儀器分析課件第7章-分子發(fā)光分析法.ppt

1、第 7 章 分子發(fā)光分析法,molecular luminescence analysis,1,2,分子發(fā)光分析法包括熒光分析法、磷光分析法和化學(xué)發(fā)光分析法。這三種都是通過測量被激發(fā)的分子回到基態(tài)時所發(fā)射的光輻射來進(jìn)行分析的，不同之處在于光譜產(chǎn)生的機(jī)制。 分子受光子激發(fā)后，由第一電子激發(fā)單重態(tài)回到基態(tài)的任一振動能級伴隨的光輻射稱為分子熒光。 激發(fā)態(tài)分子從第一激發(fā)三重態(tài) 回到基態(tài)伴隨的光輻射稱為磷光。 分子受化學(xué)能激發(fā)后產(chǎn)生的發(fā)光現(xiàn)象稱為化學(xué)發(fā)光。,7-1 概述,3,7-2 分子熒光分析法及其基本原理,分子熒光和磷光通?；诨騨形式的電子躍遷，因此都需要有不飽和官能團(tuán)的存在。 在光致激發(fā)和去激發(fā)

2、光中，價電子可以處在不同的自旋狀態(tài)，常用電子自旋狀態(tài)的多重性描述。,1. 電子自旋狀態(tài)的多重性,一、分子熒光和磷光的產(chǎn)生,4,概念：單重態(tài)（S）、基態(tài)（S0）、第一激發(fā)單重態(tài)（S1）、第二激發(fā)單重態(tài)（S2）、三重態(tài)（T）、第一激發(fā)三重態(tài)（T1）、第二激發(fā)三重態(tài)（T2）,1. 電子自旋狀態(tài)的多重性,5,熱能、電能、化學(xué)能或光能,S0：基態(tài) S1、S2：第一（二）電子激發(fā)單重態(tài) T1、T2：第一（二）電子激發(fā)三重態(tài) ：基態(tài)和激發(fā)態(tài)的振動能級,電子自旋狀態(tài)的多重性,6,2. 無輻射躍遷,當(dāng)激發(fā)態(tài)分子返回基態(tài)時，如果不伴有發(fā)光現(xiàn)象，該過程稱為無輻射去激或無輻射躍遷，該過程包括振動弛豫（VR） 、內(nèi)轉(zhuǎn)換

3、（IC）和系間竄躍（ISC）。,7,電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時，通過輻射躍遷(發(fā)光)和無輻射躍遷等方式失去能量；,激發(fā)態(tài)停留時間短、返回速度快的途徑，發(fā)生的幾率大，發(fā)光強(qiáng)度相對大； 熒光：10-810 -6 s,第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級基態(tài)； 磷光：10-410s；第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級基態(tài)；,小結(jié)：分子熒光和磷光的產(chǎn)生,8,9,熒光(磷光)：光致發(fā)光，照射光波長如何選擇？,熒光(磷光)的激發(fā)光譜曲線 激發(fā)光譜反映了激發(fā)波長與熒光強(qiáng)度之間的關(guān)系，為熒光分析選擇最佳激發(fā)波長提供依據(jù)。 固定測量波長(選最大發(fā)射波長)，化合物發(fā)射的熒光(磷光)強(qiáng)度與照射光波長的關(guān)系曲線 。簡而

4、言之，固定發(fā)射波長，找激發(fā)波長。,二、分子熒光分析的基本原理,1. 激發(fā)光譜和發(fā)射光譜,10,熒光 (或磷光)發(fā)射光譜,固定激發(fā)光波長(選最大激發(fā)波長), 化合物發(fā)射的熒光(或磷光強(qiáng)度)與發(fā)射光波長關(guān)系曲線。,11,激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系,（1） Stokes(斯托克斯)位移 激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長差值。發(fā)射光譜的波長比激發(fā)光譜的長，振動弛豫消耗了能量。 （2） 熒光光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān) 電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級，吸收不同波長的能量(如2 ,1)，產(chǎn)生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級再躍遷回到基態(tài)，產(chǎn)生波長一定的熒光(如2)。 （3） 鏡像規(guī)則 通常熒光發(fā)射光譜與它

