微生物的遺傳與變異課件

1、第八章 微生物的遺傳與變異,遺傳，指生物的上一代將自己的一整套遺傳因子傳遞給下一代的行為或功能，它具有極其穩(wěn)定的特性。 遺傳性：指生物的親代傳遞給其子代一套遺傳信息的特性。 基因型：指生物體所攜帶的全部基因的總稱。 表型：指遺傳特性在一定環(huán)境條件下的具體表現(xiàn)。 變異：指遺傳型的改變，即生物遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)或數(shù)量的改變。 飾變：同樣遺傳型的生物，在不同的外界條件下呈現(xiàn)不同的表型。,微生物與遺傳學(xué)研究：,個(gè)體結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單；營(yíng)養(yǎng)體多為單倍體；易于在成分簡(jiǎn)單的合成培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖；繁殖速度快；易于累積不同的最終代謝產(chǎn)物及中間代謝物；菌落形態(tài)特征的可見性與多樣性；環(huán)境條件對(duì)各個(gè)體作用具有直接性和均一性；易于形成

2、營(yíng)養(yǎng)缺陷型；一般都有相應(yīng)的病毒；存在多種處于進(jìn)化過(guò)程中的原始有性生殖方式等。 研究現(xiàn)代遺傳學(xué)和重要的生物學(xué)基本理論問(wèn)題，微生物是最佳材料和研究對(duì)象。,第一節(jié) 遺傳變異的概念及物質(zhì)基礎(chǔ),一、基本概念 （一）、遺傳型、基因型：某一生物個(gè)體所含有的全部遺傳因子（基因的總和）。 具有某遺傳型的生物只有在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境條件下，通過(guò)自身的代謝和發(fā)育，才能將它具體化，即產(chǎn)生表型。 -代謝-遺傳型+環(huán)境條件-表型-發(fā)育-,（二）、表型：某一生物體所具有的一切外表特征及內(nèi)在特性的總和，是遺傳型在合適環(huán)境下的具體體現(xiàn)。 表型是一種現(xiàn)實(shí)性。,（三）、變異：在某種外因或內(nèi)因的作用下，生物體遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)或數(shù)量的改變，即遺傳

3、型的改變。 變異特點(diǎn)：在群體中以極低的幾率(一般為10-510-10)出現(xiàn)；性狀變化的幅度大；變化后的新性狀是穩(wěn)定和可遺傳的。,（四）、飾變：不涉及遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)改變而只發(fā)生在轉(zhuǎn)錄、翻譯水平上的表型變化。 飾變特點(diǎn)：整個(gè)群體中每一個(gè)體都發(fā)生同樣變化；性狀變化的幅度??；飾變性狀不遺傳。 例如，粘質(zhì)沙雷氏菌25培養(yǎng)，產(chǎn)生深紅色靈桿菌素，把菌落染成鮮血似的(因此過(guò)去稱它為“神靈色桿菌”或“靈桿菌”)；37時(shí)，群體中所有個(gè)體都不產(chǎn)色素。重新降溫至25 ，所有細(xì)胞產(chǎn)色素能力又可以恢復(fù)。,第一節(jié) 微生物遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ),（一）轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) 1944年美國(guó)洛克非勒醫(yī)學(xué)研究所的Avery等人證實(shí)了1928年英國(guó)人

4、Griffith的發(fā)現(xiàn)，并將肺炎鏈球菌S型的DNA成功的轉(zhuǎn)化無(wú)毒性的肺炎球菌R型為有毒的肺炎球菌S型，第一次證明了載有肺炎鏈球菌S型莢膜遺傳信息的物質(zhì)是DNA。,最早進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的是英國(guó)的F. Griffith，他以肺炎鏈球菌作為研究對(duì)象。肺炎鏈球菌可使人患肺炎，也可使小鼠患敗血癥而死亡。 肺炎鏈球菌有許多不同的菌株，有莢膜者是致病性的，它的菌落表面光滑，故稱S型；有的不形成莢膜，無(wú)致病性，菌落外觀粗糙，故稱R型。,Griffith共進(jìn)行了以下幾組實(shí)驗(yàn)： 動(dòng)物試驗(yàn) 細(xì)菌培養(yǎng)試驗(yàn) S型菌的無(wú)細(xì)胞抽提液試驗(yàn),（2）細(xì)菌培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),（3）S型菌的無(wú)細(xì)胞抽提液試驗(yàn),以上實(shí)驗(yàn)說(shuō)明：加熱殺死的S型細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)

5、可能存在一種轉(zhuǎn)化物質(zhì)，它能通過(guò)某種方式進(jìn)入R型細(xì)胞并使R型細(xì)胞獲得穩(wěn)定的遺傳性狀，轉(zhuǎn)變?yōu)镾型細(xì)胞。,熱死S菌不生長(zhǎng)活R菌長(zhǎng)出R菌熱死S菌長(zhǎng)出大量R菌和10-6S菌,活R菌+S菌無(wú)細(xì)胞抽提液長(zhǎng)出大量R菌和少量S菌,+活RII菌,平皿培養(yǎng),加S菌DNA 加S菌DNA及DNA酶以外的酶 加S菌的DNA和DNA酶 加S菌的RNA 加S菌的蛋白質(zhì) 加S菌的莢膜多糖,活R菌,長(zhǎng)出S菌,只有R菌,1944年O.T.Avery、C.M.MacLeod和M。McCarty從熱死S型S. pneumoniae中提純了可能作為轉(zhuǎn)化因子的各種成分，并在離體條件下進(jìn)行了轉(zhuǎn)化試驗(yàn)：,只有S型細(xì)菌的DNA才能將S. pne

