實(shí)驗(yàn)室做細(xì)胞常用染色

1、實(shí)驗(yàn)室做細(xì)胞常用得細(xì)胞固定與染色方法一、爬片前蓋玻片處理方法對(duì)于懸浮培養(yǎng)得細(xì)胞 ,在進(jìn)行各種染色前常需先制備成涂片。為了保證細(xì)胞在長(zhǎng)時(shí)間得染色過程中不從載玻片脫落，必須使其牢固貼附于載玻片上。在載玻片上涂布一層有助于細(xì)胞黏附得物質(zhì)就是經(jīng)常采用得方法之一. 能促進(jìn)細(xì)胞黏附得物質(zhì)主要有多聚賴氨酸、鉻礬明膠等，這里介紹多聚賴氨酸得涂布方法.1、將載玻片用玻璃專用洗滌劑(如 dco)浸泡min，間或振蕩。2、用自來水沖洗 5mi。3、以 1鹽酸 70乙醇溶液浸泡5mi 4、烤箱干燥 (至此即可用于普通染色 )。5、多聚 l- 賴氨酸 (1:10 溶于去離子水 ）浸泡 5in,振蕩。6、入 60烤箱 1

2、,或室溫過夜干燥 (用于細(xì)胞化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)及原位雜交細(xì)胞化學(xué) ).二、細(xì)胞固定常用方法固定細(xì)胞得目得在于把組織與細(xì)胞得原有結(jié)構(gòu)盡可能完整地保存下來,避免組織與細(xì)胞發(fā)生降解、自溶、腐敗與變形等,使細(xì)胞與組織內(nèi)得各種酶失去活性，防止細(xì)胞與組織得各種分子變性、解離,使細(xì)胞得化學(xué)物質(zhì)與酶能準(zhǔn)確定位，并在以后得處理與制片過程中亦不發(fā)生改變與破壞。同時(shí)，固定還可使細(xì)胞得各部分易于著色 ,適于觀察、長(zhǎng)期保存與分析.1、固定組織、細(xì)胞得基本原則：盡可能選用新鮮培養(yǎng)物;根據(jù)檢測(cè)工具、對(duì)象、目得與要求選擇固定劑與固定方法。2、培養(yǎng)物得準(zhǔn)備與固定前處理:各種細(xì)胞培養(yǎng)物 ,如雙蓋片懸滴培養(yǎng)物、懸液培養(yǎng)物、單層培養(yǎng)

3、物與蓋片單層培養(yǎng)物都可作固定材料.對(duì)雙蓋片懸滴培養(yǎng)物與懸液培養(yǎng)物來說 ,常通過離心收集細(xì)胞， pbs 漂洗 23 次后 ,備固定制片；對(duì)蓋片單層培養(yǎng)物來說 ,將蓋片從培養(yǎng)器皿中取出后，pbs 液漂洗 2次 ,以洗去血清與附著于細(xì)胞表面得殘?jiān)?備固定用 .3、常用固定液 :常用得固定液分兩類，一類就是以單一化學(xué)物質(zhì)配成得固定液 ,稱簡(jiǎn)單固定液。主要有甲醇、乙醇、甲醛、醋酸、丙酮、戊二醛、苦味酸、鉻酸、重鉻酸鉀、氯化汞、氯化鎘、四氧化鋨(鋨酸） 另一類就是用兩種或兩種以上化學(xué)物質(zhì)配合成得固定液，稱混合固定液。如mu ler 固定液、fl i g 固液、 faa 固定液、 carno固定液、 os

4、an 固定液、 a ann固定液、 bouing 固定液等。不同得固定液對(duì)細(xì)胞得化學(xué)成分、酶類及細(xì)胞結(jié)構(gòu)固定效果不同。因此,選擇合適得固定液就是達(dá)到固定目得得基礎(chǔ)。( )4%甲醛 ps:甲醛就是一種氣體，其飽與水溶液無色,約含 4 %甲醛 .在很多情況下 ,甲醛常常產(chǎn)生多聚甲醛得白色沉淀。4甲醛 pbs 使組織變硬速度比乙醇快，并能較好地保存組織得外部形式,固定效果不受制片影響，固定材料可用蘇木精與其她合成染料染色。甲醛得穿透力較強(qiáng)，對(duì)組織固定均勻,能增強(qiáng)組織得彈性，大標(biāo)本得固定與保存多用甲醛。甲醛就是染色體、線粒體與高爾基體得固定液 ,在冷凍切片中 ,甲醛作固定劑具有顯著得優(yōu)點(diǎn).用 40%甲

