分子病理學技術在臨床中應用.ppt

1、分子病理學在臨床醫(yī)學中的應用,分子病理學的誕生,近十幾年來，醫(yī)學獲得了分子生物學理論和實驗的充實，建立起許多完全嶄新的臨床檢驗方法，甚至部分替換某些舊的傳統(tǒng)檢測方法。 從廣度上-擴大了臨床觀察視野 從深度上-達到基因分析境界 分子病理學在此基礎上誕生并發(fā)展起來。分子病理學作為病理學的一個現代分支，為國內外所公認。,分子病理學的發(fā)展,分子病理學的發(fā)展由始即以擁有大量實驗、技術逐日進步為特征，并彼此相輔相成。分子生物學家不熟悉疾病，臨床學家忙于臨床防治疾病，使分子生物學當代理論和實驗及時的引進、提煉并為臨床診斷、認識疾病服務，這一歷史任務，落在病理學工作者的肩上。,病理診斷技術,經典的HE切片觀察

2、 輔助技術 1、特殊染色技術 2、免疫組織化學技術 3、分子生物學技術,病理學歷史：器官細胞分子（分子病理）,超微結構病理學 (Ultrastructural pathology )：E/M觀察,器官（解剖）病理學 (Organ pathology,1761)：肉眼觀察,細胞（組織）病理學 (Cellular pathology,1854)：L/M觀察,免疫病理學 (Immunopathology)：免疫組化,分子病理學（Molecular pathology） 遺傳病理學（Genetic pathology） 定量病理學（Quantitative pathology）,一項覆蓋了9個國家和地

3、區(qū)，1217例病人的泛亞洲科研顯示：沒有相關的靶標卻接受了靶向治療，死亡風險將增加185%。 新英格蘭醫(yī)學雜志.2009.9.v361(10).,“我知道每個患者不一樣，而且需要個體化治療，但我更需要知道他們有何不一樣，如何根據這些不一樣來實施個體化治療?！?一位中國臨床腫瘤醫(yī)生, 2009,分子靶向治療的概念,分子靶向治療是指“針對參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的細胞信號轉導和其他生物學途徑的各種阻抑手段”，其治療靶點可以是細胞表面的生長因子受體或者細胞內信號轉導通路中的重要酶或蛋白。 廣義的分子靶點則包括參與腫瘤細胞分化、分裂、凋亡、遷移、浸潤、淋巴結及全身轉移過程，從DNA 到蛋白水平的任何亞細

4、胞分子。,靶向治療與個性化治療,醫(yī)學分子生物學領域的革命不斷影響著腫瘤的診斷和治療。 在規(guī)范化治療的基礎上逐步發(fā)展為個性（體）化治療。 個性（體）化治療的核心是靶向治療。 分子病理診斷是靶向治療的基礎。,基因診斷的定義,基因診斷是通過直接探查基因的存 在狀態(tài)或缺陷對疾病作出診斷的方法?；?因診斷的探測目的物是DNA或RNA。 DNA-反映了基因的存在狀態(tài) RNA-反映了基因的表達狀態(tài),探查基因的分類,內源基因-機體自身的基因 用于診斷基因有無病變 外源基因-如病毒，細菌等 用于診斷有無病原體感染,分子病理學診斷,分子病理學理論與技術的應用，拓寬了病理診斷的視角，發(fā)展了新的研究領域。分子病理學診

5、斷在指導腫瘤治療中擁有特殊優(yōu)勢，即在組織學的基礎上對腫瘤基因狀態(tài)進行精細的分類和檢測： 1 增加診斷的準確性、改善預后的評估，并指導臨床處理。,2 區(qū)別不同基因類型的病人，設計合理的臨床治療方案。 3 增加藥物的特異性和安全性，最大限度地優(yōu)化治療。 4 識別癌癥易受攻擊部位的信號途徑，選擇藥物的靶點。 5 檢測治療中基因表達的變化，隨時調整治療方案。,相對于其他疾病，腫瘤臨床治療的有效率目前仍然偏低。隨著人類基因組學、藥物基因組學及腫瘤分子生物學研究的不斷深入和發(fā)展，人們對腫瘤多成因、異質性的特點有了更加全面的認識。個體化治療已經成為腫瘤臨床治療的發(fā)展方向和最有效的手段。,但是，如何識別具有相

6、同腫瘤發(fā)生部位、相同病理類型及病期的不同患者之間存在的差異成為實施個體化治療的主要障礙。大量的臨床研究和試驗結果表明：特異腫瘤分子標志物（靶標）是識別患者個體差異的重要依據，實現對這些靶標的檢測是實施腫瘤個體化治療的前提和基礎。,用于識別腫瘤患者個體差異的靶標大致可歸納為三類： 1）腫瘤治療性藥物的作用靶標: 如HER2基因拷貝數和EGFR基因突變； 2）腫瘤藥物代謝相關的靶標: 如UGT1A1和CYP2D6等基因多態(tài)性； 3）腫瘤藥物作用路徑的相關靶標: 如KRAS基因突變和ERCC1基因mRNA表 達水平。,隨著抗腫瘤藥物的不斷增加以及研究的深入，與作用路徑有關的靶標越來越多。檢測也從以前