6、umoniae的R型轉(zhuǎn)化為S型。且DNA純度越高，轉(zhuǎn)化效率也越高。說(shuō)明S型菌株轉(zhuǎn)移給R型菌株的，是遺傳因子。,實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，加熱殺死的S型細(xì)菌，在其細(xì)胞內(nèi)可能存在一種轉(zhuǎn)化物質(zhì)，它能通過(guò)某種方式進(jìn)入R型細(xì)胞，并使R型細(xì)胞獲得穩(wěn)定的遺傳性狀。,Griffith的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn),（二）噬菌體的感染實(shí)驗(yàn) 1953年美國(guó)人Hershey和Chase用放射性同位素方法，提供了DNA是噬菌體遺傳物質(zhì)的直接證據(jù)。他們用含32P和35S的培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌H，再用被標(biāo)記的大腸桿菌培養(yǎng)2噬菌體，直至完全標(biāo)記上32P和35S的T2噬菌體為止。用標(biāo)記的T2噬菌體侵染沒有標(biāo)記的大腸桿菌，結(jié)果表明，2噬菌體外殼蛋白中有35S放射性

7、并與細(xì)菌的細(xì)胞壁連接，而DNA部分則有32P放射性并進(jìn)如細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)中。這一事實(shí)說(shuō)明，在噬菌體侵染細(xì)菌過(guò)程中蛋白質(zhì)外殼留在細(xì)菌細(xì)胞外，只有DNA進(jìn)入了細(xì)胞，又一次證明遺傳物質(zhì)是DNA，而不是蛋白質(zhì)。,噬菌體感染實(shí)驗(yàn),A. D. Hershey和M. Chase， 1952年,（1）含32P-DNA的一組：放射性85%在沉淀中,上清液中含 15%放射性,沉淀中含 85%放射性,沉淀中含 25%放射性,以32S標(biāo)記蛋白質(zhì)外殼做噬菌體感染實(shí)驗(yàn),（2）含35S-蛋白質(zhì)的一組：放射性75%在上清液中,上清液中含 75%放射性,噬菌體DNA 在宿主細(xì)胞內(nèi)能產(chǎn)生噬菌體后代，這些T2噬菌體后代的蛋白質(zhì)外殼的組

8、成、形狀大小等特性均與留在細(xì)胞外的蛋白質(zhì)外殼一模一樣。 說(shuō)明決定蛋白質(zhì)外殼的遺傳信息是在DNA上，DNA攜帶有T2的全部遺傳信息。,T2噬菌體的感染實(shí)驗(yàn),（三）病毒拆開和重建實(shí)驗(yàn) 通過(guò)FraenbkelConrat等在植物病毒領(lǐng)域中的著名實(shí)驗(yàn)，證明RNA是煙草花葉病毒的遺傳物質(zhì)。,（三）植物病毒的重建實(shí)驗(yàn),為了證明核酸是遺傳物質(zhì)，H. Fraenkel-Conrat（1956）用含RNA的煙草花葉病毒（TMV）進(jìn)行了著名的植物病毒重建實(shí)驗(yàn)。 將TMV在一定濃度的苯酚溶液中振蕩，就能將其蛋白質(zhì)外殼與RNA核心相分離。分離后的RNA在沒有蛋白質(zhì)包裹的情況下，也能感染煙草并使其患典型癥狀，而且在病斑

9、中還能分離出正常病毒粒子。,選用TMV和霍氏車前花葉病毒（HRV），分別拆分取得各自的RNA和蛋白質(zhì)，將兩種RNA分別與對(duì)方的蛋白質(zhì)外殼重建形成兩種雜合病毒：,（1）RNA（TMV） 蛋白質(zhì)（HRV） （2）RNA（HRV） 蛋白質(zhì)（TMV）,MTV HRV,HRV MTV,RNA作為遺傳物質(zhì),植物病毒的重建實(shí)驗(yàn),用兩種雜合病毒感染寄主： （1）表現(xiàn)TMV的典型癥狀病分離到正常TMV粒子 （2）表現(xiàn)HRV的典型癥狀病分離到正常HRV粒子。 上述結(jié)果說(shuō)明，在RNA病毒中，遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)也是核酸。,遺傳物質(zhì)在細(xì)胞中的存在方式,（一）、細(xì)胞水平：核或核質(zhì)體 （二）、細(xì)胞核水平：核內(nèi)染色體(核基因組)

10、，核外染色體（真核質(zhì)粒、質(zhì)體線粒體、葉綠體；原核質(zhì)粒：F因子性因子、R因子抗性因子、Col質(zhì)粒產(chǎn)大腸桿菌素因子、Ti質(zhì)粒誘癌、巨大質(zhì)粒固氮、降解性質(zhì)粒降解復(fù)雜物質(zhì)） （三）、染色體水平 ：數(shù)目，倍數(shù) （四）、核酸水平：DNA，RNA,三、遺傳物質(zhì)在細(xì)胞中的存在方式,（五）、基因水平 ：具有特定核苷酸順序的核酸片段，具有自主復(fù)制能力的最小遺傳功能單位。相對(duì)分子量約為6.7105Da，1000-1500bp( 堿基對(duì))，每個(gè)細(xì)菌一般含有5，00010，000個(gè)基因。,三、遺傳物質(zhì)在細(xì)胞中的存在方式,（六）、密碼子水平：決定3個(gè)核苷酸順序（AA）的片斷，遺傳的信息單位。 43=642023，出現(xiàn)一種

