因工程之,.,在目的基因與載體連接成重組DNA分

9、子以后，下面的重要工作主要是將其導入受體細胞進行擴增和篩選，獲得大量的重組DNA分子，這就是外源基因的無性繁殖，即克隆(cloning)。,由于外源基因與載體構(gòu)成的重組DNA分子性質(zhì)不同、宿主細胞不同，將重組DNA導入宿主細胞的具體方法也不相同。,轉(zhuǎn)重組DNA導入宿主細胞,.,受體細胞：也叫宿主細胞，是指在轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導、雜交中接受外源基因的細胞。 分為原核受體細胞(最主要是大腸桿菌)、真核受體細胞 (最主要是酵母菌)、動物細胞和昆蟲細胞(其實也是真核受體細胞)。,具有接受外源DNA的能力；為限制性內(nèi)切酶缺陷型菌珠或為DNA重組型菌珠 ；在標記上和載體對應；有利于表達；不適宜在人體或非培養(yǎng)條件下生

10、存，有利于安全。,受體細胞條件,.,原核生物細胞是較為理想的受體細胞： 沒有細胞壁，便于外源DNA 的進入； 沒有核膜，染色體DNA 沒有固定結(jié)合的蛋白質(zhì)，便于外源DNA與染色體DNA 重組； 基因組小，遺傳背景簡單，便于外源基因的遺傳分析； 容易獲得一致性的實驗材料，培養(yǎng)簡單，繁殖迅速，易重復。,.,表達真核生物基因存在一定的缺陷，很多真核生物基因往往不能在原核生物細胞內(nèi)表達出具有生物活性的功能蛋白。 需要進行適當?shù)男揎?.,酵母作為受體細胞，除了真核生物細胞共有的特性外，還具有以下優(yōu)點： 基因結(jié)構(gòu)相對簡單，其基因表達調(diào)控機制研究比較清楚，便于基因工程操作； 培養(yǎng)簡單，適于大規(guī)模生產(chǎn)，成本低

11、廉；可以分泌表達，便于產(chǎn)物的提取和加工； 不產(chǎn)生毒素，是安全的受體細胞。,真核生物細胞-酵母受體細胞,.,植物細胞作為受體細胞，除了真核細胞共有的特性外，最突出的優(yōu)點就是其體細胞的全能性，一個獲得外源基因的體細胞可以培養(yǎng)出能穩(wěn)定遺傳的植株或品系。 不足之處是植物細胞有纖維素參與組成的堅硬細胞壁，不利于攝取重組DNA 分子。,.,動物細胞同樣可以作為受體細胞。早期多采用生殖細胞、受精卵細胞或胚細胞作為受體細胞，近年來干細胞成為新的研究熱點。,.,原核生物細胞，大腸桿菌 優(yōu)點：結(jié)構(gòu)簡單，便于操作分析 缺點：表達蛋白可能沒有活性,真核生物細胞，酵母 優(yōu)點：表達蛋白加工具有活性 缺點：操作相對麻煩,大

12、腸桿菌是目前基因工程中最常用的受體細胞。 通常采用的是大腸桿菌的感受態(tài)細胞，即在冰浴中用一定濃度的CaCl2處理對數(shù)生長期的大腸桿菌，以獲得高效轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞。也有采用Rb+、Mn2+、K+、二甲亞礬、二硫蘇糖醇(DTT)或用氯化己胺鈷處理制備感受態(tài)細胞。,感受態(tài)是指受體細胞能吸收外源DNA分子而有效地作為轉(zhuǎn)化受體的某些生理狀態(tài)。 一般受體細胞在對數(shù)生長期轉(zhuǎn)化能力最強。,.,1、直接導入法：,（1）顯微注射法：利用微量注射器在顯微鏡下直接把目的基因注入宿主細胞。 （2）電擊法：借助電擊儀高壓脈沖把目的基因打入宿主細胞。 （3）直接吸收法：把目的基因和宿主細胞混在一起，讓其吸收。 （4）基因槍

13、法：在金屬微粒上涂一層目的基因，然后發(fā)射到宿主細胞中。,基因?qū)敕椒?又稱之為直接顯微注射。一般是用微吸管吸取供體DNA溶液，在顯微鏡下準確地插入受體細胞核中，并將DNA注射進去。此法常用于轉(zhuǎn)基因動物的基因轉(zhuǎn)移。,（1）微注射技術：是將外源基因直接注射到真核細胞內(nèi)的方法；,將外源基因通過毛細玻璃管，再顯微鏡下注釋到受精卵的細胞核內(nèi)的方法。,.,（2）電轉(zhuǎn)化法,也有人稱做高壓電穿孔法（簡稱電穿孔法），即在受體細胞上施加短暫、高壓的電流脈沖，使質(zhì)膜形成納米大小的微孔，DNA能直接通過這些微孔，或者作為微孔閉合時所伴隨發(fā)生的膜組分重新分布而進入細胞質(zhì)中。 該法可用于真核細胞(如動物細胞和植物細胞)和