7、的單一靶標發(fā)展為多靶標聯(lián)合進行。通過針對不同癌種的系統(tǒng)靶標檢測，篩選適合患者個體的藥物，提高治療的針對性和有效率。,分子病理學用于基因診斷的常用手段,原位雜交： CISH(顯色原為雜交)； FISH（包括單色和多色）； SISH（雙標，銀染色）。 DNA序列分析：DNA-SEQUENCING; PCR-RFLP; PCR-SSCP; D-HPLC; 其他: 包括基因芯片、實時定量PCR、 Southern、Western等,常用的靶向藥物,美羅華（利妥昔，Rituximab） 赫賽?。ㄇ字閱慰梗琓rastuzumab） 帕妥珠單抗（Pertuzumab,Omnitarg） 格列衛(wèi)（伊馬替尼，

8、Imatinib） 西妥昔（Cetuxamab） 特羅凱（厄洛替尼，Erlotinib） 易瑞沙（吉非替尼，gefitinib） 貝伐單抗（Bevacizumab）,靶向治療應用較為廣泛的腫瘤,淋巴瘤（CD20陽性） 乳腺癌（HER2陽性） 胃腸間質瘤（CD117/CD34陽性） 肺癌 胃腸癌 隆突性皮膚纖維肉瘤,結直腸癌,愛必妥是抗EGFR（表皮生長因子受體）單克隆抗體（單抗），用于治療結直腸癌的生物靶向治療藥物。 結直腸癌（CRC）屬危害嚴重的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率約占所有惡性腫瘤的1015%，是西方國家導致癌癥相關死亡的第二大疾病。目前，中國CRC發(fā)病也逐年上升速，每年新增病例高達40

9、萬人。 結直腸癌的治療與其它實體腫瘤一樣，治療方法包括手術治療、化療、放療。以化療為例，化療藥物從最初單一的藥物，到聯(lián)合的細胞毒藥物，再到靶向藥物，經歷了一代代革新，對疾病的治療效果也出現突破性的進展。,什么是KRAS基因？KRAS基因跟治療有什么關系？北京腫瘤醫(yī)院消化內科主任琳教授解釋：“它是一個信號傳導重要的路徑，腫瘤信號必然要通過這個途徑進行傳導，傳導完成后，腫瘤細胞才能增值、分化、生存，如果傳導被阻斷，腫瘤細胞就沒有繁殖能力，就要死掉?！?軍事醫(yī)學科學院307醫(yī)院消化腫瘤內科主任徐建明教授：“K-RAS基因檢測則是了解結直腸癌患者癌基因狀況最直接、最有效的方法。只有KRAS基因未發(fā)生突

10、變的患者才適合使用EGFR靶向藥物治療。因此，K-RAS基因檢測可以篩選出EGFR受體靶向藥物治療有效的CRC癌患者，實現患者的個體化治療，從而獲得良好的預后，延長患者的生命。 更為重要的是，檢測能夠幫助早期癥狀不明顯的結直腸癌患者盡早得知病情，實現癌癥的早發(fā)現、早治療，避免錯過最佳治療時機。”,易瑞沙治療肺癌的機理,靶向藥物吉非替尼能夠與EGFR細胞內的ATP結合位點上的三磷酸腺苷競爭,阻斷其酪氨酸激酶活性,進而阻斷EGFR的信號傳導通路,阻礙腫瘤的生長、轉移和血管生成,并可誘導腫瘤細胞的凋亡,血管內皮細胞生長因子VEGF作用機理,內皮抑制素 1 核仁素（nucleolin） 2 整合素（i

11、ntegrin） Endostatin 抑制VEGR誘導的NO合成和內皮細胞遷移，促進凋亡；與pro-MMP2結合，抑制MMP2等。 VEGF-R 通過Ras-Raf-MEK-ERK/MAPK及PI3K-AKT通路,VEGF抑制劑,血管內皮生長因子(VEGF)與VEGF受體，VEGFR-1(FIt-1)和VEGFR-2結合。VEGFR-2的激活是VEGF誘導有絲分裂、血管生成和血管滲透性所必須的。VEGFRs是跨膜受體，在胞漿結構域內具有保守的PTK活性，與配基結合引起VEGFR雙聚體，依次激活激酶的活性和細胞內特異性VEGFR酪氨酸殘基的自動磷酸化。酪氨酸殘基的自動磷酸化進一步增加TK的催化

12、活性，并為胞漿信號傳遞分子提供結合位點。這些細胞內信號蛋白的相互作用，誘導細胞對VEGF反應。,臨床醫(yī)師的機遇與挑戰(zhàn),傳統(tǒng)的病例診斷沒有過時，但要與時俱進！ 目前，是從規(guī)范化治療到個性化治療的過渡時期。 當前我們面臨嚴峻的挑戰(zhàn)和難逢機遇，臨床醫(yī)師不會錯過、發(fā)展的大好機會！,29,FISH技術在臨床中的應用,30,FISH檢測在臨床中的應用,血液病檢測 產前診斷 實體瘤組織檢測,FISH在實體腫瘤應用的目的,個體化治療方案確定 腫瘤診斷 預后判斷,32,腫瘤的形成,細胞內腫瘤相關基因發(fā)生異常（癌細胞） 細胞功能發(fā)生改變 細胞形態(tài)發(fā)生改變 癌細胞不斷異常增殖 腫瘤形成,腫瘤發(fā)生過程,34,從分子水