11、以上密碼子編碼同一種氨基酸的現(xiàn)象。有些被用作“起讀”(AUG)或“終止”信號(hào)(UAA、UGA和UAG)。 （七）、核苷酸、堿基水平：最低突變單位或交換單位（A、G、T、C）。,三、遺傳物質(zhì)在細(xì)胞中的存在方式,原核生物的基因調(diào)控系統(tǒng)是由操縱子（啟動(dòng)基因、操縱基因、結(jié)構(gòu)基因）和調(diào)節(jié)基因組成。 結(jié)構(gòu)基因決定多肽(酶及結(jié)構(gòu)蛋白)的合成，操縱基因與結(jié)構(gòu)基因緊密連鎖在一起的，控制結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的開放或關(guān)閉。啟動(dòng)基因是轉(zhuǎn)錄起始部位。 調(diào)節(jié)基因一般與操縱子有一定間隔距離(一般小于100個(gè)堿基)，調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)基因的活動(dòng)。,三、遺傳物質(zhì)在細(xì)胞中的存在方式,順序：?jiǎn)?dòng)基因操縱基因結(jié)構(gòu)基調(diào)節(jié)基因 關(guān)閉轉(zhuǎn)錄：調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄出自

12、己的mRNA,經(jīng)翻譯產(chǎn)生阻遏蛋白,識(shí)別并附著在操縱基因上，相互作用使DNA雙鏈無(wú)法分開，阻擋RNA聚合酶沿著結(jié)構(gòu)基因移動(dòng)。 啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄：阻遏蛋白從操縱基因上解除；依賴于DNA的RNA多聚酶附著在啟動(dòng)基因上，通過(guò)操縱基因，沿著結(jié)構(gòu)基因移動(dòng)，轉(zhuǎn)錄mRNA。,三、遺傳物質(zhì)在細(xì)胞中的存在方式,真核生物的基因：沒有操縱子結(jié)構(gòu)，存在不編碼序列和重復(fù)序列，轉(zhuǎn)錄與翻譯有空間分隔，基因之間被許多無(wú)編碼功能的內(nèi)含子阻隔。,原核生物的質(zhì)粒,cccDNA：游離于染色體外，具有獨(dú)立復(fù)制能力的小型共價(jià)閉合環(huán)狀DNA分子。1984，天藍(lán)色鏈霉菌等，發(fā)現(xiàn)線形質(zhì)粒。 某些質(zhì)粒具有與核染色體整合和脫離的功能，如F因子，稱“附加體”

13、。 分子量一般在106108Da，大小約為1%核基因組。攜帶染色體上沒有的基因，賦予某些特殊功能，例如接合、產(chǎn)毒、抗藥、固氮、產(chǎn)特殊酶或降解有毒物質(zhì)等。 質(zhì)粒消失不會(huì)造成菌體死亡 。,四、原核生物的質(zhì)粒,質(zhì)粒復(fù)制與核染色體同步，稱“嚴(yán)緊型復(fù)制控制”，細(xì)胞一般含12個(gè)質(zhì)粒；不同步，稱“松弛型復(fù)制控制”，一般含1015個(gè)或更多。 質(zhì)粒之間及質(zhì)粒與核染色體之間可以發(fā)生重組。 少數(shù)質(zhì)?？梢栽诓煌觊g發(fā)生轉(zhuǎn)移，如F、R等。 遇吖啶類染料、絲裂霉素C、紫外線、利福平、重金屬離子或高溫等因素，可使子代細(xì)胞中質(zhì)粒消失。,四、原核生物的質(zhì)粒,（一）、F因子、致育因子或性因子：E.coli等細(xì)菌中決定性別。約等

14、于2%核染色體DNA的小型cccDNA。分子量為6.2107Da，94.5kb（千堿基對(duì)），其中有1/3的基因與接合作用有關(guān)。,四、原核生物的質(zhì)粒,（二）、R因子、R質(zhì)粒： 多數(shù)由相連的兩個(gè)DNA片段組成。其一稱RTF質(zhì)粒(抗性轉(zhuǎn)移因子)，含有調(diào)節(jié)DNA復(fù)制和拷貝數(shù)的基因及轉(zhuǎn)移基因，有時(shí)還有四環(huán)素抗性基因。11106Da。其二為r質(zhì)粒（抗性決定質(zhì)粒），幾百萬(wàn)至100106Da以上。含其他抗生素的抗性基因，例如抗青霉素、安比西林、氯霉素、鏈霉素、卡那霉素和磺胺等基因。,一種可通過(guò)接合而轉(zhuǎn)移的R因子的形成(IS因子是轉(zhuǎn)座因子，可使RTF質(zhì)粒和r決定質(zhì)粒結(jié)合),四、原核生物的質(zhì)粒,（三）、Col因子