5、的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一樣）成鏡像對稱關(guān)系。,12,200,250,300,350,400,450,500,熒光激發(fā)光譜,熒光發(fā)射光譜,nm,蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜,13,小結(jié)：什么是分子熒光發(fā)射光譜與熒光激發(fā)光譜?,(1) 熒光激發(fā)光譜: 固定熒光發(fā)射波長, 掃描熒光激發(fā)波長, 所得到的激發(fā)波長與熒光強(qiáng)度的一維光譜曲線。 熒光發(fā)射光譜: 固定熒光激發(fā)波長, 掃描熒光發(fā)射波長, 所得到的發(fā)射波長與熒光強(qiáng)度的一維光譜曲線。 (2) 熒光發(fā)射光譜是供應(yīng)能量使試樣增加能量后，針對發(fā)射的熒光所記錄的光譜, 熒光激發(fā)光譜是以熒光為光源照射試樣后, 針對試樣吸收能量所記錄的光譜。,14,思考題：簡述分

6、子熒光光譜常與其吸收光譜呈鏡像對稱關(guān)系, 而又不完全對稱, 且熒光光譜的波長較長的理由。,答(1)物質(zhì)的吸收光譜是物質(zhì)吸收光能后,由基態(tài)躍遷至較高激發(fā)態(tài)的各個振動能級，產(chǎn)生吸收光譜的形狀是由激發(fā)態(tài)的能級分布決定的。 (2)分子熒光光譜是由基態(tài)的振動能級分布決定的。兩者情況相似,但又不相同,再加上物質(zhì)分子在激發(fā)態(tài)和基態(tài) 受溶劑作用及環(huán)境的影響不同。,15,熒光量子產(chǎn)率（）：是物質(zhì)熒光特性的重要參數(shù)，它反映了熒光物質(zhì)發(fā)射熒光的能力，其數(shù)值越大，說明物質(zhì)的熒光能力越強(qiáng)。,在產(chǎn)生熒光的過程中，涉及到許多輻射和無輻射躍遷過程，如熒光發(fā)射、內(nèi)轉(zhuǎn)移，系間竄躍和外轉(zhuǎn)移等。很明顯，熒光的量子產(chǎn)率，與上述每一個過

7、程的速率常數(shù)有關(guān)。如外轉(zhuǎn)換過程速度快，不出現(xiàn)熒光發(fā)射。,2. 熒光強(qiáng)度與溶液濃度之間的關(guān)系,P128,16,熒光強(qiáng)度 If正比于吸收的光量Ia和熒光量子效率 ： If = Ia 由朗-比耳定律： Ia = I0(1-10- b c ) If = I0(1-10- b c ) = I0(1-e-2.3 b c ) 濃度很低時，將括號項近似處理后： If = 2.3 I0 b c = Kc,只有在極稀的溶液中，當(dāng) b c 0.02時才成立，對于濃度較高的溶液，由于自猝滅和自吸收等原因，使熒光強(qiáng)度和熒光物質(zhì)濃度不呈線性關(guān)系。,17,分子產(chǎn)生熒光必須具備兩個條件： 物質(zhì)分子必須具有能吸收一定頻率紫外可

8、見輻射的特征結(jié)構(gòu)，分子必須具有吸光的結(jié)構(gòu) 吸光后被激發(fā)的分子還必須具有高的熒光量子產(chǎn)率，許多吸光物質(zhì)不一定發(fā)熒光，就是由于他們的吸光分子的熒光量子產(chǎn)率不高，而是將其吸收的能量與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子的相互碰撞中消耗掉了，因此不能發(fā)生熒光。,3 .熒光的產(chǎn)生與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系,18,（1）共軛效應(yīng) 實驗證明，容易實現(xiàn)激發(fā) 的芳香族化合物容易發(fā)生熒光，能發(fā)生熒光的脂肪族和脂環(huán)族化合物極少（僅少數(shù)高度共軛體系化合物除外）。任何有利于提高電子共軛程度的結(jié)構(gòu)的改變都將提高熒光效率，并使熒光波長向長波方向移動。 共軛效應(yīng)使熒光增強(qiáng)的原因 ： 主要是由于增大熒光物質(zhì)的摩爾吸光系數(shù)，有利于產(chǎn)生更多的激發(fā)態(tài)分子，