13、平對疾病的重新認識 不斷提高的診斷技術和不斷積累的臨床實踐 將來的腫瘤治療模式： 以分子病理學診斷為基礎的綜合性靶向治療,分子病理學引起腫瘤治療模式的變化,腫瘤部位（實體）,腫瘤組織,分子病理學,腫瘤的基因類型,在乳腺癌檢測中的應用,我國女性的乳腺癌發(fā)病率為20.1/10萬,GLOBOCAN 2002，IARC。,乳腺癌的流行病學調查,歐美為高發(fā)地區(qū)，發(fā)病率在6080/10萬左右，位列女性惡性腫瘤發(fā)生的第一位，且逐年上升。 而乳癌的死亡率大約占女性惡性腫瘤死亡的15左右，僅次于肺癌（25）。 我國的乳癌發(fā)病率在20/10萬左右，在女性惡性腫瘤中位列第三位，而且發(fā)病率也成逐年上升的趨勢。在一些大

14、城市如上海，1999年的調查顯示，乳癌的發(fā)病率已經達到52.9/10萬。,乳腺癌治療新進展,新的治療理念 劑量密度和劑量強度 新的治療藥物 蒽環(huán)類藥物新的應用 以紫杉醇為代表的傳統(tǒng)藥物 以赫塞汀為代表的靶向藥物,1 = 基因拷貝 2 = mRNA 轉錄 3 = 細胞表面受體 4 = 受體細胞外片斷,正常細胞,腫瘤細胞,Cytoplasm,HER2 受體,Cytoplasmic membrane,Nucleus,HER2 DNA,HER2 mRNA,1,2,3,4,乳腺癌靶向治療,HER-2基因擴增檢測,經驗性處方藥物,現在和將來,藥A,藥C,藥B,傳統(tǒng),綜合性治療合理處方藥物,嘗試、更換,確定

15、、治療,依據不同醫(yī)師的經驗而有治療差異，化費較多時間、金錢和降低生存機會,依據醫(yī)師的診斷而采用靶向性治療，節(jié)約大量時間、金錢和獲取較大生存機會,藥物的選擇應用遺傳藥理學的原理靶向性地選擇藥物,1987著名雜志科學發(fā)表HER2對乳腺癌的意義,HER2 HER2是有別于腫瘤大小、淋巴結及激素受體外的乳腺癌重要預后因子 HER2是腫瘤復發(fā)和生存期長短的獨立預后因子,1998 年美國FDA 批準第一個專門針對p185高表達乳腺癌的抗體治療藥物Herceptin上市,在全世界開創(chuàng)了單抗類分子靶向藥物治療腫瘤的新時代。,HER-2過表達與生物靶向治療, 下調細胞表面的HER一2蛋白 減少血管內皮生長因子的

16、產生 介導對過度表達HER一2的腫瘤細胞的抗體依 賴性細胞毒作用(ADCC) 抑制HER一2蛋白與受體酪氨酸激酶超家族的 其他成員發(fā)生交聯(lián)形成異質二聚體 減弱細胞生長信號的傳遞 通過誘導P27kipi和RB相關蛋白P130而大量減 少s期細胞數目 增強化療所致細胞毒性,赫賽汀(Herceptin)抗腫瘤機制,赫賽汀靶向HER2的人源化單抗,用于治療HER2陽性乳腺癌 生存率提高達45% 療效改善并持續(xù) 生活質量得以改善,95% 人源化, 5% 鼠抗，具有高度親和性 (Kd=0.1nM) 和特異性，顯著降低免疫原性(HAMA),HER2狀態(tài)是選擇赫賽汀的重要指標,Her-2的概況,Her-2:

17、又名C-erbB-2, Her-2/neu 屬于EGFR家族成員 為原癌基因,編碼跨膜型酪氨酸激酶生長因子受體 2530%的乳腺癌為 Her-2基因的擴增/過度表達 Her2基因擴增的乳腺癌被認為對內分泌治療相對不敏感,1.00 0.75 0.50 0.25 0,累計生存率,0 24 48 72 96 120 144,無擴增,擴增,基因擴增: 10 拷貝數 無基因擴增: 3拷貝數 臨界值: 不包括,死亡時間 (月數),Log rank p0.001,Ross JS, Fletcher JA. Stem Cells 1998; 16: 413428,HER-2擴增患者無病生存期縮短,淋巴結陰性,

18、Seshadri R et al. J Clin Oncol 1993;11:193642,100 80 60 40 20 0,0 12 24 36 48 60 72,無病生存概率,死亡時間 (月數),HER2 基因 3 拷貝數,HER2基因 3 拷貝數,對數秩檢驗 p=0.001,淋巴結陽性,HER-2基因擴增檢測,約有25%的乳腺癌病人HER2蛋白呈過度表達。 人類表皮生長因子2，是由原癌基因編碼的HER2受體,HER2在調控正常細胞的生長和發(fā)育和分化中起重要作用。 HER2原癌基因擴增導致HER2受體在細胞表面過度表達。,Ross, J. S. et al. Oncologist 200

19、3;8:307-325,分子靶向治療,赫賽汀(Herceptin)是針對腫瘤細胞Her-2基因靶點的第一個分子靶向藥物，為乳腺癌臨床治療帶來了新的突破。 赫賽汀二線或三線單藥治療總有效率為19%。 一線治療總有效率可達35 %。 中位生存期為24.4個月，且具有良好的耐受性。,HER2 陽性可以預示蒽環(huán)類治療的獲益,K.I. Pritchard 2002.,P = 0.0307,P = 0.58,HER2 陽性 HER2 陰性,MA-5 Trial (CMF vs CEF) DFS by Treatment: FISH+,MA-5 Trial (CMF vs CEF) DFS by Treat

