《植物細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)》PPT課件.ppt

1、第六章 植物細(xì)胞融合（實(shí)驗(yàn)）,一、細(xì)胞融合的目的和意義 細(xì)胞融合能實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣雜交。其意義在于打破了僅僅依賴有性雜交重組基因創(chuàng)造新種的界限，有可能形成有性雜交方法無(wú)法獲得的新型雜種植物，廣泛組合各種基因型，擴(kuò)大了遺傳物質(zhì)的重組范圍。,二、細(xì)胞融合（cell fusion)概念 在外力（誘導(dǎo)劑或促融合劑）作用下，兩個(gè)或兩個(gè)以上的異源細(xì)胞或原生質(zhì)體相互接觸，從而發(fā)生膜融合、胞質(zhì)融合和核融合并形成雜種細(xì)胞的現(xiàn)象。 通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，這個(gè)細(xì)胞有可能發(fā)育成完整的生物個(gè)體，這個(gè)雜種后代有可能兼有兩個(gè)上代的一些優(yōu)良性狀。,細(xì)胞在融合過(guò)程中發(fā)生的主要變化： 呈致密狀態(tài)的體細(xì)胞在促融合劑的作用下，細(xì)胞膜的性質(zhì)發(fā)生變

2、化。 首先出現(xiàn)細(xì)胞凝集現(xiàn)象；然后部分凝集細(xì)胞之間的膜發(fā)生粘連；繼而融合形成多核細(xì)胞；在培養(yǎng)過(guò)程中多核細(xì)胞又進(jìn)行核的融合而成為單核的雜種細(xì)胞，而那些不能形成單核的融合細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中逐漸死亡。,三、細(xì)胞融合技術(shù)原理和方法 由于體外培養(yǎng)的細(xì)胞很少會(huì)發(fā)生自發(fā)融合（融合頻率大約在10-410-6之間），因此要采用生物、化學(xué)或物理的方法人為地促使細(xì)胞融合。,促細(xì)胞融合的方法有：（一）病毒促進(jìn)細(xì)胞融合 其中仙臺(tái)病毒（HVJ）是最早用于動(dòng)物細(xì)胞融合的融合劑。（二）化學(xué)融合劑促進(jìn)細(xì)胞融合 主要包括鹽類融合劑、聚乙二醇（PEG）、二甲亞砜（DMSO）、甘油-醋酸酯、油酸鹽、脂質(zhì)、Ca2+配合物等。 （三）電處理

3、融合法,聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG)融合 在眾多的化學(xué)試劑中，PEG應(yīng)用最為廣泛，因PEG液比病毒更易制備和控制、活性穩(wěn)定、使用方便、而且促進(jìn)細(xì)胞融合的能力更強(qiáng)。PEG是一種多聚化合物。,PEG誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合的機(jī)理： 帶有大量負(fù)電荷的PEG與水之間的氫鍵結(jié)合，使溶液中自由水消失，由于高度脫水引起原生質(zhì)體凝集，形成大小程度不同的凝集物。原生質(zhì)體發(fā)生皺縮并大大扭曲變形，鄰近原生質(zhì)體之間緊密接觸。,在原生質(zhì)體細(xì)胞膜與膜緊密接觸的部位，膜內(nèi)蛋白質(zhì)顆粒易位并凝聚。接著可能是相鄰的剝?nèi)サ鞍踪|(zhì)的細(xì)胞膜間的類脂質(zhì)與類脂質(zhì)反應(yīng)。繼之，類脂質(zhì)分子的擾動(dòng)和重排導(dǎo)致接觸的細(xì)胞膜局部發(fā)生

4、融合，形成很小的細(xì)胞質(zhì)橋，之后它逐漸擴(kuò)大，兩個(gè)原生質(zhì)體最終融合。,使用化學(xué)促融劑時(shí)，Ca2+是必需的。關(guān)于Ca2+的作用機(jī)理，有的認(rèn)為是Ca2+和PO43-形成不溶于水的配合物，成為細(xì)胞間的鈣橋，由此引起融合。也有解釋為Ca2+結(jié)合到帶負(fù)電磷脂的電離基上，使磷脂分子在膜上相互分離，由此引起融合。,電融合（electrofusion technique)法： 電處理融合法是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來(lái)的細(xì)胞融合技術(shù)，使融合率大為提高。,Electroporator 2510 from Brinkmann,Model ECM830 from BTX,電融合過(guò)程的分子機(jī)制： 是以電降解及雙向電泳的聯(lián)合作