9、從而有利于熒光的發(fā)生。,19,(2) 剛性平面結(jié)構(gòu) 實驗發(fā)現(xiàn)，多數(shù)具有剛性平面結(jié)構(gòu)的有機(jī)分子具有強(qiáng)烈的熒光。因為這種結(jié)構(gòu)可以減少分子的振動，使分子與溶劑或其它溶質(zhì)分子的相互作用減少，也就減少了碰撞去活的可能性。,20,（3）取代基效應(yīng) 芳香族化合物苯環(huán)上的不同取代基對該化合物的熒光強(qiáng)度和熒光光譜有很大的影響。 a. 給電子基團(tuán)，如-OH、-OR、-CN、-NH2 、 -NR2等，使熒光增強(qiáng)。因為產(chǎn)生了p-共軛作用，增強(qiáng)了電子共軛程度，導(dǎo)致熒光增強(qiáng)，熒光波長紅移。 b. 吸電子基團(tuán)，如-COOH、-NO、-C O、鹵素等，不能擴(kuò)大電子共軛程度，反而使S1-T1系間跨越增強(qiáng)，導(dǎo)致熒光減弱，磷光增強(qiáng)

10、。,21,c.重原子效應(yīng)：引入質(zhì)量相對較重的原子出現(xiàn)磷光增強(qiáng)和熒光減弱的現(xiàn)象。 d. 同電子體系相互作用較小的取代基，如-SO3H、-NH3+等，對分子發(fā)光只有很小影響。因此給一個發(fā)光分子引入磺酸基可以增加分子在水溶液中的溶解度。,22,23,（4）躍遷類型 實驗證明，對于大多數(shù)熒光物質(zhì)，首先經(jīng)歷或n激發(fā)，然后經(jīng)過振動弛豫或其他無輻射躍遷，再發(fā)生或n躍遷而得到熒光。在這兩種躍遷類型中，躍遷常能發(fā)出較強(qiáng)的熒光（較大的量子產(chǎn)率）。這是由于躍遷具有較大的摩爾吸光系數(shù)（一般比n大100-1000倍），其次，躍遷的壽命約為10-7-10-9s，比n躍遷的壽命10-5-10-7s要短。 此外，在躍遷過程中

11、，通過系間竄躍至三重態(tài)的速率常數(shù)也較?。⊿1T1能級差較大），這也有利于熒光的發(fā)射。 總之，躍遷是產(chǎn)生熒光的主要躍遷類型。,P129,24,4.影響熒光強(qiáng)度的因素 P130,（1）溶劑的影響 一般來說，許多共軛芳香烴化合物熒光強(qiáng)度隨溶劑極性的增加而增強(qiáng)，且熒光峰波長向長波方向移動。 在含有重原子的溶劑如碘乙烷和四溴化碳中，與將這些成分引入熒光物中所產(chǎn)生的重原子效應(yīng)相似，導(dǎo)致熒光減弱，磷光增強(qiáng)。若溶劑和熒光物質(zhì)形成氫鍵或溶劑使熒光物質(zhì)解離狀態(tài)改變，則熒光波長和熒光強(qiáng)度也會發(fā)生改變。,25,（2）溫度的影響 一般來說，大多數(shù)熒光物質(zhì)的溶液隨著溫度降低，熒光效率和熒光強(qiáng)度將增加；反之，溫度升高熒光效

12、率則下降。 如熒光素的乙醇溶液在0C以下每降低10C，熒光效率增加3%，冷至-80C時，熒光效率為100%。 這是因為溫度降低時，溶液中分子的活動性減弱，溶液的黏度增大，溶質(zhì)分子與溶劑分子間碰撞機(jī)會減少，降低了各種無輻射去活化概率，使熒光效率增加，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。,26,（3）溶液pH的影響 帶有酸性或堿性官能團(tuán)的大多數(shù)芳香族化合物的熒光與溶液的pH有關(guān)。不同的pH值，化合物所處狀態(tài)不同，不同的化合物或化合物的分子與其離子在電子構(gòu)型上有所不同，因此，它們的熒光強(qiáng)度和熒光光譜就有一定的差別。 對于金屬離子與有機(jī)試劑形成的發(fā)光鏊合物，一方面pH會影響鏊合物的形成，另一方面還會影響鏊合物的組成，因而影

