《植物細(xì)胞工程制藥》PPT課件.ppt

1、第五章 植物細(xì)胞工程制藥,本章重點(diǎn)：植物細(xì)胞培養(yǎng)的基本概念； 植物細(xì)胞的生理特征； 植物細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)。,第一節(jié) 基本概念,植物細(xì)胞工程涉及很多基本理論和實(shí)際操作技術(shù)，如組織和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，它是細(xì)胞遺傳操作及細(xì)胞保藏的基礎(chǔ)。 1.植物細(xì)胞的全能性：植物的每個(gè)細(xì)胞都包含著該物種的全部遺傳信息，從而具備發(fā)育成完整植株的遺傳能力。 在適宜條件下，任何一個(gè)細(xì)胞都可以發(fā)育成一個(gè)新個(gè)體。植物細(xì)胞全能性是植物組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)。,易混淆的概念 植物的分化：指在個(gè)體發(fā)育中，相同細(xì)胞后代在形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生理功能上產(chǎn)生穩(wěn)定性差異的過程。（細(xì)胞分裂是細(xì)胞分化的基礎(chǔ)，生物體的生長發(fā)育是細(xì)胞分裂和細(xì)胞分化共同作用的結(jié)

2、果。） 脫分化：由高度分化的植物器官、組織或細(xì)胞產(chǎn)生愈傷組織的過程，稱為植物細(xì)胞的脫分化，或者叫做去分化。 再分化:脫分化產(chǎn)生的愈傷組織繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，又可以重新分化成根和芽等器官，這個(gè)過程叫做再分化。,植物組織培養(yǎng)過程總結(jié),離體的植物器官、 組織或細(xì)胞（外植體）,愈傷組織,根、芽,植物體,脫分化,再分化,愈傷組織：在人工培養(yǎng)基上由外植體長出來的一團(tuán)無序生長的薄壁細(xì)胞（細(xì)胞排列疏松、無規(guī)則）。,補(bǔ)充：愈傷組織的形成,植物組織或器官的無菌培養(yǎng) 定義：指在無菌或人工控制條件下（培養(yǎng)基、光照、溫度），研究植物的細(xì)胞、組織和器官以及控制其生長發(fā)育的技術(shù)。 主要技術(shù)有：（1）幼苗及較大植株的培養(yǎng)； （2）

3、從植物體的各種組織、器官等外植體，經(jīng)脫分化而形成的細(xì)胞聚集體的培養(yǎng)； （3）保持良好分散性的單細(xì)胞和較小細(xì)胞團(tuán)的液體培養(yǎng)； （4）植物離體器官的培養(yǎng)； （5）未成熟或成熟的胚胎的離體培養(yǎng)。,植物組織培養(yǎng)過程,切取外植體：從活植物體上切下進(jìn)行培養(yǎng)的那部分組織或器官 1）外植體滅菌消毒（根尖、莖、芽、嫩葉、 種子、花粉等） 2）用消毒過的器械將外植體置于培養(yǎng)皿上 3）切取所需的外植體 4）將外植體接種于培養(yǎng)容器的培養(yǎng)基上 整個(gè)試驗(yàn)在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行，保持無菌！ 外植體經(jīng)過一段時(shí)間在培養(yǎng)基上生長后，會(huì)形成愈傷組織,次級(jí)代謝 產(chǎn)物 定義：指生物體生長到一定階段才產(chǎn)生的化學(xué)結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜、對(duì)該生物體無明顯

4、生理功能，或并非是生物體生長和繁殖所必需的物質(zhì)，如抗生素、毒素、激素、色素等。 特征：（1）有明顯的分類學(xué)區(qū)域界限； （2）其生物合成需在一定的條件下才能發(fā)生； （3）缺乏明確的生理功能； （4）是生命活動(dòng)的多余成分。,了解內(nèi)容 分生組織培養(yǎng)：指在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)莖端分生組織細(xì)胞。 外植體:指用于植物組織的培養(yǎng)的器官或組織的切段。 突變體：經(jīng)過證實(shí)已發(fā)生遺傳變異或新的培養(yǎng)物至少是通過一種誘變處理而發(fā)生變異所得的新細(xì)胞。,思考題,一、名詞解釋 植物細(xì)胞的全能性 次級(jí)代謝 外植體 突變體 愈傷組織 二、問答 1.什么叫植物組織和器官培養(yǎng)？主要包括哪些技術(shù)？ 2.什么叫次級(jí)代謝產(chǎn)物？具有哪些特征？,