20、ment: FISH-,Pritchard et al NEJM 2006,HER2 陰性,HER2 陽性,paclitaxel,No paclitaxel,paclitaxel,No paclitaxel,HER2陽性可以預示紫杉醇的獲益-CALGB 9344研究,Hayes et al ASCO 2006,Muss, et al. NEJM 1994,HER2 低表達,HER2 過表達,Muss et al, NEJM 1995,CAF密集方案的療效與HER2狀態(tài)密切相關 CALGB 8541,HER-2/neu Predictive Therapeutic Outcome,* - Mus

21、s, H.B. et al, NEJM 330: 1260-1226, 1994.,*,*,使用高劑量的化療藥物(?)對于HER-2/neu（-）患者的病情沒有明顯的改善,HER-2/neu（+）的患者使用高劑量的化療藥物(?)后病情有了明顯的改善,初診時明確HER2的重要性,2000 ASCO建議 2005 St Gallen專家共識建議,Goldhirsch et al 2005,預后評估 預后差,療效預測 從赫賽汀的治療中最大獲益 芳香化酶抑制劑的療效優(yōu)于三苯氧胺 蒽環(huán)類和紫杉類的療效優(yōu)于CMF,內分泌治療 HER2陽性患者相對耐藥 CMF方案 HER2陽性患者相對耐藥 蒽環(huán)類 對大劑量

22、蒽環(huán)類相對敏感 紫杉類藥物 相對敏感,HER2陽性狀態(tài)可以預示腫瘤對常規(guī)治療的反應情況,中國抗癌協(xié)會乳腺癌診治指南與規(guī)范（2007版）,乳腺癌石蠟組織標本,FISH,IHC,0,1+,2+,3+,赫賽汀 內分泌治療 CMF 蒽環(huán)類藥物 紫杉醇,什么是乳腺癌HER-2基因擴增？,HER-2基因定位于17q11.2-q12 由于17號染色體非整倍體造成的HER-2基因增加不是HER-2基因擴增，與赫賽汀治療效果不相關； 只有HER-2基因自身擴增才是真正的HER-2擴增,確認單細胞 在47%的乳腺癌病例中17號染色體發(fā)生倍數的變化 17號染色體非整倍性的擴增的不同提供了分類的必要依據 CSP 17

23、探針同時也是一個內參照,為什么要同時使用CSP17？,HER-2基因擴增示例圖1,HER-2基因擴增示例圖2,HER-2擴增檢測的臨床意義,指導臨床赫賽汀的使用 指導臨床常規(guī)化療藥物的應用 風險預測,TOP2A基因異常檢測TOP2A Aberrations in Breast Cancer,TOP 2A拓撲異構酶,由于TOP2A基因也定位與17q染色體，并且與Her-2基因相隔很近，而且，拓撲異構酶 II 是蒽環(huán)類抗生素的靶酶，因此有推斷稱使用TOP2A基因狀態(tài)來預測患者對含蒽環(huán)類藥物治療方案，更為準確。,什么是TOP2A基因異常?,TOP2A基因定位于17q21.1，是DNA拓撲異構酶的基因

24、 ； TOP2A基因異常包括擴增和缺失兩種情況。,蒽環(huán)類藥物治療的機制,蒽環(huán)類藥物是一種拓撲異構酶抑制劑，研究表明它可能是通過抑制腫瘤細胞DNA拓撲異構酶的活性而抑制腫瘤細胞的分化發(fā)育。,檢測TOP2A基因的意義,TOP2A基因異常的病人預示著更短的無復發(fā)生存期（recurrence-free survival ，RFS）但總生存期并無改變，TOP2A缺失的病人預后更差 由于TOP2A基因也定位與17q染色體，并且與Her-2基因相隔很近，而且，TOP2A基因所編碼的蛋白拓撲異構酶 II 是蒽環(huán)類抗生素的靶酶，研究發(fā)現使用TOP2A基因狀態(tài)來預測患者對含蒽環(huán)類藥物治療方案，更為準確；,檢測TO

25、P2A基因的意義,在對晚期乳腺癌的研究中發(fā)現,Topo 的基因表達和腫瘤細胞對拓撲異構酶抑制劑的敏感性明顯相關TOP2A 基因異常的病人可以明顯受益于含有拓撲異構酶抑制劑的輔助化療方案；TOP2A擴增的病人使用CEF方案進行治療可以降低61%的復發(fā)風險和51%的死亡風險，而沒有TOP2A擴增的患者使用CEF方案只能降低6%的復發(fā)風險和10%的死亡風險。,TOP2A與HER-2的相關性,TOP2A和Her-2/neu原癌基因在染色體上的位置非常鄰近，均定位于17q11.2-22區(qū)域 ； 研究證實，在乳腺癌中Her-2/neu基因擴增又與其鄰近位點上的 TOP2A基因改變呈正相關； 當Her-2/

