2020版藥典微生物變更細(xì)則

1、-1-,新版藥典變更解讀 微生物相關(guān),分析質(zhì)檢中心微生物組2020年05月,涉及內(nèi)容,藥典三部： 生物制品通則：生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理規(guī)程 總論：微生態(tài)活菌制品總論（變更）,通則,1101 無(wú)菌檢查法（變更） 1105 非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法 1106 非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法 1107 非無(wú)菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn) 3605 細(xì)菌生化反應(yīng)培養(yǎng)基 1421 滅菌法 ,9202 非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查指導(dǎo)原則 9203 藥品微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則 9204 微生物鑒定指導(dǎo)原則（變更） 9205 藥品潔凈實(shí)驗(yàn)室微生物監(jiān)測(cè)和控制指導(dǎo)原則（變更）,通則,新增,滅

2、菌用生物指示劑指導(dǎo)原則（新增） 生物指示劑耐受性檢查法指導(dǎo)原則（新增） 細(xì)菌 DNA 特征序列鑒定法（新增）,一、生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理規(guī)程,菌毒種，系指直接用于制造和檢定生物制品的細(xì)菌、支原體、立克次體或病毒等 生產(chǎn)和檢定用菌毒種，來(lái)源途徑應(yīng)合法，并經(jīng)國(guó)務(wù)院藥品監(jiān)督管理部門批準(zhǔn)。,微生物檢測(cè)用菌來(lái)源： CMCC:中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心 CICC:中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心 ATCC:美國(guó)微生物菌株保藏中心,生物制品生產(chǎn)用菌毒種應(yīng)采用種子批系統(tǒng)。每批主種子批和工作種子批均應(yīng)按各論要求保管、檢定和使用。 菌毒種的傳代及檢定實(shí)驗(yàn)室應(yīng)符合國(guó)家生物安全的相關(guān)規(guī)定。 各生產(chǎn)單位質(zhì)量管理部門對(duì)

3、本單位的菌毒種施行統(tǒng)一管理。,保管菌毒種應(yīng)有嚴(yán)格的登記制度，建立詳細(xì)的總賬及分類賬。收到菌毒種后應(yīng)立即進(jìn)行編號(hào)登記，詳細(xì)記錄菌毒種的學(xué)名、株名、歷史、來(lái)源、特性、用途、批號(hào)、傳代凍干日期和數(shù)量。在保管過(guò)程中，凡傳代、凍干及分發(fā)，記錄均應(yīng)清晰，可追溯，并定期核對(duì)庫(kù)存數(shù)量。 收到菌毒種后一般應(yīng)及時(shí)進(jìn)行檢定。用培養(yǎng)基保存的菌種應(yīng)立即檢定,生產(chǎn)用菌毒種應(yīng)按各論要求進(jìn)行檢定,銷毀四類菌毒種須經(jīng)單位領(lǐng)導(dǎo)批準(zhǔn)。銷毀后應(yīng)在賬上注銷，作出專項(xiàng)記錄，寫明銷毀原因、方式和日期。,二、微生態(tài)活菌制品總論,微生態(tài)活菌制品必須由非致病的活細(xì)菌組成，無(wú)論在生產(chǎn)過(guò)程、制品貯存和使用期間均應(yīng)保持穩(wěn)定的活菌狀態(tài)。它可由一株、多株

4、或幾種細(xì)菌制成單價(jià)或多價(jià)聯(lián)合制劑。根據(jù)其不同的使用途徑和方法可制備成片劑、膠囊顆粒劑或散劑等多種劑型。,基本要求： 微生態(tài)活菌制品的制備方法、工藝應(yīng)能保證成品含有足夠的活菌數(shù)量，保持其穩(wěn)定性，同時(shí)應(yīng)防止外源因子的污染。生產(chǎn)和檢定用設(shè)施、原材料及輔料、水、器具、動(dòng)物等應(yīng)符合“凡例”的有關(guān)要求。,生產(chǎn)用菌種,生產(chǎn)用菌種應(yīng)符合“生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理規(guī)程”的有關(guān)規(guī)定,名稱及來(lái)源； 種子批的建立：三級(jí)種子批應(yīng)分別凍干，置適宜溫度保存；種子批傳代應(yīng)限定傳代次數(shù)，原始種子批和主種子批啟開(kāi)后傳代次數(shù)不得超過(guò)10代，工作種子批啟開(kāi)后至發(fā)酵培養(yǎng)傳代次數(shù)不得超過(guò)5代。,生產(chǎn)用菌種,種子批的檢定：應(yīng)依據(jù)最新版

5、伯杰氏細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)和伯杰氏細(xì)菌命名手冊(cè)的有關(guān)規(guī)定進(jìn)行，形態(tài)、生長(zhǎng)代謝特性檢查。原始種子或主種子還應(yīng)做遺傳特性和抗生素敏感性等檢查。,三級(jí)種子批常規(guī)檢查包括以下3 項(xiàng)： （1） 培養(yǎng)特性及染色鏡檢； （2） 生化反應(yīng)； （3） 毒性試驗(yàn),原始種子或主種子批還需進(jìn)行以下檢查 （1） 細(xì)菌代謝產(chǎn)物脂肪酸測(cè)定 （2） 遺傳特性分析 （3） 抗生素敏感性試驗(yàn) （4） 穩(wěn)定性試驗(yàn),生產(chǎn)用菌種,原始種子和主種子應(yīng)凍干保存于8以下，工作種子應(yīng)置于適宜溫度保存,檢定,微生態(tài)活菌制品質(zhì)量檢定應(yīng)包括菌粉檢定、半成品檢定和成品檢定,菌粉檢定,1. 外觀 2. 目的菌檢查 取少量菌粉加入適量滅菌生理氯化鈉溶液或其他