5、第三節(jié) 植物細(xì)胞的形態(tài)及生理特征,一、植物細(xì)胞的形態(tài),二、植物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特征,動(dòng)物細(xì)胞,植物細(xì)胞,細(xì)胞膜 細(xì)胞核 線粒體 內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 高爾基體 核糖體,中心體,細(xì)胞壁,葉綠體,液 泡,植物細(xì)胞與動(dòng)物細(xì)胞比較,植物細(xì)胞由細(xì)胞壁和原生質(zhì)體兩個(gè)部分組成。原生質(zhì)體包括細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和液泡。原始質(zhì)體包括細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。 與動(dòng)物細(xì)胞和微生物細(xì)胞相比，植物細(xì)胞有三個(gè)特點(diǎn)：具有細(xì)胞壁、液泡和質(zhì)體。,二、植物細(xì)胞的主要生理活性物質(zhì)及其他化學(xué)組分,細(xì)胞中 除含有有生命的原生質(zhì)體外，還有許多非生命的物質(zhì)，均為x細(xì)胞代謝過程中的產(chǎn)物，一類是生理活性物質(zhì)，對(duì)細(xì)胞內(nèi)生化代謝和生理活動(dòng)起著調(diào)節(jié)作用，含量少，但非常重要，另一類是

6、后含物，是貯藏物質(zhì)或廢棄物質(zhì)，分布于液泡內(nèi)。 1.生理活性物質(zhì)：對(duì)細(xì)胞內(nèi)的生化反應(yīng)和生理活動(dòng)起調(diào)節(jié)作用的物質(zhì)的總稱。包括酶、維生素、植物激素和抗生素。 2.后含物：是貯藏物質(zhì)或廢棄物質(zhì)。包括生物堿、糖苷類、揮發(fā)油、有機(jī)酸。,三、植物培養(yǎng)細(xì)胞的生理特征,一、主要特征： 1.細(xì)胞個(gè)體大（較微生物細(xì)胞大得多）抗剪切力差； 2.生長速度慢易被微生物污染，培養(yǎng)時(shí)需添加抗生素； 3.細(xì)胞易聚集成團(tuán)，難進(jìn)行懸浮培養(yǎng)； 4.培養(yǎng)時(shí)需供氧，但培養(yǎng)液黏度大，不受強(qiáng)力通風(fēng)攪拌； 5.具有群體效應(yīng)及解除抑制性； 6.細(xì)胞培養(yǎng)物滯留與細(xì)胞內(nèi)，產(chǎn)量低； 7.細(xì)胞具有結(jié)構(gòu)和功能全能性，即細(xì)胞可以分化為完整的植株。,二、植物

7、細(xì)胞不同生長階段的特征（了解） 1.延遲期：細(xì)胞分裂的初始期和最大生長期之間。2.加速期：細(xì)胞最大生長期和最大細(xì)胞濃度，最佳DNA和蛋白質(zhì)積累率。 3.對(duì)數(shù)期：介于最大生長率和蛋白質(zhì)合成完全停止期之間。 4.穩(wěn)定期：細(xì)胞數(shù)穩(wěn)定。 了解各個(gè)時(shí)期的特征,思考題,一、填空 1.與動(dòng)物細(xì)胞和微生物細(xì)胞相比，植物細(xì)胞有三個(gè)特點(diǎn)：具有、和。 2.植物細(xì)胞中含有兩類代謝產(chǎn)物，一類是，對(duì)細(xì)胞內(nèi)生化反應(yīng)和生理活動(dòng)起調(diào)節(jié)作用；另一類是，起貯藏物質(zhì)或廢棄物質(zhì)的作用。 二、問答 簡述植物細(xì)胞的生理特征,第四節(jié) 植物細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù),可分為4個(gè)階段：從普通的生長環(huán)境中分離植物組織利用無菌技術(shù)對(duì)所需的植物材料進(jìn)行無菌處