26、neu基因在乳腺癌中過度表達時，通過多種途徑參與跨膜信號的轉導及促進細胞的增殖，這可能是TOP2A基因擴增的原因 ；,TOP2A與HER-2的相關性,研究表明，對于her-2擴增陽性的乳腺癌患者，使用赫賽汀后會得到更好的預后效果，并且，使用大劑量蒽環(huán)類藥物的治療效果要優(yōu)于常規(guī)劑量的治療效果 ，這可能是由于HER-2與TOP2A的正相關性原因所致； 盡管大部分her-2擴增的患者都存在TOP2A基因的擴增，但并不能使用her-2狀態(tài)來預測TOP2A基因的狀態(tài)；而且，并不是所有存在TOP2A基因擴增的患者都會有topo II 蛋白的高表達，如果使用topo II 蛋白對腫瘤的增生狀態(tài)進行評測，結果

27、將會收到一定的影響,預測含蒽環(huán)類藥物治療方案的療效,Acta Oncologica,2008; 47: 725_734,TOP2A異常，使用恩環(huán)類藥物的RFS和OS比使用CMF的長,CEF,CMF,CEF,CMF,TOP2A基因異常檢測試劑盒臨床意義(一),對患者預后進行判斷,Acta Oncologica,2008; 47: 725_734,正常,擴增,缺失,正常,擴增,缺失,TOP2A基因異常檢測試劑盒臨床意義(二),TOP2A基因異常的患者預后差,預測含蒽環(huán)類藥物治療方案的療效 對患者預后進行判斷,TOP2A基因異常檢測,在膀胱癌中的應用,概述 FISH技術 膀胱癌 FISH探針 方法學

28、 FISH結果分析和判斷,膀胱鏡檢查及細胞形態(tài)學檢測是診斷及監(jiān)測膀胱癌最重要的二種手段。然而，細胞形態(tài)學檢測敏感性低，膀胱鏡檢查病人痛苦，難以接受。從尿液中檢測與膀胱癌發(fā)生相關的抗原雖靈敏性高于細胞形態(tài)學檢測，但特異性較低，不能成為可靠的診斷指標。,概述1,隨著對膀胱癌遺傳學改變的深入研究，人們發(fā)現9號染色體部分（如p16位點）或全部丟失是最常見遺傳學改變，且這一改變與膀胱癌的早期發(fā)生密切相關。此外，膀胱癌的發(fā)展與染色體不穩(wěn)定性也緊密相連，特別是與3號、7號及17號染色體的非整倍性密切相關。目前的臨床研究顯示，對尿液或膀胱沖洗液中細胞進行以上遺傳學改變的檢測對膀胱癌的早期診斷及病程監(jiān)測有很大的

29、價值，其靈敏度高于細胞形態(tài)學檢測，特異性則與細胞形態(tài)學檢測相當。,概述2,檢測以上遺傳學改變標準方法為FISH技術。故在歐美等國，由于尿液檢測的非創(chuàng)傷性及非痛苦性FISH技術已成為排除血尿病人患膀胱癌的最有效的方法之一。 有報道,FISH檢測膀胱癌的靈敏度大約 80%, 特異性大約 96%,概述3,膀胱癌檢測FISH探針,膀胱癌FISH 探針組(一),膀胱癌FISH 探針組(二),FISH 結果分析和判斷,分析方法 閾值建立 結果判斷 臨床意義,分析方法,檢測每組探針在間期細胞中信號.確定結果是否為陽性或陰性,結果判斷,如果檢測值大于閾值(M+3SD),判定為陽性結果 如果檢測值小于閾值(M+

30、3SD), 判定為陰性結果 如果檢測值等于閾值,增加觀測樣本細胞的數量,臨床意義,發(fā)現一種異常,提示被檢測人患膀胱癌可能性較高. 發(fā)現兩種異常或同一種異常的多次出現, 提示被檢測病人患膀胱癌.,在子宮頸癌早期診斷中的應用及治療策略探討,一、宮頸癌的概述及其病因學研究進展,內容介紹,二、宮頸癌致病原因的基礎醫(yī)學研究進展,四、宮頸癌的常用臨床方法應用介紹,五、宮頸癌早期診斷及臨床治療策略,三、臨床檢測TERC基因的意義,一、宮頸癌的概述及其病因學 研究進展,宮頸癌最常見的婦科惡性腫瘤,據世界范圍內統(tǒng)計，每年大約有50萬左右的宮頸癌新發(fā)病例，占所有癌癥新發(fā)病例的5%，其中80%的病例發(fā)生在發(fā)展中國家

31、。我國每年宮頸癌新發(fā)病例約13.15萬，占世界宮頸癌新發(fā)病例總數的28.8% ，發(fā)病率僅次于乳腺癌位居第二。 隨著篩查制度的建立，世界宮頸癌的發(fā)病率和死亡率已經大幅下降。我國由70年代的10.28/10萬下降到90年代的3.25/10萬，但在高發(fā)病區(qū)，死亡率仍高居不下。,生物學因素：如細菌、病毒和衣原體等各種微生物的感染。 行為危險因素：如性生活過早、多個性伴侶、多孕多產、社會經濟地位低下、營養(yǎng)不良及性混亂等； 目前僅有少量研究表明宮頸癌可能存在著家族聚集現象。,子宮頸癌的危險因素,二、宮頸癌致病原因的 基礎醫(yī)學研究進展,*早在十九世紀四十年代，一位意大利醫(yī)生Regoni Stern最早提出結