6、適宜稀釋液后，涂布在適宜瓊脂平皿上，在適宜條件下培養(yǎng)，其培養(yǎng)物的生長(zhǎng)特性和染色鏡檢的特征應(yīng)符合生產(chǎn)用菌種特征 。 3. 雜菌檢查 方法和結(jié)果判斷見(jiàn)本總論附錄3。如不符合規(guī)定應(yīng)廢棄。 4. 干燥失重 5. 活菌數(shù)測(cè)定 測(cè)定每克菌粉中含有的活菌數(shù)量。方法見(jiàn)本總論附錄2。,半成品的檢定,半成品須做雜菌檢查，根據(jù)用藥途徑確定雜菌檢查的質(zhì)控指標(biāo)。方法和結(jié)果判斷見(jiàn)本總論附錄3。,成品檢定,1. 鑒別試驗(yàn) 檢查成品中所含的目的菌是否符合生產(chǎn)用菌種的特性。即按上述“種子批的檢定”方法進(jìn)行生長(zhǎng)特性、染色鏡檢和生化反應(yīng)檢查，應(yīng)符合規(guī)定。 2. 理化檢查 3. 活菌數(shù)測(cè)定 按本總論附錄2方法測(cè)定每克制品中的活菌數(shù)，

7、應(yīng)符合規(guī)定。多價(jià)制品應(yīng)分別測(cè)定各單價(jià)活菌數(shù)。 4. 雜菌檢查 方法和結(jié)果判斷與半成品的“雜菌檢查”項(xiàng)相同。 5. 安全試驗(yàn)（新版已刪除）,附錄2 微生態(tài)活菌制品活菌數(shù)測(cè)定法,無(wú)菌稱取3.0g制品或菌粉（膠囊取內(nèi)容物），加入27.0ml稀釋液中，充分搖勻，做10倍系列稀釋（最終稀釋度根據(jù)不同的指標(biāo)要求而定）。取最終稀釋度的菌液100l，滴入選擇性瓊脂培養(yǎng)基平皿上，共做3個(gè)平皿，并以玻棒涂布均勻，置適宜條件下培養(yǎng)，到期觀察每個(gè)平皿菌落生長(zhǎng)情況，并計(jì)數(shù)。當(dāng)平皿菌落數(shù)小于10或大于300時(shí)，應(yīng)調(diào)整最終稀釋度，重新測(cè)定。 活菌數(shù)（CFU/g）=3個(gè)平皿菌落數(shù)之和/3*10*最終稀釋度,附錄3 微生態(tài)活菌

8、制品雜菌檢查法,微生態(tài)活菌制品雜菌檢查法系檢查微生態(tài)活菌制品的菌粉、半成品及成品受外源微生物污染程度的方法。檢查項(xiàng)目包括控制菌檢查，非致病性雜菌、真菌計(jì)數(shù)。,變更：,附錄3 微生態(tài)活菌制品雜菌檢查法,新增：,由于供試品本身含有大量活菌，可能在雜菌檢查所用的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，干擾雜菌回收或結(jié)果判斷，在建立或修訂方法時(shí)應(yīng)考慮其適用性，充分了解供試品活菌在雜菌檢查培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)特性。除本附錄收載的雜菌檢查用培養(yǎng)基之外，亦可采用其他經(jīng)驗(yàn)證的培養(yǎng)基。,附錄3 微生態(tài)活菌制品雜菌檢查法,新增：,如果供試品本身對(duì)某些試驗(yàn)菌具有較強(qiáng)的抑菌性能，影響試驗(yàn)菌的回收。在此情況下，應(yīng)根據(jù)原輔料的雜菌負(fù)載、生產(chǎn)工藝及產(chǎn)品特

9、性進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，保證檢驗(yàn)方法的可靠性；在藥品生產(chǎn)、貯藏各個(gè)環(huán)節(jié)中，應(yīng)嚴(yán)格遵循GMP的指導(dǎo)原則，以降低產(chǎn)品受雜菌污染的風(fēng)險(xiǎn)。,附錄3 微生態(tài)活菌制品雜菌檢查法,新增：,控制菌檢查法檢出意思致病菌時(shí)，可參考“微生物鑒定指導(dǎo)原則（通則9204）”的提示進(jìn)行后續(xù)確證，確證的方法應(yīng)選擇已被認(rèn)可的菌種鑒定方法。,檢驗(yàn)量及供試品的準(zhǔn)備,檢驗(yàn)量，即一次試驗(yàn)所用的供試品量（g）。檢驗(yàn)時(shí)，應(yīng)從2個(gè)以上最小包裝單位中隨機(jī)抽取不少于3倍檢驗(yàn)用量的供試品。 菌粉、半成品以及成品為散劑和顆粒劑的可直接稱取備用；成品為片劑、膠囊劑的需研碎后備用。,供試品檢查 陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn) 供試品進(jìn)行控制菌檢查時(shí)，應(yīng)做陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)。取陽(yáng)性對(duì)