15、、產(chǎn)大腸桿菌素因子。大腸桿菌素是E.coli某些菌株分泌的細(xì)菌毒素，具有通過(guò)抑制復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯或能量代謝等，專一地殺死其他腸道細(xì)菌的功能。約48104Da。 攜帶Col因子的菌株，由于質(zhì)粒本身編碼一種免疫蛋白，從而對(duì)大腸桿菌素有免疫作用，不受其傷害。,四、原核生物的質(zhì)粒,（四）、Ti質(zhì)粒、誘癌質(zhì)粒：大型，長(zhǎng)200kb。 根癌土壤桿菌侵入到雙子葉植物細(xì)胞中，Ti質(zhì)粒片段與植物細(xì)胞核染色體組發(fā)生整合，破壞控制細(xì)胞分裂的激素調(diào)節(jié)系統(tǒng)，轉(zhuǎn)變成癌細(xì)胞。 植物遺傳工程研究的重要載體。外源基因可借DNA重組技術(shù)插入到Ti質(zhì)粒中，進(jìn)一步整合到植物染色體上，改變遺傳性，培育優(yōu)良品種。,四、原核生物的質(zhì)粒,（五

16、）、巨大質(zhì)粒：200300106Da，比一般質(zhì)粒大幾十倍至幾百倍。 根瘤菌屬中發(fā)現(xiàn)，具有一系列固氮基因。,四、原核生物的質(zhì)粒,（六）、降解性質(zhì)粒：可編碼降解復(fù)雜物質(zhì)的酶，利用一般細(xì)菌難以分解的物質(zhì)作碳源。如CAM(樟腦)質(zhì)粒，OCT(辛烷)質(zhì)粒，XYL(二甲苯)質(zhì)粒，SAL(水楊酸)質(zhì)粒，MDL(扁桃酸)質(zhì)粒，NAP(萘)質(zhì)粒和TOL(甲苯)質(zhì)粒等。 僅在假單胞菌屬中發(fā)現(xiàn)。,第二節(jié) 微生物突變 突變（mutation）指遺傳物質(zhì)-核酸（DNA或RNA）中的核苷酸順序突然發(fā)生了穩(wěn)定的可遺傳的變化。突變包含基因突變和染色體畸變，基因突變是由于DNA鏈上的一對(duì)或少數(shù)幾對(duì)堿基發(fā)生改變而引起的。,（一）

17、基因突變類型,按內(nèi)部結(jié)構(gòu)： 1、基因突變（點(diǎn)突變）：一對(duì)或少數(shù)幾對(duì)堿基發(fā)生改變。 2、染色體畸變：DNA的大段變化(損傷)，表現(xiàn)為插入、缺失、重復(fù)、易位和倒位。 按表型特征： 1、形態(tài)突變型：細(xì)胞或菌落形態(tài)改變。 2、生化突變型-代謝途徑發(fā)生變異而形態(tài)沒有明顯變化。分營(yíng)養(yǎng)缺陷型、抗性突變型和抗原突變型。,（一）基因突變類型,A、營(yíng)養(yǎng)缺陷型：基因突變引起代謝過(guò)程中某種酶的合成能力喪失，必須在原有培養(yǎng)基中添加細(xì)胞不能合成的營(yíng)養(yǎng)成分才能正常生長(zhǎng)。 B、抗性突變型：能抵抗有害理化因素，分抗藥性、抗紫外線或抗噬菌體等。 C、抗原突變型-細(xì)胞成分尤其是細(xì)胞表面成分(細(xì)胞壁、莢膜、鞭毛)的細(xì)微改變而引起抗原

18、性變化。,（一）基因突變類型,3、致死突變型-基因突變導(dǎo)致個(gè)體死亡。 A、條件致死突變型：突變后，在某種條件下可正常生長(zhǎng)、繁殖并實(shí)現(xiàn)其表型，而在另一條件下卻無(wú)法生長(zhǎng)、繁殖。例如，E.coli的某些菌株可在37下正常生長(zhǎng)，不能在42下生長(zhǎng)等。 B、其他突變型：如毒力、糖發(fā)酵能力、代謝產(chǎn)物的種類和產(chǎn)量以及對(duì)某種藥物的依賴性等。,（一）基因突變類型,按分離： 1、選擇性突變：具有選擇性標(biāo)記，可通過(guò)某種環(huán)境條件使它們得到優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng),從而取代原始菌株。如營(yíng)養(yǎng)缺陷型或抗性突變型等。 2、非選擇性突變：沒有選擇性標(biāo)記，只有一些性狀的數(shù)量差別。例如菌落大小、顏色深淺及代謝產(chǎn)物量的多少等。,基因突變的一般特性,1

19、、非對(duì)應(yīng)性：突變的發(fā)生與環(huán)境因子無(wú)對(duì)應(yīng)性。 2、稀有性：自發(fā)突變的頻率（突變率）很低，一般在10-610-10。 3、規(guī)律性：特定微生物的某一特定性狀的突變率具有一定的規(guī)律性。,基因突變的一般特性,4、獨(dú)立性：引起各種性狀改變的基因突變彼此是獨(dú)立的。 5、穩(wěn)定性：突變是遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變，因此是可以穩(wěn)定遺傳的。 6、回復(fù)性：同樣的原因也可以導(dǎo)致突變的回復(fù)，使表型回復(fù)到野生型狀態(tài)。 6、可誘變性：通過(guò)理化因子等誘變劑的誘變作用可提高自發(fā)突變的頻率，但不改變突變的本質(zhì)。,一、基因突變的自發(fā)性和突變結(jié)果與原因不對(duì)應(yīng)性的證明 人們通常認(rèn)為，某種細(xì)菌從對(duì)藥物敏感到產(chǎn)生抗性是由于藥物長(zhǎng)期作用于細(xì)菌的結(jié)果，