8、理（以獲得清潔的材料）在嚴(yán)格控制的物理和化學(xué)環(huán)境中對(duì)植物材料進(jìn)行培養(yǎng)和維持將植物組織還原成可以種植的植株,一、植物材料的準(zhǔn)備 植物組織的選擇取決于工作目標(biāo)，幾乎植物的任何部分都能誘導(dǎo)而產(chǎn)生愈傷組織。 1.從年輕的植株上取得外植體（避免患病或太老的組織） 2.種子也是比較合適的材料之一（種子比柔嫩的植物種子更易于滅菌）,滅菌（填空或選擇） 常用的滅菌劑有：次氯酸鈣、次氯酸鈉、氯化汞 滅菌步驟（了解) 植物材料清洗干凈70%酒精浸泡30-60min取出浸入滅菌劑溶液中，15min無菌水清洗3遍（除去消毒劑）-在無菌室或是超凈臺(tái)上進(jìn)行，以保證在消毒滅菌后不再被污染,二、培養(yǎng)基及其組成,培養(yǎng)基實(shí)際上是

9、植物離體器官、組織或細(xì)胞等的“無菌土壤”，其特點(diǎn)是營養(yǎng)成分的可調(diào)控性。 培養(yǎng)基的種類很多，但通常都含有無機(jī)鹽、碳源、有機(jī)氮源、植物生長素、維生素等化學(xué)成分。應(yīng)用最廣泛的是MS培養(yǎng)基。,1.無機(jī)鹽：大量元素（N、P、K、Ca、Mg、S、Cl、 Na）+微量元素（Fe、Mn、Zn、Cu、Mo、B） 2.碳源：經(jīng)常使用糖類、肌醇作為碳源，有時(shí)也用甘 油代替。 3.植物生長調(diào)節(jié)因子：指植物代謝過程中自身形成的 植物生長調(diào)節(jié)劑，在極低濃度時(shí)即可調(diào)節(jié)植物的生長 和發(fā)育過程，并能從合成部位轉(zhuǎn)運(yùn)到作用部位而發(fā)揮 作用。 主要有：植物生長素、細(xì)胞激動(dòng)素、赤霉素等,4.有機(jī)氮源：多位蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物（如谷氨酰胺）或

10、各種氨基酸。 5.維生素：植物自身合成的量不能滿足植物細(xì)胞的需要，必須加入B族維生素和一定量的生物素和肌醇。,三、培養(yǎng)方法 植物細(xì)胞的培養(yǎng)方法有很多，但固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)相互配合仍是細(xì)胞培養(yǎng)的常規(guī)操作。 固體培養(yǎng)：在培養(yǎng)基中加入一定量的凝固劑（如瓊脂），經(jīng)加熱溶解后，分別裝入培養(yǎng)用的容器中，冷卻后凝結(jié)成固體培養(yǎng)基。,固體培養(yǎng) 優(yōu)點(diǎn)：簡便易行、培養(yǎng)所占空間小 缺點(diǎn)(1)培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的濃度差導(dǎo)致愈傷組織生長不平衡； （2）氣體交換不暢，阻礙了組織呼吸作用的正常進(jìn)行，堆積有害物質(zhì)； （3）細(xì)胞群體不均勻； （4)培養(yǎng)時(shí)需測(cè)定一些生理生化指標(biāo)，此時(shí)需轉(zhuǎn)入液體中，會(huì)改變組織的形態(tài)和生理狀態(tài)。 固體培

11、養(yǎng)最常用的固化劑是：瓊脂，最適濃度為0.6%-1.0%,一般培養(yǎng)溫度為：（251） 需光照，以每天16h為宜。,植物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)主要分為： 1.成批培養(yǎng)：將培養(yǎng)基一次性加入反應(yīng)器中，接種，培養(yǎng)一定時(shí)間后收獲細(xì)胞的操作方式。 最適于植物細(xì)胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器是：氣升式反應(yīng)器。 為避免次級(jí)代謝產(chǎn)物的大量積累，人們?cè)O(shè)計(jì)了兩步培養(yǎng)法，即使用兩個(gè)生物反應(yīng)器。 第一個(gè)用于細(xì)胞生物量的積累 第二個(gè)用于次級(jí)代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)。 日本科學(xué)家用此法成功開發(fā)了第一個(gè)植物細(xì)胞工程商品紫草寧,2.半連續(xù)培養(yǎng) 每隔一天或兩天收獲一部分培養(yǎng)物（最多可達(dá)50%），然后補(bǔ)充等量新鮮培養(yǎng)基。 總體積不變。 3.連續(xù)培養(yǎng) 在投料和接