10、照菌于相應(yīng)選擇性培養(yǎng)基平皿上劃線接種，按供試品的控制菌檢查方法培養(yǎng)，觀察菌落生長(zhǎng)情況。陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)檢出相應(yīng)的控制菌。 陰性對(duì)照試驗(yàn) 取增菌液0.1ml，照相應(yīng)控制菌檢查法檢查，作為陰性對(duì)照。陰性對(duì)照應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。,控制菌檢查,100l,大腸埃希氏菌； 志賀菌、沙門菌； 銅綠假單胞菌； 金黃色葡萄球菌； 梭菌； 白色念珠菌；,變更：,大腸埃希氏菌,志賀菌、沙門菌,銅綠假單胞菌,增加：,若平皿上未見(jiàn)菌落生長(zhǎng)，或雖有菌落生長(zhǎng)但鑒定結(jié)果為非控制菌，判供試品未檢出銅綠假單胞菌,銅綠假單胞菌,刪除：綠膿菌素試驗(yàn),金黃色葡萄球菌,刪除：血漿凝固酶試驗(yàn),控制菌檢查用培養(yǎng)基的適用性檢查,變更:,非致病性雜菌、真

11、菌計(jì)數(shù),陽(yáng)性對(duì)照 除另有規(guī)定外，真菌以白色念珠菌為對(duì)照菌，其他以金黃色葡萄球菌為對(duì)照菌 變更為：當(dāng)采用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅納瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行檢查時(shí)，真菌計(jì)數(shù)以白色念珠菌為對(duì)照菌，非致病雜菌計(jì)數(shù)以金黃色葡萄球菌為對(duì)照菌,因供試品為活菌制品，應(yīng)選用能抑制目的菌生長(zhǎng)的選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行檢查。除另有規(guī)定外，營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用于非致病性雜菌的計(jì)數(shù)，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基用于真菌計(jì)數(shù)。,排除目的菌干擾的,也可采用其它經(jīng)驗(yàn)證的培養(yǎng)基,真菌計(jì)數(shù),稱取供試品1g，加到9ml 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液或其他適宜稀釋液中，混勻，做10倍系列稀釋，取適宜稀釋度供試品溶液0.1ml加到已備好的玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上，以玻棒涂勻，一

12、式3份，倒置，于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96小時(shí)，每天觀察結(jié)果，記錄平皿上生長(zhǎng)的真菌菌落數(shù).,結(jié)果計(jì)算：以3個(gè)平皿上生長(zhǎng)的菌落平均數(shù)計(jì)算。真菌數(shù)（CFU/g）=3個(gè)平皿菌落數(shù)之和/3*10*稀釋倍數(shù),計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查,變更:,增加：營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基（BL）、曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基（EMB）、沙門、志賀菌屬瓊脂培養(yǎng)基（SS）,三、9204 微生物鑒定指導(dǎo)原則（變更）,本指導(dǎo)原則為非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度控制菌檢查中疑似菌的鑒定，以及藥物原料、輔料、制藥用水、中間體中間產(chǎn)品、終產(chǎn)品和環(huán)境等中檢出微生物的鑒定提供指導(dǎo)。當(dāng)微生物的鑒定結(jié)果有爭(zhēng)議時(shí)，以伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)現(xiàn)行版的鑒

13、定結(jié)果為準(zhǔn)。,微生物鑒定需達(dá)到的水平視情況而定，包括種、屬鑒定和菌株分型。大多數(shù)非無(wú)菌藥品生產(chǎn)過(guò)程和部分無(wú)菌生產(chǎn)環(huán)境的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中，對(duì)所檢出微生物的常規(guī)特征包括菌落形態(tài)學(xué)、細(xì)胞形態(tài)學(xué)（桿狀、球狀、細(xì)胞群、孢子形成模式等）、革蘭染色或其它染色法、及某些能夠給出鑒定結(jié)論的關(guān)鍵生化反應(yīng)（如氧化酶、過(guò)氧化氫酶和凝固酶反應(yīng)）進(jìn)行分析，一般即可滿足需要；非無(wú)菌產(chǎn)品的控制菌檢查一般應(yīng)達(dá)到種屬藥典規(guī)定的水平；無(wú)菌試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性和、無(wú)菌生產(chǎn)模擬工藝（如培養(yǎng)基灌裝）失敗、環(huán)境嚴(yán)重異常事件時(shí)，對(duì)檢出的微生物鑒定至少達(dá)到種屬水平，必要時(shí)需達(dá)到菌株水平,微生物鑒定的基本程序包括分離純化和鑒定，鑒定時(shí)，一般先將待檢菌進(jìn)行初步

14、的分類。鑒定的方法有表型微生物鑒定和基因型微生物鑒定，根據(jù)所需達(dá)到的鑒定水平選擇鑒定方法。 未知菌鑒定時(shí)通過(guò)與微生物鑒定系統(tǒng)中的標(biāo)準(zhǔn)參考微生物（模式菌株、標(biāo)準(zhǔn)菌株或經(jīng)確認(rèn)的菌株等）的特征（基因型和/或表型）相匹配來(lái)完成 在日常的微生物鑒定試驗(yàn)中，用戶應(yīng)明確所采用鑒定系統(tǒng)的局限性及所要達(dá)到的鑒定水平（屬、種、菌株），選用最適合要求的鑒定技術(shù)，必要時(shí)采用多種鑒定方法確定。,待檢菌的分離純化,最常用的分離純化方法是挑取待檢菌在適宜的固體培養(yǎng)基上連續(xù)劃線分離純化，以獲取待檢菌的純培養(yǎng)物（單個(gè)菌落）,必要時(shí)可進(jìn)一步進(jìn)行純培養(yǎng)，為表型鑒定和隨后的鑒定程序提供足夠量菌體。,初篩試驗(yàn),常見(jiàn)的初篩試驗(yàn)包括形態(tài)觀