5、醛水溶液 :pbs=:9 配方制備甲醛固定液。（2）丙酮 :丙酮為無色易揮發(fā)液體 ,用純冷丙酮 ()固定細(xì)胞內(nèi)酶效果較佳 .(3)乙醇 :乙醇又稱酒精 ,固定血纖維蛋白、色素、彈性纖維、細(xì)菌與白細(xì)胞等效果優(yōu)良。無水乙醇或乙醇與醋酸得混合液就是固定肝糖原及肌糖原得良好固定液。乙醇除有固定作用外，還具有硬化與脫水得作用.作為固定用乙醇得適宜濃度為 0%1 %。乙醇得缺點(diǎn)就是滲透力差,并使組織收縮 .（）醋酸 :常用 0、% 濃度得醋酸作固定劑 .醋酸能與水及乙醇、甲醇溶合 ,醋酸不固定蛋白質(zhì) ,但能固定核酸。醋酸得穿透力很大，它對(duì)細(xì)胞得膨脹作用顯著 ,這就是由于它破壞了某些蛋白質(zhì)分子得結(jié)合,所以

6、,常用醋酸來減少其她固定劑引起得細(xì)胞收縮。細(xì)胞學(xué)技術(shù)中 ,它能防止細(xì)胞收縮，并能較好地保存染色體 ,還能把染色質(zhì)沉淀成為可染色得塊狀體.(）苦味酸 :苦味酸就是黃色結(jié)晶體，強(qiáng)酸,可溶于水、乙醇、苯與二甲苯,在水中得溶解度可因水溫變化而變化?？辔端峥梢猿恋戆椎鞍?、核蛋白、球蛋白、組蛋白與核酸?？辔端岬么┩噶苈瑔为?dú)使用時(shí)，造成組織嚴(yán)重收縮。它與其她藥物混合配制時(shí),可以作為蛋白質(zhì)得沉淀劑,同時(shí)可避免組織收縮、硬化 ,而且易于染色 .所以在很多混合固定液中被廣泛采用。作固定用得最適濃度為1%.(6)鋨酸 (四氧化鋨 ）:鋨酸就是一種強(qiáng)氧化劑,不能同乙醇與甲醛混合使用。它得揮發(fā)性很強(qiáng) ,揮發(fā)出來得氣

7、體能固定結(jié)膜,對(duì)眼睛很有害，所以操作時(shí)應(yīng)特別注意。四氧化鋨就是保存細(xì)胞結(jié)構(gòu)得最好固定劑之一，配制時(shí)先在棕色試劑瓶中盛入10m、 mol l 磷酸緩沖液 (ph7、07、 4),再將裝有 1g鋨酸得安培瓶放人pbs 中,以玻棒擊碎安培瓶 ,搖蕩使鋨酸溶解，備用。常用得固定液濃度為 1% 2%。( )戊二醛：戊二醛對(duì)組織得滲透率高,與蛋白質(zhì)反應(yīng)快，能較好地保存蛋白質(zhì)，對(duì)微管與膜性結(jié)構(gòu)保存亦比較好，并能較好地保存糖原。常用得戊二醛固定液配制方法列于表12-1。表 121 常用得戊二醛固定液配制方法ph、 2 得 0、1mo /l 磷酸緩沖液69298(ml)9625%戊二醛水溶液 ( l)81012

8、戊二醛得終濃度 1%1、 52%2、3%(8）甲醇醋酸固定液：甲醇:醋酸為 3：1 得固定液就是應(yīng)用最廣得一種培養(yǎng)細(xì)胞固定劑。甲醇穿透力好，醋酸固定蛋白效果好，兩者結(jié)合，能使固定細(xì)胞形態(tài)不變 .不僅最適用于固定染色體,而且固定得染色體適于gie a 染色 (注意 :此固定液宜現(xiàn)用現(xiàn)配 )。（ )faa 固定液：此固定液適用于固定蓋片單層培養(yǎng)得細(xì)胞,固定效果好 .配制方法 :90ml 80%酒精中加 5ml 冰乙酸與 5 40%甲醛。(10)ar oy 固定液 :car y 固定液就是較好得非水溶性固定液，就是顯示細(xì)胞化學(xué)成分 (如粘多糖等 )時(shí)常用得固定劑 ,固定、保真效果好 ,但穿透力差，適

9、于固定培養(yǎng)得單層細(xì)胞.配制方法： 60ml 純酒精加 30氯仿與0ml 冰乙酸(） ouin 固定液 :用于固定雙蓋片法培養(yǎng)得標(biāo)本，固定30 分鐘后，用70酒精褪去苦味酸黃色，如不立即染色,可將標(biāo)本保存在 酒精中。本試劑適于固定組織細(xì)胞得糖原。配制方法:先將 75m飽與苦味酸 （100 l 水中加、 2、 4)過濾 ,加入 25ml 福爾馬林 (0甲醛 ,有沉淀時(shí)禁用 ),最后加入 5 l 冰醋酸 ,混與后存于 冰箱中備用。冰醋酸最好在臨用前加入。該固定液對(duì)組織細(xì)胞穿透力較強(qiáng) ,固定效果較好 ,保存得細(xì)胞結(jié)構(gòu)完好 .但因偏酸 (p為 33、5),對(duì)抗原有一定損害。(12）4多聚甲醛 -pbs