13、響它們的熒光性質(zhì)。,27,（4）熒光的猝滅 熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子的相互作用引起熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象稱為熒光猝滅。能引起熒光強(qiáng)度降低的物質(zhì)稱為猝滅劑。,28,7-3 熒光分析儀器 P131,組成：激發(fā)光源、樣品池、雙單色器、檢測器。 特殊點：兩個單色器，光源與檢測器通常成直角。,29,（1）激發(fā)光源 在紫外-可見區(qū)范圍，通常的光源是氙燈和高壓汞燈，此外高功率連續(xù)可調(diào)染料激光光源就是一種新型熒光激發(fā)光源。 （2）樣品池 熒光用的樣品池須用低熒光的材料制成，通常用石英，形狀以方形和長方形為宜。 （3）單色器 光柵，激發(fā)單色器用于選擇激發(fā)波長；發(fā)射單色器，用于分離出熒光發(fā)射波長。 （4）

14、檢測器 由光電管和光電倍增管作檢測器，并與激發(fā)光成直角。,30,7-4 熒光分析法及其應(yīng)用,由于能產(chǎn)生熒光（磷光）的化合物占被分析物的數(shù)量相當(dāng)有限的，并且許多化合物幾乎在同一波長產(chǎn)生光致發(fā)光，所以熒光（磷光）法很少用于定性分析。 分子發(fā)光分析法是最靈敏的分析方法之一，其靈敏度在很多情況下比紫外-可見吸收光譜法要高的多，所以更適合低濃度的分析。,31,7-4-1 定量分析方法工作曲線法,（1）校準(zhǔn)曲線法,（2）標(biāo)準(zhǔn)對照法（比較法）,如果熒光物質(zhì)的校準(zhǔn)曲線通過零點，就可以選擇其線性范圍內(nèi)某一濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用標(biāo)準(zhǔn)對照法測定。,32,7-4-2 應(yīng)用,1. 無機(jī)化合物的分析 很多無機(jī)離子能與一些有機(jī)

15、試劑形成熒光絡(luò)合物而被測定，這種試劑稱為熒光試劑，這種方法稱為直接熒光法。還有一些無機(jī)離子，它們不能形成熒光絡(luò)合物，但能使其他物質(zhì)的熒光減弱，可利用熒光猝滅法測定。 （1）直接熒光法：鈹、鋁、硼、鎵、硒、鎂、稀土 （2）熒光猝滅法：氟、硫、鐵、銀、鈷、鎳,33,2. 有機(jī)化合物的分析,此外，藥物中的胺類、甾族類、抗生素、維生素、氨基酸、蛋白質(zhì)和酶等大多具有熒光，可用熒光法測定。,34,35,7-5 化學(xué)發(fā)光分析法（自學(xué)）,化學(xué)發(fā)光是由化學(xué)反應(yīng)提供的能量激發(fā)物質(zhì)產(chǎn)生的光輻射。 發(fā)生于生物體的化學(xué)發(fā)光，稱為生物發(fā)光。 利用化學(xué)發(fā)光而建立起來的方法，稱為化學(xué)發(fā)光分析法。,36,7-5-1 化學(xué)發(fā)光分

16、析法的基本原理,1. 化學(xué)發(fā)光分析法的基本原理,化學(xué)發(fā)光是吸收化學(xué)反應(yīng)過程產(chǎn)生的化學(xué)能，而使反應(yīng)產(chǎn)物分子激發(fā)所發(fā)射的光。任何一個化學(xué)發(fā)光反應(yīng)都應(yīng)包括化學(xué)激發(fā)和發(fā)光兩個步驟。,化學(xué)發(fā)光反應(yīng)效率CL，又稱化學(xué)發(fā)光的總量子產(chǎn)率。它決定于生成激發(fā)態(tài)產(chǎn)物分子的化學(xué)激發(fā)效率CE和激發(fā)態(tài)分子的發(fā)射效率EM。定義為： CL =發(fā)射光子的分子數(shù) / 參加反應(yīng)的分子數(shù)= CEEM,37,化學(xué)發(fā)光必須滿足如下條件： （1）化學(xué)反應(yīng)必須提供足夠的激發(fā)能，激發(fā)能主要來源于反應(yīng)焓。 （2）要有有利的化學(xué)反應(yīng)歷程，使化學(xué)反應(yīng)的能量至少能被一種物質(zhì)所接受并生成激發(fā)態(tài)。 （3）要觀察到化學(xué)發(fā)光，激發(fā)態(tài)能釋放光子或能夠轉(zhuǎn)移它的能