12、種培養(yǎng)一段時(shí)間后，以一定速度連續(xù)采集細(xì)胞和培養(yǎng)液，并以同樣速度供給新鮮培養(yǎng)基以使細(xì)胞生長環(huán)境長期維持恒定的方法。 該法要維持系統(tǒng)的無菌狀態(tài)，技術(shù)條件比較苛刻。,4.固定化培養(yǎng)（了解） 采用的固定化反應(yīng)器有網(wǎng)狀多孔板、尼龍網(wǎng)套和中孔纖維膜等多種類型。 優(yōu)點(diǎn)（1)細(xì)胞位置固定，易于獲得高密度細(xì)胞群體； （2）易于維持細(xì)胞間物理化學(xué)梯度； （3）有利于細(xì)胞組織化； （4）易于控制培養(yǎng)條件及獲得較高含量的次級(jí)代謝產(chǎn)物。,思考題,一、選擇 1.植物組織培養(yǎng)過程中，獲得外植體后，通常首先要進(jìn)行滅菌，特別使用于草本植物和柔軟組織的滅菌劑是 A.次氯酸鈣 B.次氯酸鈉 C.氯化汞 D.無水乙醇 2.植物細(xì)胞的

13、培養(yǎng)基中常需要加入無機(jī)鹽，下列 屬于大量元素。 A.N、S、P、Mg、Cu B.N、S、K、Zn、Cl C.N、S、Na、Mg、Fe D.N、S、P、Ca、Na 3、植物細(xì)胞培養(yǎng)基中常需要加入維生素。 A.A族 B.B族 C.C族 D.D族,4.植物細(xì)胞培養(yǎng)中有些研究必須在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行，最常用的固化劑是 A.明膠 B.淀粉 C.瓊脂 D.硅膠 5.最適合植物細(xì)胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器是 A.機(jī)械攪拌式 B.氣升式 C.轉(zhuǎn)鼓式 D.鼓泡塔式 6.植物細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用最廣泛的培養(yǎng)基是 A.MEM培養(yǎng)基 B.DMEN培養(yǎng)基 C.BME培養(yǎng)基 D.MS培養(yǎng)基 二、填空 1.植物細(xì)胞培養(yǎng)的最適溫度是，光照以每

14、天為宜。 2.日本科學(xué)家成功開發(fā)的第一個(gè)植物細(xì)胞工程商品是 。 三、名詞解釋 成批培養(yǎng) 連續(xù)培養(yǎng),第五節(jié) 影響植物次級(jí)代謝產(chǎn)物積累的因素,在植物組織培養(yǎng)過程中，影響植物次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)生和累計(jì)的因素有： （1）生物條件：如外植體、季節(jié)、休眠等 （2) 物理?xiàng)l件：如溫度、光、通氣等 （3）化學(xué)條件：如無機(jī)鹽、碳源、維生素等 （4）工業(yè)培養(yǎng)條件：如培養(yǎng)罐類型、通氣等,一、外植體的選擇（了解） 不同外植體的懸浮細(xì)胞，其最大次級(jí)代謝的積累時(shí)間各異。 二、培養(yǎng)條件的影響 1.培養(yǎng)環(huán)境的內(nèi)在因素 （1）接種和誘導(dǎo):次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)率與外植體大小、細(xì)胞密度及營養(yǎng)成分密切相關(guān)。 （2）培養(yǎng)基的組成物質(zhì)基礎(chǔ) P：