5、用為基礎(chǔ)。通過(guò)電泳，兩細(xì)胞膜緊密接觸，且膜表面的蛋白質(zhì)分子分離，產(chǎn)生了無(wú)蛋白的類脂區(qū)。,電脈沖作用時(shí)引起膜結(jié)構(gòu)局部擾亂，出現(xiàn)小孔洞。而相對(duì)的脂雙層間分子在范德華力作用下，形成脂分子橋。由于連接處的細(xì)胞膜表面曲率大，處于高張力狀態(tài)，在熱力學(xué)上是不穩(wěn)定的，所以最終導(dǎo)致兩細(xì)胞逐漸融合成一個(gè)圓形的大球狀細(xì)胞。,A Alignment: Cells are brought into close contact by means of dielectrophoresis.,B Fusion pulse: A squarewave pulse of a mere 15 microseconds is app

6、lied in order to permeate the membrane. The membranes then fuse.,C Heterokaryon phase: The cell membranes are fused completely and the cytoplasm has mixed together. Only the nuclei remain separate.,D Entire fusion product: The nuclei are now fused as well. As a rule, the number of chromosomes is red

7、uced.,Fusion phases of oat protoplasts (Avena sativa),實(shí)際操作： 先把待融合的細(xì)胞或原生質(zhì)體混合，取樣置于100V/cm的高頻交流電場(chǎng)中，在非均勻交流電場(chǎng)中形成項(xiàng)鏈狀排列；,完整煙草原生質(zhì)體（40） 原生質(zhì)體成串（40）,再用15V/cm直流電脈沖/微秒沖擊細(xì)胞或原生質(zhì)體的粘接點(diǎn)，細(xì)胞膜降解造成若干微孔，于是在膜之間形成通道，使細(xì)胞質(zhì)得以交換；最后導(dǎo)致新的球狀細(xì)胞的形成。,電融合法優(yōu)點(diǎn)（與PEG法比較）：1、融合率高；2、重復(fù)性強(qiáng)；3、誘導(dǎo)僅發(fā)生在質(zhì)膜接觸部位，對(duì)細(xì)胞 或原生質(zhì)體傷害小；4、融合是在同步狀態(tài)下進(jìn)行，活細(xì)胞數(shù)目多；5、裝置精巧

8、，方法簡(jiǎn)單，可在顯微鏡下觀察或錄像融合過(guò)程；6、免去PEG誘導(dǎo)后的洗滌過(guò)程，誘導(dǎo)過(guò)程可控制性強(qiáng)。,Electrofusion,四、實(shí)驗(yàn)材料、試劑和儀器1.材料 無(wú)菌煙草葉片、洋蔥根尖,2.試劑1）酶混合液 配制分兩部進(jìn)行：（1）將CaCl2.2H2O 7 mmol/L NaH2PO4.2H2O 0.7mmol/L MES 3 mmol/L 甘露醇 0.5 mmol/L 用重蒸餾水溶解，調(diào)pH5.6，定容為酶儲(chǔ)備液，滅菌備用。,（2）使用時(shí)再加入： 纖維素酶 R-10 0.8% 果膠酶 R-10 1% 因酶制劑經(jīng)過(guò)高壓滅菌處理后會(huì)失活，故先將酶儲(chǔ)液滅菌，待用時(shí)再將酶制劑按比例加入到第一步已滅菌的

9、酶液內(nèi)。,2）配制CaCl2.2H2O 0.16mol/L （pH5.8-6.2 用于懸浮原生質(zhì)體） 3)PEG液： 30%（w/v) PEG(MW=6000) CaCl2.2H2O 0.01mol/L kH2PO4 0.00074mol/L 山梨醇 0.1 mol/L 調(diào)pH 5.8-6.2 ；用時(shí)現(xiàn)配！,4）電融合液： 甘露醇 0.6M CaCl2.2H2O 0.5mM pH 5.8,3.儀器 1）大型儀器： 高壓滅菌鍋，超凈工作臺(tái)，離心機(jī)，倒置顯微鏡，電融合儀。,2）一般實(shí)驗(yàn)用品 大小培養(yǎng)皿，小燒杯，小滴管，刻度離心管，小漏斗，不銹鋼網(wǎng)300目,五.實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)路線：,煙草葉肉及洋蔥根尖

10、原生質(zhì)體酶解分離,提純?cè)|(zhì)體并調(diào)整原生質(zhì)體密度,a.調(diào)整融合儀參數(shù)，電擊使原生質(zhì)體融合 b.PEG法使原生質(zhì)體融合,倒置顯微鏡觀察并照相,實(shí)驗(yàn)步驟： 1.取酶儲(chǔ)液10ml，分別加入纖維素酶和果膠酶0.08g,0.1g，制備酶液。 2.取材：煙草、洋蔥根尖各0.7g 取洋蔥根尖，并將其切成0.5cm長(zhǎng)短大小放入小平皿中；取煙草葉片將其剪成0.5cm2 大小放入小平皿中。 3.酶解：將酶液等量加入到存有實(shí)驗(yàn)材料的平皿中，放入250c培養(yǎng)箱酶解。洋蔥約4h，煙草約3h。,4.觀察酶解效果 5.原生質(zhì)體的分離和純化 1）酶解后，用300目銅網(wǎng)過(guò)濾酶液，去除未酶解的雜質(zhì)，將濾液收集在10ml離心管中。