15、察、革蘭染色、芽孢染色、鏡檢（或氫氧化鉀拉絲試驗(yàn)）、觀察染色結(jié)果和細(xì)胞形態(tài)、重要的生化反應(yīng)等。,氧化酶試驗(yàn) 用于區(qū)分不發(fā)酵的革蘭陰性桿菌（氧化酶陽(yáng)性）和腸道菌（氧化酶陰性）。 過(guò)氧化氫酶試驗(yàn) 用于區(qū)分葡萄球菌（過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性）和鏈球菌（過(guò)氧化氫酶陰性）。 凝固酶試驗(yàn) 用于區(qū)分凝固酶陰性葡萄球菌（可推測(cè)為非致病性）和凝固酶陽(yáng)性葡萄球菌（很可能為致病性）。,表型微生物鑒定,表型微生物鑒定,除受其遺傳基因的控制外，還與微生物的分離環(huán)境、培養(yǎng)基和生長(zhǎng)條件等因素有關(guān) 在表型鑒定時(shí)應(yīng)注意采用的培養(yǎng)基、培養(yǎng)時(shí)間和傳代次數(shù)對(duì)鑒定結(jié)果的影響,四、3605 細(xì)菌生化反應(yīng)培養(yǎng)基,測(cè)定細(xì)菌的糖類代謝試驗(yàn)、氨基酸和蛋白

16、質(zhì)代謝試驗(yàn)、碳源和氮源利用試驗(yàn)等生化反應(yīng),糖、醇發(fā)酵培養(yǎng)基 七葉苷培養(yǎng)基 磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基（MR-VP反應(yīng)） 蛋白胨水培養(yǎng)基（靛基質(zhì)試驗(yàn)） 三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基 克氏雙糖鐵瓊脂培養(yǎng)基 脲（尿素）培養(yǎng)基 苯丙氨酸瓊脂培養(yǎng)基 氨基酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基 明膠培養(yǎng)基 丙二酸鈉培養(yǎng)基 枸櫞酸鹽培養(yǎng)基 硝酸鹽胨水培養(yǎng)基 石蕊牛奶培養(yǎng)基 半固體營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,五、細(xì)菌 DNA 特征序列鑒定法（新增）,細(xì)菌 DNA 特征序列鑒定法系以特征核酸序列作為目標(biāo)檢測(cè)物，用于藥用原料、輔料、制藥用水、中間產(chǎn)品、終產(chǎn)品、包裝材料和環(huán)境等藥品全生命周期質(zhì)量控制中細(xì)菌的鑒定。 開(kāi)展細(xì)菌鑒定試驗(yàn)的環(huán)境應(yīng)具備分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的基

17、本條件，并符合相應(yīng)級(jí)別的生物安全要求。,六、1101 無(wú)菌檢查法（變更）,培養(yǎng)基的變更：,制備好的培養(yǎng)基應(yīng)保存在 225、避光的環(huán)境，若保存于非密閉容器中，一般在 3 周內(nèi)使用；若保存于密閉容器中，一般可在一年內(nèi)使用。,在供試品接種前，培養(yǎng)基氧化層的高度不得超過(guò)培養(yǎng)基深度的1/53，否則，須經(jīng)100水浴加熱至粉紅色消失（不超過(guò) 20 分鐘），迅速冷卻，只限加熱一次，并防止被污染。,培養(yǎng)基的適用性檢查,無(wú)菌性檢查 每批培養(yǎng)基隨機(jī)取不少于 5 支（瓶），置各培養(yǎng)基規(guī)定的溫度培養(yǎng) 14 天，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。 靈敏度檢查 菌液制備： 金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆胨液體培

18、養(yǎng)基中或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上，接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，3035培養(yǎng) 1824 小時(shí)； 接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，2025培養(yǎng) 23 天 2448 小時(shí)， 接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，2025培養(yǎng) 57 天，加入 35ml 含 0.05（ml/ml）聚山梨酯 80 的 pH7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。,培養(yǎng)接種 取每管裝量為 12ml 的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基 7 支，分別接種小于不大于 100cfu 的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌各 2 支，

19、另 1 支不接種作為空白對(duì)照，培養(yǎng)不超過(guò) 3 天； 取每管裝量為 9ml 的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基 7 支,分別接種小于不大于 100cfu 的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各 2 支，另 1 支不接種作為空白對(duì)照，培養(yǎng)不超過(guò) 5 天。逐日觀察結(jié)果。 結(jié)果判定 空白對(duì)照管應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)，若加菌的培養(yǎng)基管均生長(zhǎng)良好，判該培養(yǎng)基的靈敏度檢查符合規(guī)定,薄膜過(guò)濾法,薄膜過(guò)濾法一般應(yīng)采用封閉式薄膜過(guò)濾器，根據(jù)供試品及其溶劑的特性選擇濾膜材質(zhì)。無(wú)菌檢查用的濾膜孔徑應(yīng)不大于 0.45m。濾膜直徑約為 50mm，若使用其他尺寸的濾膜，應(yīng)對(duì)稀釋液和沖洗液體積進(jìn)行調(diào)整,并重新驗(yàn)證。使用時(shí)，應(yīng)保證濾膜在過(guò)濾前后的完整性

