組織學(xué)與胚胎學(xué)的研究方法.ppt

1、組織胚胎學(xué)-人體發(fā)育和功能組織學(xué),組胚教研室 王海濤,歡迎大家學(xué)習(xí),組織學(xué)與胚胎學(xué)的早期研究和發(fā)展 現(xiàn)代組織學(xué)與胚胎學(xué)的研究和發(fā)展 我國組織學(xué)和胚胎學(xué)的研究和發(fā)展 組織學(xué)與胚胎學(xué)的研究方法,內(nèi)容提要,組織學(xué)(histology)：研究機(jī)體微細(xì)結(jié)構(gòu)及其相關(guān)功能的科學(xué) 胚胎學(xué)(embryology)：研究個體發(fā)生發(fā)育及其有關(guān)機(jī)制的科學(xué) 基礎(chǔ)：細(xì)胞學(xué) 研究方法：顯微鏡觀察 研究水平：細(xì)胞、亞細(xì)胞 在發(fā)展歷程中，二者的研究內(nèi)容相互交叉和推進(jìn) 組織胚胎學(xué)(histo-embryology)：人體發(fā)育和功能組織學(xué),個體發(fā)生起始于受精卵。 受精卵經(jīng)分裂增殖和細(xì)胞分化，形成多種不同類型的細(xì)胞(cell) 。

2、機(jī)體的一種或幾種細(xì)胞聚集形成一定構(gòu)型的組織(tissue)。組織由細(xì)胞和細(xì)胞間質(zhì)（細(xì)胞外基質(zhì)）組成。組織有多種類型，每種具有一定的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征和相關(guān)的功能?；窘M織有四種：上皮組織、結(jié)締組織、肌組織和神經(jīng)組織。 幾種組織相互結(jié)合，組成器官和系統(tǒng),一、組織學(xué)與胚胎學(xué)的早期研究和發(fā)展,古代-15世紀(jì)解剖學(xué)組織學(xué)胚胎學(xué)的發(fā)展,古代 中醫(yī)書中即有解剖、臟腑的記載。 古希臘對胚胎學(xué)作出了重大貢獻(xiàn)（Hippocrates 和Aristotle）。 前2世紀(jì)，古羅馬醫(yī)生Galen著作中記錄了胃腸、子宮等器官的分層結(jié)構(gòu)，關(guān)于胎兒的形成描述了羊膜、尿囊和胎盤結(jié)構(gòu)。 中世紀(jì)（6-14世紀(jì)） 發(fā)展緩慢。 有些醫(yī)書中

3、可見解剖資料敘述。,近代解剖學(xué)組織學(xué)胚胎學(xué)的發(fā)展,16世紀(jì) 意大利da Vinci繪制700多幅解剖圖，大多數(shù)相當(dāng)準(zhǔn)確。 比利時醫(yī)生Vesalius是現(xiàn)代解剖學(xué)的奠基者，1543年發(fā)表人體的構(gòu)造。 英國Harvey發(fā)現(xiàn)血液循環(huán)，觀察雞胚和哺乳動物胚胎發(fā)生，發(fā)表心血管運(yùn)動論胚胎發(fā)生論，強(qiáng)調(diào)“一切動物皆起源于卵”，認(rèn)為胚胎由子宮分泌,17世紀(jì) 顯微鏡發(fā)明，打開了新的觀察領(lǐng)域。 細(xì)胞發(fā)現(xiàn)。 脾、肺、腎、皮膚等一些器官結(jié)構(gòu)被揭示。 卵泡發(fā)現(xiàn)。 兩棲類卵子人工受精實驗，提出兩性配子的結(jié)合是個體發(fā)生的前提 胚胎學(xué)流行“先成論”，認(rèn)為胚胎是在生殖細(xì)胞中預(yù)先存在的，發(fā)育不過是繼續(xù)長大。,18世紀(jì) 德國人Wol

4、ff用顯微鏡直接觀察胚的發(fā)育，認(rèn)為卵中沒有預(yù)先形成的物質(zhì)，也沒有組織和器官，否定“先成論”，主張胚胎是逐漸分化演變而成的“漸成論”。 清朝王清任1796年寫成醫(yī)林改錯。,19世紀(jì) 法國人Bichat發(fā)現(xiàn)組織(tissue)，1801年發(fā)表膜的研究，將其分為21種。 德國人Mayer于1819年提出histology。 德國人Von Bear提出貝爾定律。 德國Remark在Bear工作基礎(chǔ)上，提出三胚層學(xué)說。 達(dá)爾文1859年發(fā)表物種起源。 德國人Schleiden和Schwann創(chuàng)立細(xì)胞學(xué)說。 奧地利人Mendel于1865年創(chuàng)立細(xì)胞遺傳學(xué)說。 德國人Weismann于19世紀(jì)末提出機(jī)體細(xì)胞