32、婚與否與宮頸癌的發(fā)生可能有關；*6070年代，人們的主要研究對象是HSV,HCMV等病原體；*1974年zur Hausen首次提出HPV感染與宮頸腫瘤有密切關系；*1977年Laverty在電鏡中觀察到宮頸癌活檢組織中存在人乳頭狀瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）顆粒；*1995年IARC專題討論會：高危型HPV持續(xù)感染是宮頸癌的主要病因。 - 99.7的宮頸癌患者都能發(fā)現高危型HPV感染。,宮頸癌的生物學病因研究進展,HPV的致癌機理,HPV以游離態(tài)感染上皮細胞后，可以持續(xù)存在于染色體外，不引起任何病變，或引起良性病變和低度病變，如尖銳濕疣或輕度不典型增生等。而癌變

33、則與病毒DNA整合入宿主染色體密切相關。 高危型HPV DNA鏈通常在E1或E2的開放讀碼框內斷裂，使HPV DNA整合入染色體脆弱區(qū)。E6和E7具有促進和維持整合狀態(tài)的功能 HPV E6蛋白間接抑制 p53活性，阻礙細胞對DNA損傷的反應。（負向調節(jié)細胞的生長和分化） HPV E7蛋白與pRb結合后使其功能失活，改變細胞周期的正常調控,型別：已發(fā)現100多種不同的亞型（如果DNA序列同源性小于90，則定為新的亞型）。其中超過35種可以感染人類的生殖器官，約30種與腫瘤有關。 1）低危型：宮頸上皮內低度病變，引起外生殖器濕疣等良性性?。℉PV 6、11、42、43、44 ） ； 2）高危型：

34、宮頸上皮內高度病變，與宮頸癌的發(fā)生有關（HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、 52、53、 56、58、59、66、68、73、83、MM4 ）； 分布：有些亞型和地區(qū)、宮頸癌的病理類型有關。 HPV45在非洲西部很常見，HPV39和59在美洲中部和南部常見，HPV52，58在中國常見。 在宮頸鱗狀上皮細胞癌中以HPV16（占51），在腺癌和腺鱗癌中HPV18分別占56和39。,型別與分布,1995年IARC專題討論會：高危型HPV持續(xù)感染是宮頸癌的主要病因。 - 99.7的宮頸癌患者都能發(fā)現高危型HPV感染。,正常婦女,HPV暴露,主要是性傳播 感染幾率：40,HPV,年

35、齡30歲,一過性，80 平均8個月,年齡30歲,平均824個月,CIN I（組織學）,CIN II/III（組織學）,無細胞學改變/HPV消除,子宮頸浸潤癌,機體免疫機制 輔助致癌因素,HPV感染與宮頸病變的自然過程,潛伏感染期 亞臨床感染期 臨床癥狀期 HPV相關腫瘤期,810年,細胞非典型性發(fā)育異常,細胞癌變,阻止細胞正常凋亡,高危型HPV持續(xù)性感染,人類染色體端粒酶基因(hTERC)擴增,致癌基因E6/E7編碼的原癌蛋白表達,TERC基因的擴增可阻止細胞凋亡，導致腫瘤產生,hTERC基因與宮頸癌,hTERC基因是人染色體端粒酶的編碼基因 端粒酶在大多數正常體細胞中無活性，隨著細胞分裂次數

36、 的增加，端?？s短，細胞死亡。 在宮頸癌中，端粒酶活性增加，維持端粒長度，細胞永生 化，免于凋亡，發(fā)生癌變。,子宮頸細胞hTERC位點擴增檢測試劑盒,CSP3,hTERC,hTERC基因定位于3q26.3,3號染色體著絲粒信號,子宮頸細胞hTERC位點擴增檢測試劑盒,三、臨床檢測TERC基因的意義,FISH在宮頸癌診斷中的應用,宮頸癌發(fā)生及發(fā)展階段 正常ASCUSCIN1CIN2CIN3（原位癌）浸潤癌 人類染色體端粒酶（hTERC）基因 ，GLP TERC: 3q26.3,有效進行子宮頸癌前病變的病理分級,以hTERC基因擴增陽性診斷CIN2或CIN2以上病變的 敏感度為82.17%,特異度

37、為95.02%,輔助病理分級,以hTERC基因擴增陽性診斷HSLI以上病 變的敏感性為 92%，特異性為91%。,輔助TBS分級,衛(wèi)生部多中心臨床試驗,FISH檢測子宮頸上皮細胞hTERC基因擴增的臨床應用研究：,本課題全國共86個單位參加。 共檢測8443例宮頸細胞學樣本。 其中7271例有病理結果。,宮頸癌FISH檢測臨床意義,伴有hTERC基因擴增的癌前病變的病人有52%96%的惡變可能。 可預測CIN1/CIN2 向CIN3發(fā)展的風險因素，其靈敏度是100% ， 特異性是 70%. FISH是進行篩查，早期診斷和風險預測的有效手段,(AJP April 2005, Vol. 166,

38、No. 4),明確病理分級：將ASC-US/CIN 1(低度癌前發(fā)育異常)和CIN 2/CIN 3(高度癌前病變)進行區(qū)分，指導臨床治療方案選擇 風險預測，評估癌變可能性：對于CIN 1/CIN 2患者，TERC基因擴增陽性的子宮頸病變患者發(fā)生進展/惡變的可能性超過50% 監(jiān)測癌變的發(fā)生和發(fā)展：對于Ascus以上級病變的隨訪及經leep治療后復發(fā)的監(jiān)測,TERC基因檢測的臨床意義,四、宮頸癌的常用臨床方法 應用介紹,臨床提示，從HPV的持續(xù)感染到一般的宮頸癌前病變并最終發(fā)展為宮頸癌大約需要8-10年。因此，必須采取適當的預防和篩查措施，才能夠阻止宮頸癌的發(fā)生并有望最終消滅宮頸癌。在現代醫(yī)學技術