20、但實(shí)際上，對(duì)藥物的這種抗性突變與接觸藥物無(wú)關(guān)，即突變的性狀與引起突變的原因間無(wú)直接的對(duì)應(yīng)關(guān)系。后來(lái)，人們通過(guò)幾個(gè)嚴(yán)密的科學(xué)實(shí)驗(yàn)后終于證明，在接觸抗性因子之前便已出現(xiàn)了抗性菌落。最著名的實(shí)驗(yàn)有：變量試驗(yàn)、涂布試驗(yàn)、影印培養(yǎng)試驗(yàn),（一）變量試驗(yàn) 1943年，魯里亞（S.E.Luria）和德爾波留克（M.Delbruck）首先設(shè)計(jì)。其要點(diǎn)是：先將大腸桿菌液分成等量的兩部分。一部分裝在大試管里，另一部分裝在50支小試管里，將大小試管里的大腸桿菌放在恒溫箱里培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)24到60小時(shí)后分別接種到固體培養(yǎng)基上。一只大試管分接50副培養(yǎng)皿，而50支小試管，每支接一副培養(yǎng)皿。每皿固體培養(yǎng)基里有等量的噬菌體，能生

21、長(zhǎng)的大腸桿菌是抗噬菌體的突變體。所得結(jié)果是，從一支大試管里長(zhǎng)出來(lái)的菌落，也就是抗噬菌體的數(shù)量比較一致，即使有差異，也僅僅是實(shí)驗(yàn)上的誤差。而由50支小試管長(zhǎng)出來(lái)的抗噬菌體菌落，在數(shù)量上的差異較大。這說(shuō)明抗噬菌體突變體是在接觸噬菌體前在一次細(xì)胞分裂過(guò)程中隨機(jī)自發(fā)產(chǎn)生的。這一自發(fā)突變發(fā)生得越早，則抗噬菌體菌落出現(xiàn)得越多，反之越少。抗噬菌體突變體的出現(xiàn)與是否接觸噬菌體無(wú)關(guān)。,（二）涂布試驗(yàn) 1949年Newcombe設(shè)計(jì)的試驗(yàn)，其要點(diǎn)：在12個(gè)平板上涂上數(shù)目相等的敏感于T1噬菌體的大腸桿菌，經(jīng)5小時(shí)的培養(yǎng)，在皿上長(zhǎng)出大量的微菌落，取其中6皿直接噴上T1噬菌體，另6皿則先用滅菌玻棒把微菌落重新均勻涂布一

22、次后同樣噴上等量的T1噬菌體，培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，涂布過(guò)的一組有抗性菌落353個(gè)，比未涂布過(guò)的（僅28個(gè)菌落）高得多。這說(shuō)明該抗性突變發(fā)生在未接觸噬菌體前，噬菌體的加入不是誘導(dǎo)突變的因素。,（三）影印培養(yǎng)試驗(yàn) 所謂影印培養(yǎng)法，實(shí)質(zhì)上是使在一系列培養(yǎng)皿的相同位置上能出現(xiàn)相同菌落的一種接種培養(yǎng)方法。1952年J.Lederberg夫婦首先進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，是通過(guò)使菌不接觸抗性環(huán)境而檢查其抗性菌落出現(xiàn)的方法來(lái)證明的。方法要點(diǎn)是：包有滅菌絲絨布的木質(zhì)圓柱（直徑略小于培養(yǎng)皿底）為印章，用不具抗性環(huán)境（如不加抗生素等）的完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，以印章輕輕粘取菌落，然后再一一接種到不同的選擇培養(yǎng)基（如含有不同抗生素等）上，培

23、養(yǎng)后，對(duì)各培養(yǎng)皿相同位置上的菌落作比較，便可選出相應(yīng)的突變型菌落。,影印接種法,二、自發(fā)突變 自發(fā)突變：指微生物在沒有人工參與下所發(fā)生的突變。 自發(fā)突變可能的機(jī)制： （一）背景輻射和環(huán)境因素的誘變 例如：充滿宇宙空間的各種短波輻射、高溫的誘變效應(yīng)以及自然界中存在的誘變物質(zhì)的作用。由于長(zhǎng)期受到原因不詳?shù)恼T變因素的綜合效應(yīng)，便發(fā)生自發(fā)突變。 （二）微生物的代謝產(chǎn)物的誘變 通常存在于細(xì)胞內(nèi)的天然物質(zhì)，如：過(guò)氧化氫、咖啡堿、硫氰化合物、二硫化二丙烯、重氮絲氨酸等。它們既是微生物的代謝產(chǎn)物，又可以引起微生物的自發(fā)誘變。 （三）環(huán)出效應(yīng) 在DNA復(fù)制的過(guò)程中，如果其中某一單鏈上偶爾產(chǎn)生一小環(huán)，則會(huì)因其上的