5、有生殖細(xì)胞和體細(xì)胞之說，認(rèn)為生殖細(xì)胞含有決定胚胎細(xì)胞分化為不同組織的“決定子”。,丹麥人Jahanngen于1909年將遺傳因子命名為“gene” 德國人Roux于1887年進(jìn)行分割蛙卵分裂球試驗，開創(chuàng)了實驗胚胎學(xué)研究 His最早制作胚胎連續(xù)切片并進(jìn)行三維重建，研究胚胎各系統(tǒng)和器官的發(fā)育 Golgi于1889年發(fā)明銀染技術(shù)，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的“內(nèi)網(wǎng)器”（高爾基體） Altman于1894年作活體細(xì)胞染色，在多種動物和植物細(xì)胞中看到線粒體 許多重要的細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)在19世紀(jì)中、后期發(fā)現(xiàn)和命名,20世紀(jì)，是現(xiàn)代組織學(xué)和胚胎學(xué)蓬勃發(fā)展的時期，新技術(shù)和新儀器不斷涌現(xiàn)并應(yīng)用于細(xì)胞學(xué)、組織學(xué)、胚胎學(xué)的研究,

6、二、現(xiàn)代組織學(xué)與胚胎學(xué)研究和發(fā)展,三、我國組織學(xué)與胚胎學(xué)研究和發(fā)展,開始于20世紀(jì)初 50年代起，我國組織學(xué)與胚胎學(xué)事業(yè)發(fā)展進(jìn)入一個新的時期 近20多年是我國組織學(xué)與胚胎學(xué)事業(yè)蓬勃發(fā)展、快速進(jìn)步的最佳時期,四、組織學(xué)與胚胎學(xué)的研究方法,一般光學(xué)顯微鏡術(shù) 幾種特殊顯微鏡的應(yīng)用 組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)術(shù) 免疫細(xì)胞化學(xué)術(shù) 原位雜交術(shù) 放射性核素示蹤術(shù),細(xì)胞和細(xì)胞化學(xué)定量術(shù) 電子顯微鏡術(shù) 組織培養(yǎng)術(shù) 細(xì)胞融合術(shù) 顯微外科術(shù),1、一般光學(xué)顯微鏡術(shù),切片制備 石蠟切片：最常用 冷凍切片：常用于酶組織化學(xué)染色 涂片、磨片、鋪片、連續(xù)切片 染色 堿性染料：含氨基、二甲氨基等堿性助色團(tuán)的染料 酸性染料：含有羧基、羥

7、基、磺基等酸性助色團(tuán)的染料 嗜酸性、嗜堿性、中性 最常用的染色方法是蘇木精和伊紅染色法，簡稱HE染色法,2、幾種特殊顯微鏡的應(yīng)用,熒光顯微鏡：用來觀察標(biāo)本中的自發(fā)熒光物質(zhì)或以熒光素染色或標(biāo)記的細(xì)胞和結(jié)構(gòu) 相差顯微鏡：用于觀察組織培養(yǎng)中活細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu) 暗視野顯微鏡：用于觀察因反應(yīng)或分辨力不足的微小顆粒，可分辨0.004-0.2微米的微粒，適用于觀察細(xì)胞內(nèi)線粒體運(yùn)動及標(biāo)本中細(xì)菌等微粒的運(yùn)動 共聚焦激光掃描顯微鏡：可對細(xì)胞的多種功能進(jìn)行全自動、高效、快速微量定性和定量研究等,3、 histochemistry 和 cytochemistry,糖類：顯示多糖和蛋白多糖的常用方法是過碘酸希夫反應(yīng)（PAS

8、反應(yīng)），原理,多糖,醛,紫紅色沉淀,過碘酸,氧化,Schiff,試劑,PAS染色示肝糖元,PAS染色,脂類：包括脂肪和類脂。標(biāo)本用甲醛固定，冷凍切片，脂類保存較好。常用蘇丹染料、油紅O，尼羅藍(lán)等溶于脂類的染料染色 酶：目前有100多種酶組織化學(xué)染色法，基本原理是利用酶對其相應(yīng)底物的水解、氧化等作用，然后再使底物的反應(yīng)產(chǎn)物與某種捕獲劑發(fā)生反應(yīng)，形成沉淀或有色的最終產(chǎn)物，借此檢測該酶在組織切片或細(xì)胞內(nèi)的分布及活性強(qiáng)弱 核酸：顯示DNA的傳統(tǒng)方法是福爾根反應(yīng)(Feulgen reaction)，切片先用稀鹽酸處理，使DNA分子中脫氧核糖與嘌呤之間的聯(lián)接鍵打開，形成醛基，再與希夫試劑作用。原理同PAS