20、。,水溶性液體供試品,水溶性供試液過(guò)濾前應(yīng)先將少量的沖洗液過(guò)濾，以潤(rùn)濕濾膜。 取規(guī)定量，直接過(guò)濾，或混合至含不少于 100ml 適宜稀釋液的無(wú)菌容器中，混勻，立即過(guò)濾。,七、9202 非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查指導(dǎo)原則,為更好應(yīng)用非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法（通則1105）、非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法（通則1106）及非無(wú)菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)（通則1107），特制定本指導(dǎo)原則,供試液制備方法、抑菌成分的消除方法及需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法應(yīng)盡量選擇微生物計(jì)數(shù)方法中操作簡(jiǎn)便、快速的方法，同時(shí)，所選用的方法應(yīng)避免損傷供試品中污染的微生物。 對(duì)照培養(yǎng)基由中國(guó)食品藥品檢定

21、研究院研制及分發(fā)。 控制菌檢查法沒(méi)有規(guī)定進(jìn)一步確證疑似致病菌的方法。若供試品檢出疑似致病菌，確證的方法應(yīng)選擇已被認(rèn)可的菌種鑒定方法，如細(xì)菌鑒定一般依據(jù)伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)。 藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)中，藥用原料、輔料及中藥提取物僅規(guī)定檢查需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)。因此，在制定其微生物限度標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，應(yīng)根據(jù)原輔料的微生物污染特性、用途、相應(yīng)制劑的生產(chǎn)工藝及特性等因素，還需控制具有潛在危害的致病菌。,八、1105 非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法,微生物計(jì)數(shù)法系用于能在有氧條件下生長(zhǎng)的嗜溫細(xì)菌和真菌的計(jì)數(shù)。 當(dāng)本法用于檢查非無(wú)菌制劑及其原、輔料等是否符合相應(yīng)的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，應(yīng)按下述規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)

22、，包括樣品的取樣量和結(jié)果的判斷等。除另有規(guī)定外，本法不適用于活菌制劑的檢查。 微生物計(jì)數(shù)試驗(yàn)環(huán)境應(yīng)符合微生物限度檢查的要求。檢驗(yàn)全過(guò)程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流空氣區(qū)域、工作臺(tái)面及環(huán)境應(yīng)定期進(jìn)行監(jiān)測(cè)。 如供試品有抗菌活性，應(yīng)盡可能去除或中和。供試品檢查時(shí)，若使用了中和劑或滅活劑，應(yīng)確認(rèn)其有效性及對(duì)微生物無(wú)毒性。 供試液制備時(shí)如果使用了表面活性劑，應(yīng)確認(rèn)其對(duì)微生物無(wú)毒性以及與所使用中和劑或滅活劑的相容性。,計(jì)數(shù)方法,計(jì)數(shù)方法包括平皿法、薄膜過(guò)濾法和最可能數(shù)法（Most-Probable-Number Method，簡(jiǎn)稱MPN法。MPN法用

23、于微生物計(jì)數(shù)時(shí)精確度較差，但對(duì)于某些微生物污染量很小的供試品，MPN法可能是更適合的方法。,供試品微生物計(jì)數(shù)中所使用的培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行適用性檢查。 供試品微生物計(jì)數(shù)方法應(yīng)進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)，以確認(rèn)所采用的方法適合于該產(chǎn)品的微生物計(jì)數(shù)。 若檢驗(yàn)程序或產(chǎn)品發(fā)生變化可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)，計(jì)數(shù)方法應(yīng)重新進(jìn)行適用性試驗(yàn)。,供試品檢查,檢驗(yàn)量： 一般應(yīng)隨機(jī)抽取不少于2個(gè)最小包裝的供試品，混合，取規(guī)定量供試品進(jìn)行檢驗(yàn)。 一般供試品的檢驗(yàn)量為10g或10ml；膜劑為100cm2,按計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的計(jì)數(shù)方法進(jìn)行供試品中需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的測(cè)定。 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基用于測(cè)定需氧

24、菌總數(shù)；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基用于測(cè)定霉菌和酵母菌總數(shù)。 陰性對(duì)照試驗(yàn) 以稀釋液代替供試液進(jìn)行陰性對(duì)照試驗(yàn)，陰性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。如果陰性對(duì)照有菌生長(zhǎng)，應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)查。,結(jié)果判斷,需氧菌總數(shù)是指胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的總菌落數(shù)（包括真菌菌落數(shù)）； 霉菌和酵母菌總數(shù)是指沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的總菌落數(shù)（包括細(xì)菌菌落數(shù)）。 若因沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的細(xì)菌使霉菌和酵母菌的計(jì)數(shù)結(jié)果不符合微生物限度要求，可使用含抗生素（如氯霉素、慶大霉素）的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基或其他選擇性培養(yǎng)基（如玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基）進(jìn)行霉菌和酵母菌總數(shù)測(cè)定。,九、1106 非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法,控制菌

25、檢查法系用于在規(guī)定的試驗(yàn)條件下，檢查供試品中是否存在特定的微生物。 當(dāng)本法用于檢查非無(wú)菌制劑及其原、輔料等是否符合相應(yīng)的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，應(yīng)按下列規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)，包括樣品取樣量和結(jié)果判斷等。 供試品檢出控制菌或其他致病菌時(shí)，按一次檢出結(jié)果為準(zhǔn)，不再?gòu)?fù)試。,供試品檢查,供試品的控制菌檢查應(yīng)按經(jīng)方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方法進(jìn)行。 陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn) 陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)方法同供試品的控制菌檢查，對(duì)照菌的加量應(yīng)不大于100cfu。陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)檢出相應(yīng)的控制菌。 陰性對(duì)照試驗(yàn) 以稀釋劑代替供試液照相應(yīng)控制菌檢查法檢查，陰性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。如果陰性對(duì)照有菌生長(zhǎng)，應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)査。,檢驗(yàn)項(xiàng)目,耐膽鹽革蘭陰性菌（Bile-