39、的支持下，婦科醫(yī)生應該大有作為。,篩查是早診早治關鍵,宮頸癌的常規(guī)臨床檢測方法,臨床檢查：如肉眼觀察、陰道鏡等 操作簡便，但準確率和特異性有待提高（50-70） 細胞學檢測：觀察宮頸上皮細胞的變異，常見方法有：巴氏涂 片、LCT、 TCT等（70%以上） 1）長期宮頸糜爛可導致宮頸上皮細胞形態(tài)變異，但非HPV引起的細胞形態(tài)異常與宮頸癌病變沒有直接聯(lián)系。 2）在感染早期，細胞往往不會出現形態(tài)變化，但此時HPV對細胞內遺傳物質的損傷可能已經產生。 病毒學檢測：HPV DNA檢測（PCR方法），常見方法有：基因芯片分型檢測、HC-2、熒光PCR等 特異性強、靈敏度高，操作簡便快捷 (98%) FIS

40、H檢查，尋找癌變前細胞內遺傳物質的改變,五、宮頸癌早期診斷及 臨床治療策略,CIN轉 歸,？,？,CIN （Cervical Intraepithelial Neoplasm)病變的進展,子宮頸癌篩查及診斷程序,FISH,FISH,FISH,陰道鏡檢查結果滿意,隨訪（涂片、HPV）,Asc-us或HPV（+）,連續(xù)二次涂片（-）HPV（-）,合并宮頸糜爛等,陰道鏡檢,每年隨診,物理治療 LEEP,CIN1持續(xù),CIN1消退,進展CIN2/3,TERC（）,TERC（）,CIN/LSIL的處理,TERC（）,TERC（）,陰道鏡不滿意的CIN1患者的處理,TERC（）,TERC（）,陰道鏡不滿意

41、的CIN2患者的處理,檢測TERC基因結果及推薦解決方案,FISH檢測技術在產前、產后診斷中的應用,出生缺陷（birth defects）：是指胚胎或胎兒在發(fā)育過程中發(fā)生解剖學和功能上的異常。 國家人口和計劃生育委員會發(fā)布: 我國每年有2000萬名新生兒，出生缺陷患兒占全部出生人口的4%6%,占全世界500萬出生缺陷兒的1/5。,出生缺陷現狀,其中大約有2.6萬個唐氏綜合癥患兒出生，全部治療要花掉20多億人民幣。 大約有22萬先天性心臟病患兒出生，全部治療，要花掉160多億人民幣,出生缺陷性疾病,染色體病 ：13三體綜合征、18三體綜合征、唐氏綜合癥Turner綜合征（45，X）、克氏綜合癥(

42、47,XXY)等。 單基因遺傳?。貉巡?、假性肥大性肌營養(yǎng)不良等。 多基因遺傳病 ：神經管畸形,可以檢測的疾病,唐氏綜合癥（21 三體） 面部扁平、發(fā)育遲緩、智力低下;2024歲,發(fā)病率1/800 Patau 綜合癥（13 三體） 智力嚴重缺陷，兔唇，易發(fā)心臟??；發(fā)病率1/8000 Edward 綜合癥（18 三體） 早夭，智障，殘指等；發(fā)病率在1/2000到1/8000，第二大染色體疾病 Turner 綜合癥(45，X) 先天性卵巢發(fā)育不全；活產女性新生兒發(fā)病率大約為 1 / 2500 Klinefelter 綜合癥（47，XXY） 先天性睪丸發(fā)育不全,FISH檢測的臨床特點,FISH可以準

43、確且快速的檢測出13、18、21、 X和Y 染 色體的數目異常，24小時出結果。 FISH對樣本要求比較低，不需要細胞培養(yǎng) ，間期細胞即可檢測。,FISH在產前診斷中的應用(一),FISH技術在歐美國家產前診斷中起重要作用，獨立應用FISH檢測占50%，與細胞學互補檢測廣泛應用。 2000年美國醫(yī)學遺傳學院（ACMG）宣布， FISH技術產前診斷結果可靠，與細胞染色體分析價值等同。 2004年英國國立監(jiān)測委員會（UKNSC）建議唐篩高危孕婦，不需要常規(guī)核型分析，單純應用21，18 和13的探針進行FISH診斷。,Prenat Diagn 2001; 21: 293301.,FISH在產前遺傳性

44、疾病中的應用(一),結論：FISH和核型分析相比,檢測結果一致,在50多家產前診斷中心完成有效病例總計5558例。 FISH診斷成功率100%。 核型分析8例羊水細胞培養(yǎng)失敗。 8例羊水細胞培養(yǎng)失敗的病例，經FISH診斷，1例為21-三體，1例為47,XXY，其余6例診斷正常。兩例異常病例后被核實，診斷正確。,FISH在產前遺傳性疾病中的應用(一),衛(wèi)生部多中心臨床試驗,產前染色體數目檢測臨床意義,針對唐氏篩查陽性結果快速檢測。 核型分析和FISH檢測是產前診斷的雙重保險。 用于意外流產的胎兒的流產原因檢測？,FISH熒光原位雜交平臺,-基因檢測有力工具,選擇靶向治療藥物,輔助診斷癌癥,預測疾