17、量給另一個分子，而使該分子激發(fā)，然后以輻射光子的形式回到基態(tài)。 （4）由于化學(xué)激活的瞬時性，激活能必須由某一步驟單獨提供，否則，前一步反應(yīng)所釋放出的能量將會因分子振動而被消耗掉。,38,化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的發(fā)光強(qiáng)度IcL以單位時間內(nèi)發(fā)射的光子數(shù)表示。它等于化學(xué)發(fā)光效率CL與單位時間內(nèi)起了反應(yīng)的被測反應(yīng)物A濃度的變化的乘積，即 ICL(t)= CL dcA/dt 式中ICL(t)表示t時刻的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度， CL是與分析物有關(guān)的化學(xué)發(fā)光效率dcA/dt是分析物參加反應(yīng)的速率。,2. 化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度,39,7-5-2 化學(xué)發(fā)光的類型,1. 直接化學(xué)發(fā)光和間接化學(xué)發(fā)光,直接發(fā)光是被測物作為反應(yīng)物直接參加化學(xué)

18、發(fā)光反應(yīng)，生成電子激發(fā)態(tài)產(chǎn)物分子，此初始激發(fā)態(tài)能輻射光子。 A + B C* + D C* C + h 式中A或B是被測物，通過反應(yīng)生成電子激發(fā)態(tài)產(chǎn)物C* ， 當(dāng)C* 躍遷回基態(tài)時，輻射光子,40,間接發(fā)光是被測物A或B，通過化學(xué)反應(yīng)生成初始激發(fā)態(tài)產(chǎn)物C* ， C* 不直接發(fā)光，而是將其能量轉(zhuǎn)移給F，使F躍遷回基態(tài)，產(chǎn)生發(fā)光。 A + B C* + D C*+F F* + E F* F + h 式中C*為能量給予體，而F為能量接受體。,41,2. 氣相化學(xué)發(fā)光 主要有O3、NO、S的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，可用于監(jiān)測空氣中的O3、NO、SO2、H2S、CO、NO2等。 （1）臭氧的化學(xué)發(fā)光反應(yīng) （2）氮

19、氧化物的化學(xué)發(fā)光反應(yīng) （3）利用氧原子的化學(xué)發(fā)光反應(yīng),42,3. 液相化學(xué)發(fā)光 用于此類化學(xué)發(fā)光分析的發(fā)光物質(zhì)有魯米諾、光澤堿、洛粉堿等。 例如，利用發(fā)光物質(zhì)魯米諾，可測定痕量的H2O2以及Cu、Mn、Co、V、Fe、Cr、Ce等金屬離子,43,7-5-3 化學(xué)發(fā)光的測量儀器,化學(xué)發(fā)光分析法的測量儀器主要包括 樣品室、光檢測器、放大器和信號輸出裝置。 化學(xué)發(fā)光反應(yīng)在樣品室中進(jìn)行，樣品和試劑混合的方式有不連續(xù)取樣體系，加樣是間歇的。將試劑先加到光電倍增管前面的反應(yīng)池內(nèi)，然后用進(jìn)樣器加入分析物。另一種方法是連續(xù)流動體系，反應(yīng)試劑和分析物是定時在樣品池中匯合反應(yīng)，且在載流推動下向前移動，被檢測的光信

20、號只是整個發(fā)光動力學(xué)曲線的一部分，而以峰高進(jìn)行定量測量。,44,7-5-4 化學(xué)發(fā)光分析法的特點及應(yīng)用,化學(xué)發(fā)光最顯著的特點是： 靈敏度高，其檢出限可達(dá)10-15 mol/L 線性范圍寬，一般可達(dá)4-5個數(shù)量級 操作簡單，易于實現(xiàn)自動化 所用儀器設(shè)備簡單，不需要光源和單色器，無光散射及雜散光引起背景值的干擾 應(yīng)用：表7-6和表7-7,45,補(bǔ)充：磷光分析法,磷光和熒光都是光致發(fā)光，任何發(fā)射磷光的物質(zhì)也都具有兩個特征光譜，即磷光激發(fā)光譜和磷光發(fā)射光譜。其定量分析的依據(jù)是在一定條件下磷光強(qiáng)度與磷光物質(zhì)濃度成正比。在儀器應(yīng)用方面磷光法和熒光法也相似。本節(jié)主要討論磷光法的一些特點。,46,1 磷光分析法原理,1. 磷光的特點 分子磷光是第一激發(fā)單重態(tài)（S1）的最低振動能級，經(jīng)系