15、缺乏磷或較低的含磷量都會(huì)導(dǎo)致生物量下降或次級(jí)代謝產(chǎn)物積累。 N：兩種主要氮源，即NO3和NH4 細(xì)胞的生產(chǎn)能力通常取決于NO3和NH4之比。 Cu：必要元素,（3）碳源 使用最多的碳源是糖類，其影響主要取決于使用的糖類的種類和濃度及其次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成過程。 （4）植物生長調(diào)節(jié)因子 在植物細(xì)胞培養(yǎng)中起關(guān)鍵性作用。但無規(guī)律可循，必須通過反復(fù)實(shí)驗(yàn)才能確定合適的數(shù)量和種類。 （5)O2和PH 02：維持細(xì)胞正常呼吸作用。 可通過攪拌和通氣進(jìn)行調(diào)節(jié) PH:植物細(xì)胞生長最適PH為56之間。,（6）滲出物 取決于營養(yǎng)條件、發(fā)育階段。 2.兩步培養(yǎng)法 培養(yǎng)基的組成是對(duì)細(xì)胞生長與次級(jí)代謝產(chǎn)物的形成最直接、

16、也是最重要的影響因素。結(jié)果顯示，生長培養(yǎng)基用于次級(jí)代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)是非常成功的。但要同時(shí)滿足最佳生長和最佳次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量則較困難。故提出了兩步培養(yǎng)法。,第一步使用適合細(xì)胞生長的培養(yǎng)基目的：為實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的高生產(chǎn)率。 第二步使用適合次級(jí)代謝產(chǎn)物合成的培養(yǎng)基。具有低含量的硝酸鹽和磷酸鹽，并含有較低的糖分和碳源。,3.培養(yǎng)環(huán)境的外部因素 （1）溫度：最佳溫度為2028 （2）攪拌頻率：產(chǎn)率與發(fā)酵罐的攪拌速度有關(guān)。 （3）培養(yǎng)容器的影響：次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生與所用培養(yǎng)容器的大小和攪拌裝置的不同而不同。 （4）光的影響：一個(gè)重要因素 有關(guān)因素：光照時(shí)間的長短、光質(zhì)、光的強(qiáng)度,思考題,一、名詞解釋 兩步培養(yǎng) 二

17、、填空 1.植物細(xì)胞培養(yǎng)中使用最多的碳源是。 2.植物細(xì)胞生長最適溫度為。最適PH為。 3.光照是植物培養(yǎng)的一個(gè)重要影響因素，、對(duì)次級(jí)代謝產(chǎn)物的累計(jì)都有一定的影響。,第六節(jié) 植物細(xì)胞生物反應(yīng)器,主要有五種類型 1.機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器：對(duì)攪拌器加以改進(jìn)。 優(yōu)點(diǎn)：反應(yīng)器內(nèi)的溫度、pH、溶氧及營養(yǎng)物質(zhì)濃度較其他反應(yīng)器更易控制。 2.鼓泡塔式生物反應(yīng)器:通過位于底部的噴嘴及多孔板而實(shí)現(xiàn)氣體分散。 優(yōu)點(diǎn)：沒有運(yùn)動(dòng)部件，操作不易染菌，在無機(jī)械輸入情況下，提供較高的熱量和質(zhì)量傳遞，適于對(duì)剪切力敏感的細(xì)胞的培養(yǎng)，放大相對(duì)容易 缺點(diǎn)：流體流動(dòng)形式難以確定，混合不勻，缺乏相關(guān)數(shù)據(jù)。,3.氣升式生物反應(yīng)器 優(yōu)點(diǎn)：結(jié)構(gòu)簡單，沒有泄露點(diǎn)和死角，可以在低剪切力下達(dá)到較好的混合和較高的氧傳遞效果，不易污染，操作費(fèi)用很低。 缺點(diǎn)：高密度培養(yǎng)時(shí)混合不夠均勻。 4.轉(zhuǎn)鼓式生物反應(yīng)器：通過轉(zhuǎn)動(dòng)促進(jìn)反應(yīng)器內(nèi)的氧及營養(yǎng)物的混合，設(shè)置擋板有助于提高氧的傳遞，在高密度培養(yǎng)時(shí)有高的傳氧能力。 缺點(diǎn)：難于大規(guī)模操作，放大困難。,5.固定化生物反應(yīng)器:前體是細(xì)胞的代謝產(chǎn)物必須分泌到細(xì)胞外。 優(yōu)點(diǎn)：可保護(hù)細(xì)胞免受剪切力； 細(xì)胞可長時(shí)間重復(fù)使用 易于實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的高密度培養(yǎng) 細(xì)胞