24、基因越過(guò)復(fù)制而發(fā)生遺傳缺失，從而造成自發(fā)突變。,誘發(fā)基因突變的因素,紫外線、電離輻射（X線、 線和快中子等） 羥胺、亞硝酸或含亞硝酸化合物 烷化劑（甲醛、氯乙烯、氮芥等） 堿基類似物：以假亂真， 5-溴尿嘧啶（5-BU）、2-氨基嘌呤（2-AP） 造成DNA增加或減少一、二個(gè)堿基：丫啶類染料，氮芥類衍生物等。,病毒等生物因素,如麻疹病毒、流感病毒、皰疹病毒等，是誘發(fā)突變的明顯因素。,三、誘發(fā)突變 （一）物理因素的突變 1.紫外線 紫外線的大劑量作用可導(dǎo)致菌體死亡，小劑量則可引起突變。其主要生物學(xué)效應(yīng)是其對(duì)DNA的作用。其中主要機(jī)制是胸腺嘧啶二聚體的形成，它可在同一條鏈或兩條鏈上發(fā)生。但發(fā)現(xiàn)形成

25、的復(fù)合物暴露在可見光下，會(huì)使胸腺嘧啶二聚體重新解聚成為單體，此過(guò)程稱為光復(fù)活作用。在紫外線照射進(jìn)行誘變育種工作時(shí)，必須在紅光下進(jìn)行處理或操作，并在黑暗條件下培養(yǎng)，以免發(fā)生光復(fù)活作用。,2.X射線和射線 X射線和射線是不帶電的光量子，不能直接引起物質(zhì)電離，但在與原子或分子碰撞時(shí)，能把全部能量或部分能量傳給原子而產(chǎn)生次級(jí)電子，這些次級(jí)電子具有很高的能量，使產(chǎn)生電離作用，從而直接或間接的改變DNA的結(jié)構(gòu)。其直接效應(yīng)是使堿基間、DNA間、糖與磷酸間相接的化學(xué)鍵斷裂；間接效應(yīng)是，電離作用引起水或有機(jī)分子產(chǎn)生自由基作用于DNA分子，導(dǎo)致缺失或損傷。,（二）化學(xué)因素的誘變 1.堿基結(jié)構(gòu)類似物 這是一類與正常

26、堿基結(jié)構(gòu)（A、T、C、G）相似的物質(zhì)，如5-溴尿嘧啶（5-BU）、5-脫氧尿嘧啶（5-dU）、8-氮鳥嘌呤（8-NG）、2-氨基嘌呤等，它們能摻入DNA分子中而不妨礙DNA的正常復(fù)制，但其發(fā)生的錯(cuò)誤配對(duì)便可引起堿基對(duì)的置換，出現(xiàn)突變。這類代謝類似物只有對(duì)正常進(jìn)行新陳代謝和繁殖著的微生物才起作用，而對(duì)休止細(xì)胞，游離的噬菌體粒子或離體的DNA分子卻不起作用。,2.與核酸上堿基起化學(xué)反應(yīng)的誘變劑 有些化合物能與DNA分子的某些基團(tuán)起化學(xué)反應(yīng)，如亞硝酸可使堿基脫氨，脫去的氨基被羥基取代，從而使A、G、C分別轉(zhuǎn)變成H（次黃嘌呤）、X（黃嘌呤）、U（尿嘧啶），復(fù)制時(shí)它們便與C、G、A配對(duì)。,3.移碼誘變

27、吖啶類化合物,如原黃素、吖啶橙、吖啶黃、a-氨基吖啶等是一類染料，具有扁平結(jié)構(gòu)，能插入到DNA分子的堿基對(duì)之間，使DNA結(jié)構(gòu)變形，在復(fù)制時(shí)產(chǎn)生不對(duì)稱交換，從而引起在DNA鏈中插入或缺失一個(gè)或幾個(gè)核苷酸，造成這一對(duì)核苷酸以后所有密碼發(fā)生移動(dòng)，產(chǎn)生移碼突變。,移碼突變,移碼突變：由于DNA序列中發(fā)生1-2個(gè)核苷酸的缺失或插入，使翻譯的閱讀框發(fā)生改變，從而導(dǎo)致從改變位置以后的氨基酸序列的完全變化。,同義突變,同義突變：這是指某個(gè)堿基的變化沒有改變產(chǎn)物氨基酸序列的密碼子變化，顯然，這是與密碼子的簡(jiǎn)并性相關(guān)的。,錯(cuò)義突變,錯(cuò)義突變：是指堿基序列的改變引起了產(chǎn)物氨基酸的改變。有些錯(cuò)義突變嚴(yán)重影響到蛋白質(zhì)活

28、性甚至使之完全無(wú)活性，從而影響了表型。如果該基因是必需基因，則該突變?yōu)橹滤劳蛔儭?鐮形細(xì)胞貧血,該病呈不完全顯性遺傳。由于鏈第6位谷氨酸被纈氨酸所取代，即轉(zhuǎn)錄的mRNA密碼由 GAG(谷氨酸)變成 GUG(纈氨酸)，形成鐮形細(xì)胞血紅蛋白HbS ，HbS比正常血紅蛋白HbA溶解性小，在脫氧狀態(tài)下結(jié)晶出來(lái)，形成小桿狀，使紅細(xì)胞變得僵硬，呈鐮刀狀改變。,鐮形細(xì)胞不能通過(guò)小動(dòng)脈和毛細(xì)血管，使小血管堵塞，引起局部組織的缺氧，繼發(fā)感染，一過(guò)性劇痛，急性大面積組織損傷，心肌梗死。 鐮形細(xì)胞的變形性降低還可引起溶血性貧血。HbS純合子表現(xiàn)為鐮形細(xì)胞貧血，雜合子HbAHbS僅表現(xiàn)鐮形細(xì)胞性狀，多數(shù)無(wú)癥狀，但也可