9、反應(yīng)，使細(xì)胞核DNA顯紫紅色,4、immunocytochemistry/immunohistochemistry,是應(yīng)用免疫學(xué)原理，通過抗原與抗體的特異性結(jié)合，顯示組織內(nèi)和細(xì)胞內(nèi)的多肽、蛋白質(zhì)及膜表面抗原和受體等大分子物質(zhì)的存在與分布。這種檢測技術(shù)的特異性強(qiáng)、靈敏度高、應(yīng)用廣泛，是生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的重要研究手段。通常需對已知抗原或抗體進(jìn)行標(biāo)記，用相應(yīng)的顯色和觀察方法檢測目的抗體或抗原。常用的標(biāo)記物有熒光素、鐵蛋白、辣根過氧化物酶等,熒光素標(biāo)記顯示皮膚毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞,免疫組織化學(xué),免疫熒光技術(shù),5、原位雜交技術(shù)(in situ hybridization),是一種核酸分子雜交技術(shù)，通過檢測

10、細(xì)胞內(nèi)mRNA和DNA序列片段，原位研究細(xì)胞合成某種多肽或蛋白質(zhì)的基因表達(dá)。基本原理是用已知堿基序列并具有標(biāo)記物的RNA或DNA片段即核酸探針（nucleic acid probe），與組織切片或細(xì)胞內(nèi)的待測核酸進(jìn)行雜交，通過標(biāo)記物的顯示，在顯微鏡下觀察目的mRNA或DNA的存在與定位。用核酸雜交技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)某一基因在染色體上的定位，稱染色體原位雜交。用核酸雜交技術(shù)檢測某一基因的轉(zhuǎn)錄物mRNA的細(xì)胞定位和轉(zhuǎn)錄狀況，稱細(xì)胞原位雜交,核酸探針：主要有三種 利用大腸桿菌重組帶有目的基因的質(zhì)粒DNA，制成互補(bǔ)DNA探針（cDNA） 應(yīng)用限制性核酸內(nèi)切酶消化制成線性DNA模板，在體外轉(zhuǎn)錄獲得反義RNA

11、探針（cRNA） 依照待測核酸的核苷酸序列，應(yīng)用DNA合成儀合成寡聚核苷酸探針,原位雜交示臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞呈心房鈉尿肽陽性,6、電子顯微鏡術(shù),透射電鏡術(shù)Transmission electron microscopy，TEM,是用電子束穿透標(biāo)本，經(jīng)過電磁場的會聚、放大后，在熒光屏上顯像，或?qū)⒂跋裢渡涞秸障嗟灼?由于電子束穿透力弱，故經(jīng)過固定的電鏡標(biāo)本需制成超薄切片（5080 nm） ，并用重金屬鹽如檸檬酸鉛和醋酸鈾等染色,掃描電鏡術(shù) Scanning electron microscopy，SEM,用于觀察細(xì)胞、組織和器官表面的立體細(xì)微結(jié)構(gòu) 需將小塊組織經(jīng)固定、脫水、干燥后，在其表面噴鍍薄層碳膜

12、和金屬膜 圖像清晰，富有立體感,電鏡掃描圖,肺巨噬細(xì)胞吞噬大腸桿菌,電鏡掃描圖,電鏡圖（冷凍蝕刻）,7、組織培養(yǎng)技術(shù)(tissue culture),是將離體細(xì)胞或組織放置在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境條件下進(jìn)行培養(yǎng)的一種技術(shù)方法，可用以檢測各種理化因子、細(xì)胞因子等對細(xì)胞增殖、分化、代謝、運(yùn)動、吞噬、分泌等生命活動和細(xì)胞行為的影響，還可用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)研究細(xì)胞癌變、逆轉(zhuǎn)的機(jī)制。,子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞,體外培養(yǎng)的大鼠肝細(xì)胞,8、細(xì)胞和細(xì)胞化學(xué)定量術(shù),顯微分光光度定量術(shù)：應(yīng)用顯微分光光度計測定組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)染色標(biāo)本的反應(yīng)強(qiáng)弱，進(jìn)行化學(xué)成分的定量分析 形態(tài)定量術(shù)：運(yùn)用數(shù)學(xué)和統(tǒng)計學(xué)原理對組織和細(xì)胞進(jìn)行二維和三維的形態(tài)測量研究。其中三維立體結(jié)構(gòu)的研究又稱體視學(xué) 流式細(xì)胞術(shù)：應(yīng)用流式細(xì)胞儀對單個細(xì)胞生物化學(xué)和生物物理特性進(jìn)行快速定量測定,流式細(xì)胞術(shù),應(yīng)用流式細(xì)胞儀對單個細(xì)胞進(jìn)行生物化學(xué)和生物物理特性的快速定量測定，可進(jìn)行細(xì)胞周期各時相細(xì)胞的比例和細(xì)胞內(nèi)DNA、RNA、蛋白質(zhì)的含量分析，淋巴細(xì)胞亞群的分離和定量，血細(xì)胞增殖情況的分