10、固定液 :多聚甲醛為白色固體 ,在0ml 蒸餾水中加入4多聚甲醛 ,加熱至 70時(shí) ,邊攪拌邊逐滴加入2 l ,至液體清晰透明用 m /lhc 調(diào)節(jié) h 至 7、，冷卻后加入 0、01l/lpbs 液至 10ml,4保存。本試劑適于固定腎纖維蛋白與細(xì)胞骨架蛋白。三、常見得細(xì)胞染色方法普通染色觀察蘇木精 -伊紅 (hematoxyline in,h)染色與 gimsa 染色就是觀察培養(yǎng)細(xì)胞一般形態(tài)得最常用方法, 也就是把細(xì)胞作為標(biāo)本保存得主要方法對(duì)于貼壁培養(yǎng)得細(xì)胞，以生長(zhǎng)于蓋玻片與塑料培養(yǎng)瓶壁者便于操作。固定前先用ha液、 pbs、 ss或生理鹽水清洗培養(yǎng)物2 次,去除妨礙染色得血清。固定后可將

11、蓋玻片用樹膠貼于載玻片上，以利操作。對(duì)于懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，須先經(jīng)離心沉淀 (10rin，1mi ), 棄上清液后 （留少量液體 ), 將細(xì)胞懸液滴于玻片上做成涂片, 冷風(fēng)吹干。1、 h染色法1、1、1 染液配制（）蘇木精染液 :這里介紹鄂征 (995）改良得 maer 法。稱取 、 5g蘇木精 ,5、 0g銨礬或鉀礬 ,0、1碘酸鈉加溫溶于 70m1 蒸餾水。 再加入 0ml 甘油 , 2ml冰醋酸。混勻。過濾后即成母液?？砷L(zhǎng)久保存。用蒸餾水以 :稀釋即成工作液，可用很長(zhǎng)時(shí)間。每次染色前宜過濾,去除氧化膜。（2)伊紅染液 :伊紅有醇溶性與水溶性之分。將0、 5g 伊紅溶于 00m1乙醇或蒸餾水即成

12、工作液 .、 染色程序（1)用0甲醛 (福爾馬林 )固定培養(yǎng)物 0mi，或以丙酮固定 15mi。(2)蒸餾水洗 1 次后，入蘇木精染液5 0mi染細(xì)胞核。（ 3) 入 0、 %鹽酸 70乙醇溶液 31min, 脫去胞質(zhì)得著色。 此時(shí)核呈紫紅色 .(4）入堿性溶液堿化，使細(xì)胞核變成藍(lán)色。如果時(shí)間允許,最好用自來水 (呈弱堿性）長(zhǎng)時(shí)間浸泡。也可入 %nahco3 溶液。此過程須不斷用顯微鏡監(jiān)視，以掌握堿化時(shí)間 .( )蒸餾水洗 1 i ,去除殘留得堿性溶液，否則影響伊紅著色。(6）入伊紅染液 3s1 i 。(）用梯度乙醇溶液脫水 :0、 9、 95%乙醇各 30 1mi ；100%（ 2 次)各

13、in。如伊紅為乙醇溶液，略去70%乙醇。(8）用二甲苯透明2 次 ,各 5min。(9)樹膠封固。、 1、 3 染色結(jié)果細(xì)胞核呈紫藍(lán)色或深藍(lán)色，大部分細(xì)胞得胞質(zhì)呈粉紅色。如果胞質(zhì)內(nèi)含較多核糖體（例如淋巴細(xì)胞 )則亦呈藍(lán)色 .、 2 吉姆薩染色法此法可將細(xì)胞核與胞質(zhì)同時(shí)染色，故便捷快速；但染液配制技術(shù)不易準(zhǔn)確掌握 ,效果常不如 he 染色穩(wěn)定。1、 1 吉姆薩 (gi m a)染液得配制(1)取 1、5g 吉姆薩粉末放入 5ml 甘油 ,置于 60溫箱 ,約 3h 后溶解。（）取出后倒入 5 m中性甲醇 ,即為母液 .于棕色瓶可長(zhǎng)久保存。需要注意得就是 ,有得甲醇內(nèi)含醋酸 ,會(huì)使染液中得伊紅沉淀出來,不利染色。(3)將母液與 、 1 mol