29、有輕度慢性貧血。,鐮形細(xì)胞貧血,終止密碼突變,DNA分子中的某個(gè)終止密碼突變?yōu)榫幋a氨基酸的密碼，從而使多肽鏈的合成仍繼續(xù)下去，直至下一個(gè)終止密碼為止，形成超長(zhǎng)的異常多肽鏈。,無(wú)義突變,無(wú)義突變：是指某個(gè)堿基的改變，使代表某種氨基酸的密碼子變?yōu)榈鞍踪|(zhì)合成的終止密碼子（UAA，UAG，UGA）。蛋白質(zhì)合成提前終止，產(chǎn)生截短的蛋白質(zhì)。,表型突變,營(yíng)養(yǎng)缺陷型 抗藥性突變型 條件致死突變型 形態(tài)突變型,營(yíng)養(yǎng)缺陷型,一種缺乏合成其生存所必須的營(yíng)養(yǎng)物的突變型，只有從周圍環(huán)境或培養(yǎng)基中獲得這些營(yíng)養(yǎng)或其前體物才能生長(zhǎng)。 基因型：hisC、tryA。表現(xiàn)型： HisC、TryA。 hisC、tryA 。 hisC

30、+、tryA+ 。,抗藥性突變型,由于基因突變使菌株對(duì)某種或某幾種藥物，特別是抗生素，產(chǎn)生抗性的一種突變型，普遍存在于各類細(xì)菌中，也是用來(lái)篩選重組子和進(jìn)行其他遺傳學(xué)研究的重要下選擇標(biāo)記。 Strr、 strs。,條件致死突變型,是指在某一條件下具有致死效應(yīng)，而在另一條件下沒有致死效應(yīng)的突變菌型。 常用的條件致死突變是溫度敏感突變，用ts表示。在42致死、2530 能生長(zhǎng)。 影印法篩選。,形態(tài)突變型,是指造成形態(tài)改變的突變型，包括影響細(xì)胞和菌落形態(tài)、顏色以及影響噬菌體的噬菌斑形態(tài)的突變型，這是一類非選擇性突變，形態(tài)突變和非形態(tài)突變均同樣生長(zhǎng)在平板上，只能靠看得見的形態(tài)變化進(jìn)行篩選。其中以顏色變化

31、較易篩選。,DNA損傷修復(fù),由理化因子造成的DNA損傷是可以修復(fù)的，受損傷DNA和遺傳信息可以從未受傷的互補(bǔ)鏈獲得。 DNA損傷修復(fù)：是在細(xì)胞中多種酶的共同作用下，使DNA受到損傷的結(jié)構(gòu)大部分得以恢復(fù)，降低了突變率，保持了DNA分子的相對(duì)穩(wěn)定性。,修復(fù)方式,光復(fù)活 切除修復(fù) 重組修復(fù),光復(fù)活,紫外光對(duì)DNA的損傷，其主要作用是使同鏈DNA的相鄰嘧啶間形成氫鍵的作用，并引起雙鏈結(jié)構(gòu)扭曲變形，阻礙堿基間的正常配對(duì)，從而有可能引起突變或死亡。 光復(fù)活：在可見光下，生物體的光復(fù)活酶激活，能識(shí)別并作用于嘧啶二聚體，將它分解為單體狀態(tài)，使DNA的構(gòu)型恢復(fù)正常。這是生物體普遍存在的功能。,切除修復(fù),主要過(guò)程

32、： 首先由核酸內(nèi)切酶識(shí)別DNA損傷部位，并在5端作一切口中，再在外切酶的作用下從5 3端方向切除損傷DNA片段，然后在DNA聚合酶的作用下以損傷處相對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)鏈為模板合成新的DNA單鏈片段來(lái)填補(bǔ)切除后的空隙，最后在連接酶作用下將新合成的單鏈片段與原有的單鏈以3、 5磷酸二酯鍵相連接完成修復(fù)過(guò)程 。,切除修復(fù)功能廣泛存在于原核生物和真核生物 中，也是人類細(xì)胞中DNA損傷修復(fù)的主要方式之一。,切除修復(fù),重組修復(fù) 旁路修復(fù),通過(guò)細(xì)胞間期DNA合成期來(lái)修復(fù)損傷。,重組修復(fù)的過(guò)程,復(fù)制：越過(guò)損傷部位復(fù)制。而在有損傷的DNA的對(duì)應(yīng)處留下缺口。 重組：在DNA損傷誘導(dǎo)產(chǎn)生的重組蛋白作用下，完整的母鏈與有缺口

33、的子鏈重組，缺口由母鏈來(lái)的核苷酸片段彌補(bǔ)。 再合成：重組后，母鏈中的缺口通過(guò)DNA多聚酶的作用，合成核酸片段，然后由連接酶使新片段與舊鏈連接，至此重組修復(fù)完成。,重組修復(fù)不能除去受損傷的DNA，但保證了DNA復(fù)制的進(jìn)行。若干代以后，損傷的DNA鏈逐漸(稀釋)，最后無(wú)損于正常生理功能，損傷也就得到了修復(fù)。,重組修復(fù),四、誘變育種 誘變育種是指通過(guò)人工方法處理微生物，使之發(fā)生突變，并運(yùn)用合理的篩選程序和方法，把適合人類需要的優(yōu)良菌株選育出來(lái)的過(guò)程。,第三節(jié) 基因重組 把兩個(gè)不同性狀的個(gè)體內(nèi)的遺傳基因轉(zhuǎn)移到一起，經(jīng)過(guò)遺傳分子的重新組合，形成新遺傳型個(gè)體的方式，稱為基因重組（gene recombin