26、Tblerant Gram-Negative Bacteria） 大腸埃希菌（Escherichia coli） 沙門菌（Salmonella） 銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa） 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） 梭菌（Clostridia） 白色念珠菌（Candida albicans）,十、1107 非無(wú)菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn),十一、1421 滅菌法,滅菌法系指用適當(dāng)?shù)奈锢砘蚧瘜W(xué)手段將物品中活的微生物殺滅或除去，從而使物品殘存活微生物的概率下降至預(yù)期的無(wú)菌保證水平的方法。本法適用于制劑、原料、輔料及醫(yī)療器械等物品的滅菌。 對(duì)于任何一批滅

27、菌物品而言，絕對(duì)無(wú)菌既無(wú)法保證也無(wú)法用試驗(yàn)來(lái)證實(shí)。一批物品的無(wú)菌特性只能相對(duì)地通過(guò)物品中活微生物的概率低至某個(gè)可接受的水平來(lái)表述，即無(wú)菌保證水平（sterility assurance level，簡(jiǎn)稱 SAL）。實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，滅菌是指將物品中污染微生物的概率下降至預(yù)期的無(wú)菌保證水平。最終滅菌的物品微生物存活概率，即無(wú)菌保證水平不得高于10-6。 滅菌物品的無(wú)菌保證不能依賴于最終產(chǎn)品的無(wú)菌檢驗(yàn)，而是取決于生產(chǎn)過(guò)程中采用合格的滅菌工藝、嚴(yán)格的GMP管理和良好的無(wú)菌保證體系,濕熱滅菌法,該法滅菌能力強(qiáng)，為熱力滅菌中最有效、應(yīng)用最廣泛的滅菌方法。 濕熱滅菌條件的選擇應(yīng)考慮被滅菌物品的熱穩(wěn)定性、熱穿

28、透力、微生物污染程度等因素。濕熱滅菌條件通常采用12115min、12130min或11640min的程序，也可采用其他溫度和時(shí)間參數(shù)，但無(wú)論采用何種滅菌溫度和時(shí)間參數(shù)，都必須證明所采用的滅菌工藝和監(jiān)控措施在日常運(yùn)行過(guò)程中能確保物品滅菌后的SAL10-6。,對(duì)熱穩(wěn)定的物品，滅菌工藝可首選過(guò)度殺滅法，以保證被滅菌物品獲得足夠的無(wú)菌保證值。 采用濕熱滅菌時(shí)，被滅菌物品應(yīng)有適當(dāng)?shù)难b載方式，不能排列過(guò)密，以保證滅菌的有效性和均一性。 濕熱滅菌法應(yīng)確認(rèn)滅菌柜在不同裝載時(shí)可能存在的冷點(diǎn)。當(dāng)用生物指示劑進(jìn)一步確認(rèn)滅菌效果時(shí)，應(yīng)將其置于冷點(diǎn)處。本法常用的生物指示劑為嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子,濕熱滅菌法,干熱滅菌法

29、,干熱滅菌條件一般為（160170）120min以上、（170180）60min以上或25045min以上，也可采用其他溫度和時(shí)間參數(shù)。無(wú)論采用何種滅菌條件，均應(yīng)保證滅菌后的物品的SAL10-6。采用干熱過(guò)度殺滅后的物品一般無(wú)需進(jìn)行滅菌前污染微生物的測(cè)定。25045min的干熱滅菌也可除去無(wú)菌產(chǎn)品包裝容器及有關(guān)生產(chǎn)灌裝用具中的熱原物質(zhì)。 常用的生物指示劑為枯草芽孢桿菌孢子,十二、滅菌用生物指示劑指導(dǎo)原則（新增）,生物指示劑是一種對(duì)特定滅菌程序有確定及穩(wěn)定的耐受性的特殊微生物制成品，可用于滅菌設(shè)備的性能確認(rèn)、特定物品的滅菌工藝研發(fā)及建立、產(chǎn)品滅菌程序的驗(yàn)證、生產(chǎn)過(guò)程滅菌效果的監(jiān)控、滅菌程序的定期

30、再驗(yàn)證、隔離器和無(wú)菌潔凈室滅菌效果的驗(yàn)證評(píng)估等。,生物指示劑的分類 生物指示劑用微生物的基本要求 不同滅菌工藝使用不同的生物指示劑，制備生物指示劑所選用的微生物應(yīng)具備以下特征： （1） 菌種的耐受性應(yīng)大于需滅菌物品中所有可能污染菌的耐受性。 （2） 菌種應(yīng)無(wú)致病性。 （3） 菌株應(yīng)穩(wěn)定，存活期長(zhǎng)，易于保存。 （4） 易于培養(yǎng)。生物指示劑的芽胞含量要在 90%以上 生物指示劑的制備,生物指示劑的應(yīng)用,生物指示劑的性能評(píng)估 接收商品化生物指示劑時(shí)，應(yīng)進(jìn)行微生物純度和形態(tài)的鑒定及測(cè)定微生物數(shù)量。生物指示劑應(yīng)在有效期內(nèi)使用，必要時(shí)應(yīng)重新進(jìn)行耐受性檢查。, 芽胞數(shù)范圍在 1.0 106至 5.0 106