14、原核細胞(轉(zhuǎn)化大腸桿菌和其他細菌等)的外源DNA的直接導入。 電穿孔法具有簡便、快速、效率高等優(yōu)點,電擊的處理方式對轉(zhuǎn)化率有著決定性的作用，有兩種不同的處理方式：一種是較低的電壓，處理較長的時間（350V/cm 54s）；另一種是高電壓，短時間處理（11.25kV/cm,10s)。一般常用第二種處理方式。,.,1.磷酸鈣沉淀法,利用磷酸鈣-DNA共沉淀，把外源基因與噬菌體DNA的重組分子導入大腸桿菌和哺乳動物細胞，簡稱磷酸鈣沉淀法。細胞具有攝取磷酸鈣沉淀的雙鏈DNA的能力，幾乎所有的雙鏈DNA都可以通過這種方法導入細胞，而且可在電子顯微鏡下清楚地看到細胞吞噬 DNA-磷酸鈣復合顆粒。此法的轉(zhuǎn)染

15、效率遠遠不如體外包裝法。,（3）直接吸收法：,.,Ca2+誘導DNA對大腸桿菌細胞的轉(zhuǎn)化的可能原因：,在0的Cacl2低滲溶液中，細菌細胞發(fā)生膨脹，同時Cacl2使細胞膜磷脂層形成液晶結(jié)構(gòu)，促使細胞外膜與內(nèi)膜間隙中的部分核酸酶解離開來，誘導大腸桿菌形成感受態(tài)。 Ca2+能與加入的DNA分子結(jié)合，形成抗DNA酶(DNase)的羥基-磷酸鈣復合物，并黏附在細菌細胞膜的外表面上。當42熱刺激短暫處理細菌細胞時，細胞膜的液晶結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈擾動，并隨之出現(xiàn)許多間隙，為DNA分子提供了進入細胞的通道。,.,.,該法重復性好。操作簡便快捷，適用于成批制備感受態(tài)細胞。對這種感受態(tài)細胞進行轉(zhuǎn)化，每g質(zhì)粒DNA可以

16、獲得51062l07個轉(zhuǎn)化茵落，完全可以滿足質(zhì)粒的常規(guī)克隆的需要,Mg2+對DNA分子有很大的穩(wěn)定性作用，因此利用Mgcl2與Cacl2共同處理大腸桿菌細胞，可以提高DNA的轉(zhuǎn)化效率。如利用二甲基亞砜(DMSO)和二硫蘇糖醇(DDT)等進一步處理細胞，能誘導高頻感受態(tài)細胞的形成，轉(zhuǎn)化效率可提高1001000倍，且對大小質(zhì)粒分子均可進行有效的轉(zhuǎn)化。 但該法要求條件高，對外界污染物極為敏感，通常很少采用。,.,（4）基因槍技術,又稱高速微型子彈射擊法、微彈射擊法、高速粒子轟擊法 基本原理：將DNA吸附在微型子彈(1m)的表面通過放電或機械加速，使子彈射入完整的細胞或組織內(nèi)。 基本做法：先將外源DN

17、A溶液與鎢、金等金屬微粒(直徑0.5-5m )共同保溫，使DNA吸附于金屬顆粒表面，然后放電加速金屬顆粒，使之以400m/s的速度直接噴射受體細胞，外源遺傳物質(zhì)隨金屬顆粒進入細胞內(nèi)部。,.,基因槍轉(zhuǎn)化的操作步驟,靶細胞或組織的預處理,微粒子彈的制備,裝備基因槍,轟擊,過渡培養(yǎng),進行篩選培養(yǎng)或 直接分化再生植株,PDS-1000 | He System,.,無宿主限制：農(nóng)桿菌介導法只對雙子葉植物敏感，限制了它的應用范圍。而基因槍沒有物種限制。 靶受體類型廣泛：可以是原生質(zhì)體，葉片，懸浮細胞，莖或根切段，種子胚，愈傷組織，花粉等。 操作簡單快速,基因槍法轉(zhuǎn)化的優(yōu)點有：,便攜式基因槍,.,1.體外包

18、裝轉(zhuǎn)染法,又稱感染，將目的基因放在載體上，感染到要表達的細胞中, 并在宿主菌體內(nèi)擴增和表達外源基因。 常用的載體是質(zhì)粒、噬菌體、科斯質(zhì)粒。,2、間接導入法,.,2.脂質(zhì)體介導法,脂質(zhì)體(又叫做人工膜泡)作為體內(nèi)或體外輸送載體的方法，一般都需要將DNA或RNA包囊于脂質(zhì)體內(nèi)，然后進行脂質(zhì)體與細胞膜的融合，通過融合導入細胞。,這種方法具有許多方面的優(yōu)點,包括可保護DNA在導入細胞之前免受核酸酶的降解作用,降低了對細胞的毒性效應,適用的植物種類廣泛,重復性高,包裝在脂質(zhì)體內(nèi)的DNA可穩(wěn)定地貯藏等。,.,人們很早就發(fā)現(xiàn)雙子葉植物常發(fā)生一種冠癭瘤病，該病在法國、東歐和意大利的葡萄和果樹上曾大面積發(fā)生。 1907年 Smith和Townsent等 首先發(fā)現(xiàn)這種冠癭瘤 病是由