34、ation）。 原核微生物的基因重組方式主要有轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合等形式。,一、轉(zhuǎn)化（transformation） 受體菌直接吸收了來(lái)自供體菌的DNA片段，通過(guò)交換，把它組合到自己的基因組中，從而獲得了供體菌的部分遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為轉(zhuǎn)化（transformation)。轉(zhuǎn)化后的受體菌，就稱轉(zhuǎn)化子（transformant）。 受體菌：只有處于感受態(tài)的細(xì)菌才能吸收外源DNA實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。細(xì)菌的感受態(tài)是一種生理狀態(tài)，它可以通過(guò)感受態(tài)因子，一種蛋白質(zhì)因子在細(xì)胞間的轉(zhuǎn)移而獲得；也可由某些生長(zhǎng)條件誘導(dǎo)而成，如受體菌由豐富培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到貧瘠培養(yǎng)基時(shí)約15%的枯草桿菌進(jìn)入感受態(tài)。也與培養(yǎng)時(shí)間有關(guān)，如肺炎球菌的感受

35、態(tài)出現(xiàn)在對(duì)數(shù)期后的40min。,轉(zhuǎn)化過(guò)程示意圖,二、轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction） 通過(guò)完全缺陷或部分缺陷噬菌體為媒介，把一個(gè)細(xì)胞（供體細(xì)胞）的DNA片段轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞（受體細(xì)胞）中，并使后者發(fā)生遺傳變異的過(guò)程，稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)。通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)獲得部分供體細(xì)胞部分遺傳性狀的重組受體細(xì)胞，稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)子。攜帶供體部分遺傳物質(zhì)（DNA片段）的噬菌體稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體或轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒。在噬菌體內(nèi)僅含有供體DNA的稱為完全缺陷噬菌體；在噬菌體內(nèi)同時(shí)含有供體DNA和噬菌體DNA的稱為部分缺陷噬菌體（部分噬菌體DNA被供體DNA所替換）。,三、接合（conjugation) 通過(guò)供體菌和受體菌完整細(xì)胞

36、間的直接接觸而傳遞大段DNA的過(guò)程，稱為接合(conjugation)。 接合菌株與F因子 在細(xì)菌中，接合現(xiàn)象研究的最清楚的是大腸桿菌。大腸桿菌有性別分化。決定其性別的因子是F因子（即致育因子或稱性質(zhì)粒），這是一種在染色體外的小型獨(dú)立環(huán)狀DNA單位。F因子是一種屬于附加體（episome）的質(zhì)粒，它既可脫離染色體在細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立存在，也可插入（即整合）到染色體組上。由于F因子在細(xì)胞中的有無(wú)和存在方式的不同，可把大腸桿菌分成4種接合類型：F+（雄性菌株）、F-（雌性菌株）、Hfr（高頻重組菌株），F(xiàn)菌株。,F因子的存在和轉(zhuǎn)移方式,（三）幾種雜交結(jié)果 1、F+菌株和F-菌株接合的結(jié)果是產(chǎn)生二個(gè)F+菌株

37、。 2、F菌株和F-菌株接合的結(jié)果是產(chǎn)生二個(gè)F菌株。 3、Hfr菌株和F-菌株接合，在大多數(shù)的情況下，受體細(xì)菌仍然是F-，只有在極少數(shù)的情況下，由于遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移完整，受體細(xì)菌才能成為Hfr菌株。,第四節(jié) 基因工程 基因工程（gene engineering）指基因水平上的遺傳工程，它是用人為方法將所需要的某一供體生物的遺傳物質(zhì)（DNA大分子）提取出來(lái)，在離體條件下進(jìn)行切割后，把它和作為載體的DNA分子連接起來(lái)，然后導(dǎo)入某一受體細(xì)胞中，以讓外來(lái)的遺傳物質(zhì)在其中安家落戶，進(jìn)行正常的復(fù)制和表達(dá)，從而獲得新的物種的一種嶄新的育種技術(shù)。,一、基因分離 1、提取供體細(xì)胞的DNA，加入專一性很強(qiáng)的限制性核酸內(nèi)切酶，從而獲得帶有特定基因并露出稱為黏性末端的DNA。 2、提供作為載體的細(xì)菌質(zhì)粒（也可用噬菌體或病毒作載體）。其中DNA也可用同樣的限制性核酸內(nèi)切酶切斷，露出其相應(yīng)的黏接末端。 二、體外重組 把供體細(xì)胞的DNA片段和質(zhì)粒DNA片段放在試管中，在較低的溫度（56）下混合“退火”，當(dāng)兩者混合在一起時(shí)，凡粘接末端上堿基互補(bǔ)的片段，就會(huì)因氫鍵的作用而彼此吸引，重新形成雙鍵。這時(shí)，在外加連接酶的作用下，供體DNA片段與質(zhì)粒DNA片段的裂口處被“縫合”，形成一個(gè)完整的有復(fù)制能力的環(huán)狀重組體，及“雜種質(zhì)?！?。,三、載體傳遞 通過(guò)載體把供體