31、。 芽胞數(shù)范圍在 1.0 106至 5.0 107。 芽胞數(shù)范圍在 1.0 105至 5.0 106,用戶應(yīng)科學(xué)的選擇和使用生物指示劑.在滅菌程序的建立、確定、驗(yàn)證和日常監(jiān)控中,需對(duì)滅菌產(chǎn)品（包括其材料和包裝）進(jìn)行全面了解,確保滅菌參數(shù)能達(dá)到所需的 SAL 水平。生物指示劑的初始微生物的數(shù)量、耐受性（菌體耐受性）和放置的位置、方式等情況都會(huì)影響其滅活效果。需通過(guò)實(shí)驗(yàn)室研究確定產(chǎn)品各組成部分是否比產(chǎn)品內(nèi)的溶液或藥品更難滅菌。根據(jù)產(chǎn)品中最難滅菌的部位，制定不同的工藝參數(shù)以確保無(wú)菌保證水平小于 106。,十三、生物指示劑耐受性檢查法指導(dǎo)原則（新增）,本指導(dǎo)原則用于指導(dǎo)生物指示劑的耐受性以及相關(guān)質(zhì)量參

32、數(shù)的測(cè)定，也可用于生產(chǎn)過(guò)程污染微生物的耐受性測(cè)定。,總芽胞計(jì)數(shù): 培養(yǎng)基：胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（芽孢懸液制備）、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（芽孢計(jì)數(shù)） 熱激活 培養(yǎng)和計(jì)數(shù),生物指示劑的總芽胞數(shù)一般為標(biāo)示值的 50%300%。,十四、9203 藥品微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則,藥品微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則用于指導(dǎo)藥品微生物檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制 藥品微生物的檢驗(yàn)結(jié)果受很多因素的影響，如樣品中微生物可能分布不均勻、微生物檢驗(yàn)方法的誤差較大等。因此，在藥品微生物檢驗(yàn)中，為保證檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性，必須使用經(jīng)驗(yàn)證的檢測(cè)方法并嚴(yán)格按照藥品微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則要求進(jìn)行檢驗(yàn)。,藥品微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理指導(dǎo)原

33、則包括以下幾個(gè)方面：人員、培養(yǎng)基、試劑、菌種、環(huán)境、設(shè)備、樣品、檢驗(yàn)方法、污染廢棄物處理、檢測(cè)結(jié)果質(zhì)量保證和檢測(cè)過(guò)程質(zhì)量控制、實(shí)驗(yàn)記錄、結(jié)果的判斷和檢測(cè)報(bào)告、文件等。,1、人員 從事藥品微生物試驗(yàn)工作的人員應(yīng)具備微生物學(xué)或相近專業(yè)知識(shí)的教育背景,2、培養(yǎng)基,微生物實(shí)驗(yàn)室使用的培養(yǎng)基可按處方配制，也可使用按處方生產(chǎn)的符合規(guī)定的脫水培養(yǎng)基。 結(jié)塊或顏色發(fā)生改變的脫水培養(yǎng)基不得使用。 脫水培養(yǎng)基應(yīng)完全溶解于水中，再行分裝與滅菌。 應(yīng)確定每批培養(yǎng)基滅菌后的pH值（冷卻至室溫25測(cè)定）。若培養(yǎng)基處方中未列出pH值的范圍，除非經(jīng)驗(yàn)證表明培養(yǎng)基的pH值允許的變化范圍很寬，否則，pH值的范圍不能超過(guò)規(guī)定值0.

34、2。 自配的培養(yǎng)基應(yīng)標(biāo)記名稱、批號(hào)、配制日期、制備人等信息，并在已驗(yàn)證的條件下貯藏。商品化的成品培養(yǎng)基標(biāo)簽上應(yīng)標(biāo)有名稱、批號(hào)、生產(chǎn)日期、失效期及培養(yǎng)基的有關(guān)特性。 培養(yǎng)基滅菌后不得貯藏在高壓滅菌器中，瓊脂培養(yǎng)基不得在0或0以下存放。,2、培養(yǎng)基,使用過(guò)的培養(yǎng)基（包括失效的培養(yǎng)基）應(yīng)按照國(guó)家污染廢物處理相關(guān)規(guī)定進(jìn)行 實(shí)驗(yàn)室配制或商品化的成品培養(yǎng)基的質(zhì)量依賴于其制備過(guò)程，常規(guī)監(jiān)控項(xiàng)目是pH值、適用性檢查試驗(yàn)，定期的穩(wěn)定性檢查以確定有效期 除藥典附錄另有規(guī)定外，在實(shí)驗(yàn)室中，若采用已驗(yàn)證的配制和滅菌程序制備培養(yǎng)基且過(guò)程受控，那么同一批脫水培養(yǎng)基的適用性檢查試驗(yàn)可只進(jìn)行1次。如果培養(yǎng)基的制備過(guò)程未經(jīng)驗(yàn)證