11、 2）1000轉(zhuǎn)/分離心3分鐘，用吸管或移液槍棄上清（注意不要把收集的原生質(zhì)體吸走）。 3）用CaCl2.2H2O （約1ml）懸浮下面的原生質(zhì)體（PEG法）；電融合法則用電融合液懸浮。 4）顯微鏡觀察提純后的原生質(zhì)體，若雜質(zhì)較多可重復(fù)1）3）操作。,純化的原生質(zhì)體圖示,完整洋蔥原生質(zhì)體（40）,完整煙草原生質(zhì)體（40）,6.原生質(zhì)體的密度測(cè)定 用血細(xì)胞記數(shù)板記數(shù)。每一樣品測(cè)定3次，根據(jù)測(cè)定結(jié)果，將懸浮原生質(zhì)體密度調(diào)整至5*105個(gè)/ml。 7.原生質(zhì)體的融合 （一）PEG法 1）配制PEG液（5ml） 30%（w/v) PEG(MW=6000) 1.5 g CaCl2.2H2O 0.0074

12、g kH2PO4 0.0005 g 山梨醇 0.0911g 調(diào)pH 5.86.2,2）將兩種原生質(zhì)體懸液等量混合 3）用刻度吸管將混合的原生質(zhì)體懸液滴在直徑為60mm的平皿中，每皿78滴，每滴約0.1ml。然后靜置10分鐘，使原生質(zhì)體貼在皿底上，形成一薄層（應(yīng)有35個(gè)平皿的重復(fù)）。 4）用吸管將等量的PEG溶液緩慢地加在原生質(zhì)體液滴上，再靜置1015分鐘。此時(shí)可取一個(gè)平皿在倒置顯微鏡上觀察原生質(zhì)體間的粘連。,PEG法原生質(zhì)體的融合圖示,1、煙草葉肉和洋蔥根尖細(xì)胞原生質(zhì)體融合（40）,2、煙草葉肉和洋蔥根尖細(xì)胞原生質(zhì)體的異源融合,（二）電融合法 1）融合儀參數(shù)設(shè)置： 成串電流頻率0.5MHz,電

13、壓30V,成串時(shí)間1min,融合脈沖幅寬40S,融合電壓150v,融合槽間距1mm 2）在融合小室中加入約100ul的原生質(zhì)體懸浮液，將融合小室接好電極后至于倒置顯微鏡下，靜置約3min，使懸浮的原生質(zhì)體沉降到平板底部，同時(shí)打開(kāi)成串脈沖輸出開(kāi)關(guān)及融合脈沖輸出開(kāi)關(guān)，使高壓脈沖發(fā)生電路與融合小室接通。然后輕觸脈沖觸發(fā)開(kāi)關(guān)，施加3次融合脈沖，每次間隔1s。融合脈沖后成串脈沖再保持1min。靜置融合小室2030min，在顯微鏡下觀察融合過(guò)程。,電融合法原生質(zhì)體的融合結(jié)果,原生質(zhì)體成串（40）,原生質(zhì)體融合（圖1）,電融合法原生質(zhì)體的融合結(jié)果,原生質(zhì)體融合（圖2）,原生質(zhì)體融合（圖3）,Overall

14、aims of research,To “capture” disease resistance from wild potato species To use segregating populations to identify plant disease resistance genes and transfer resistance into potato cultivars,SOMATIC HYBRIDIZATION IN SOLANUM,Somatic hybridization using protoplast fusion,Isolate protoplasts (typica

15、lly leaf mesophyll) from two parental lines Fuse protoplasts either chemically (PEG) or using electrofusion Cell membranes fuse forming one cell containing 2 nuclei On cell division nuclear material condenses together and hybrids cells are formed that contain DNA from both parental lines.,Potato pla

16、nts growing in a test tube,Freshly isolated potato protoplasts,Two protoplasts ready to fuse together,Fusion products begin to divide on nutrient medium,If the conditions are right, small shoots emerge from the green calli,Putative somatic hybrid plants,A fertile somatic hybrid,Phenotype of somatic

17、hybrids clearly shows characteristics of both parents,S. brevidens somatic hybrid S. tuberosum,Phenotype of intraspecific diploids of S. tuberosum,US-W9310.3 Somatic hybrid US-W9545.99,Somatic hybrids have ALL of the chromosomes from each parent plant,Verticillium wilt resistance test field at Hancock, Wisco