35、，那么每一滅菌批培養(yǎng)基均要進(jìn)行適用性檢查試驗(yàn)。 用于環(huán)境監(jiān)控的培養(yǎng)基須特別防護(hù)，最好要雙層包裝和終端滅菌，如果不能采用終端滅菌的培養(yǎng)基，那么在使用前應(yīng)進(jìn)行100%的預(yù)培養(yǎng)以防止外來(lái)的污染物帶到環(huán)境中及避免出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。,3、試劑,微生物實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有試劑接收、檢查和貯藏的程序。 實(shí)驗(yàn)室應(yīng)標(biāo)明所有試劑、試液及溶液的名稱、制備依據(jù)、適用性、濃度、效價(jià)、貯藏條件、制備日期、有效期及制備人。,4、菌種,藥品微生物檢驗(yàn)用的試驗(yàn)菌應(yīng)來(lái)自認(rèn)可的國(guó)內(nèi)或國(guó)外菌種保藏機(jī)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)菌株，或使用與標(biāo)準(zhǔn)菌株所有相關(guān)特性等效的可以溯源的商業(yè)派生菌株,5、環(huán)境,微生物限度檢查應(yīng)在不低于D級(jí)背景下的B級(jí)單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行 環(huán)境

36、監(jiān)測(cè)按藥品潔凈實(shí)驗(yàn)室微生物監(jiān)測(cè)和控制指導(dǎo)原則（通則9205）進(jìn)行 所用的消毒劑種類應(yīng)滿足潔凈實(shí)驗(yàn)室相關(guān)要求并定期更換。,6、設(shè)備,儀器設(shè)備應(yīng)有合格證書，實(shí)驗(yàn)室在儀器設(shè)備完成相應(yīng)的檢定、校準(zhǔn)、驗(yàn)證、確認(rèn)其性能，并形成相應(yīng)的操作、維護(hù)和保養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程后方可正式使用，儀器設(shè)備使用和日常監(jiān)控要有記錄。,7、樣品,試驗(yàn)樣品的采集，應(yīng)遵循隨機(jī)抽樣的原則，并在受控條件下進(jìn)行抽樣，須采用無(wú)菌操作技術(shù)進(jìn)行取樣，防止樣品受到微生物污染而導(dǎo)致假陽(yáng)性的結(jié)果 抽樣容器應(yīng)貼有唯一性的標(biāo)識(shí)，注明樣品名稱、批號(hào)、抽樣日期、采樣容器、抽樣人等 如果樣品存在數(shù)量不足、包裝破損、標(biāo)簽缺失、溫度不適等，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)在決定是否檢測(cè)或拒

37、絕接受樣品之前與相關(guān)人員溝通。,8、檢驗(yàn)方法,藥典方法或標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的方法是經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的，當(dāng)進(jìn)行樣品檢驗(yàn)時(shí)，應(yīng)進(jìn)行方法適用性確認(rèn)。 如果檢驗(yàn)方法不是藥典或標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的方法，使用前應(yīng)進(jìn)行替代方法的驗(yàn)證，確認(rèn)其應(yīng)用效果優(yōu)于或等同于藥典方法。替代方法的驗(yàn)證按藥品微生物檢驗(yàn)替代方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則（通則9201）進(jìn)行。,9、結(jié)果的判斷和檢測(cè)報(bào)告,引起微生物污染結(jié)果不符合標(biāo)準(zhǔn)的原因主要有兩個(gè)：試驗(yàn)操作錯(cuò)誤或產(chǎn)生無(wú)效結(jié)果的試驗(yàn)環(huán)境條件；產(chǎn)品本身的微生物污染總數(shù)超過(guò)規(guī)定的限度或檢出控制菌。 異常結(jié)果出現(xiàn)時(shí)，應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)查。偏差調(diào)查時(shí)應(yīng)考慮實(shí)驗(yàn)室環(huán)境、抽樣區(qū)的防護(hù)條件、樣品在該檢驗(yàn)條件下以往檢驗(yàn)的情況、樣品本身具有使

38、微生物存活或繁殖的特性等情況。 如果試驗(yàn)操作被確認(rèn)是引起實(shí)驗(yàn)結(jié)果不符合的原因，那么應(yīng)制定糾正和預(yù)防措施，按照正確的操作方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn),十五、9205 藥品潔凈實(shí)驗(yàn)室微生物監(jiān)測(cè)和控制指導(dǎo)原則（變更）,本指導(dǎo)原則是用于指導(dǎo)藥品微生物檢驗(yàn)用的潔凈室等受控環(huán)境微生物污染情況的監(jiān)測(cè)和控制。 本指導(dǎo)原則包括人員要求、初次使用的潔凈實(shí)驗(yàn)室參數(shù)確認(rèn)、微生物監(jiān)測(cè)方法、監(jiān)測(cè)頻次及監(jiān)測(cè)項(xiàng)目、監(jiān)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)、警戒限和糾偏限、數(shù)據(jù)分析及偏差處理、微生物鑒定和微生物控制。,確認(rèn),初次使用的潔凈實(shí)驗(yàn)室應(yīng)進(jìn)行參數(shù)確認(rèn)，確認(rèn)參數(shù)包括物理參數(shù)、空氣懸浮粒子和微生物。 藥品潔凈實(shí)驗(yàn)室物理參數(shù)的測(cè)試應(yīng)當(dāng)在微生物監(jiān)測(cè)方案實(shí)施之前進(jìn)行。 主要的物理參數(shù)包括高效空氣過(guò)濾器完整性、氣流組織、空氣流速（平均風(fēng)速），換氣次數(shù)、壓差、溫度和相對(duì)濕度等。一般首先在靜態(tài)下測(cè)試，符合要求后再在模擬正常檢測(cè)條件下進(jìn)行測(cè)試