45、病惡化風險,膀胱癌：P16基因、3、7、17號染色體數目,非小細胞肺癌：EGFR基因,乳腺癌/胃癌：Her-2基因、TOP2A基因,宮頸癌：TERC基因,多發(fā)性骨髓瘤：P53、IGH、RB1、1q21,慢淋：P53、ATM、RB1、D13S25,急 粒：AML1/ETO、ASS,淋巴瘤：、C-MYC,急/慢粒：BCR/ABL、 PML/RARA融合基因,基因測序技術在臨床中應用,基因測序技術在癌癥基因研究及臨床治療領域的應用將不但使我們能更快速可靠地對癌癥進行診斷, 對其發(fā)生的內在分子機理也將有更深入的了解, 同時也將對癌癥治療藥物的開發(fā)提供極大幫助。,與臨床醫(yī)學及病理密切相關的基因檢測項目,

46、P53 BRCA1 、 BRCA2 APC K-ras ApoE EGFR,C-kit FV YMDD HNPCC片段分析 尿路腫瘤微衛(wèi)星片段分析,P53基因,P53基因定位于17號染色體短臂17p13.1，含有11個外顯子和10個內含子，編碼由393個氨基酸組成 ，分子量為53KD核酸蛋白，包括DNA結合、轉錄和激活結構域。 P53幾乎參與了所有惡性腫瘤和癌變的腫瘤發(fā)生和演進過程。 P53基因病理改變主要有突變、重排、缺失等。突變是主要的致病方式，最常見的突變部位在第59外顯子區(qū)域 。,臨床應用,腫瘤診斷：肝癌、乳癌、膀胱癌、胃癌、腸癌、前列腺癌、肺癌、食道癌、卵巢癌、腦腫瘤、軟組織肉瘤、骨

47、肉瘤、白血病、淋巴瘤。 癌前及癌相關家族：萎縮性胃炎、大腸息肉、腺瘤、宮頸異型增生、乙肝和丙肝、子宮內膜不典型增生、痰、膀胱、糞便中異型細胞、乳腺囊性增生癥及腺病等、骨髓異常增生綜合癥、低惡肉瘤、淋巴造血疾病等。,藥物分子靶點和耐藥基因：P53蛋白丟失，腫瘤細胞侵襲性增強，化療凋亡作用受抑。某些肉瘤如腦腫瘤和癌的分子藥物基因靶點治療和化療效果不佳。檢出P53基因突變，有利于對昂貴且毒副作用大的治療方案進行科學調整，有突變者用P53腺病毒（今又生）治療更有針對性。 臨床預后分析：P53基因突變癌癥患者的生存預期短，易復發(fā)轉移且家族血親之間具腫瘤易感性。,BRCA1基因,BRCA1外顯子約5.2K

48、B全長序列，可分成44項完成全基因組檢測。 BRCA2基因位于13q12-13，BRCA1抑癌基因位于染色體17q21，是目前極受重視與乳腺癌明確相關的易感基因，BRCA癌基因異常者在一生中患乳腺癌的理論概率為100。,臨床應用,腫瘤診斷： BRCA1基因突變：主要為乳腺癌、卵巢癌，同時也有胰腺癌、胃癌、膽囊癌、惡性黑色素瘤、白血病、前列腺癌、子宮癌等。其中60為1-5bp的缺失框移，19為小插入，14為無義突變，也有大缺失或插入及剪接子突變。 伴卵巢癌的乳癌家系約有80%是由BRCA1的異常引起 BRCA2基因突變：主要與家族性乳癌和男性乳癌發(fā)病有關，另也有上述其它系統(tǒng)的惡性腫瘤發(fā)生概率。,

49、癌的分化： BRCA1的突變及雜合子缺失與乳癌的中低分化生物學行為有關，臨床上多表現為期及早晚期患者。 癌前及癥前診斷： 主要用于乳癌、卵巢癌及消化系統(tǒng)癌癥家族患者的基因突變檢測。,APC基因,APC 基因位于第五號染色體的長臂（5q21-22），長達120KB，共有21個外顯子。 APC基因突變主要位于基因中段的第9-11外顯子，其中密碼子第1061，1309的突變占了20%?；颊呖纱涡虬l(fā)生1000個以上的息肉，年齡輕，癌變早。 APC基因前、后段的基因突變與數量較少的小息肉有關，發(fā)病年齡較晚?？砂橛欣w維瘤病，后者與第1444位密碼子突變有關。如在第386和1465位的突變，對野生型APC基

50、因干擾弱，息肉少，發(fā)病年齡較晚。 APC基因突變分為有害（輕，中，重），多態(tài)性，和意義不明性。須結合病理形態(tài)診斷來評估基因突變的臨床病理意義,臨床應用,家族性腺瘤性息肉?。‵AP）：APC致病基因突變，幾乎100%的預示該家族成員的息肉存在（WHO資料）惡變可能，需密切復查腸鏡病理檢查。 Gardner 綜合征： 除了腸腺瘤外，病人還有表皮樣囊腫，骨瘤，牙疾和纖維瘤病。 特克綜合征（Turkot syndrome）：多發(fā)性腸腺瘤伴腦髓母細胞瘤。 減性家族性腺瘤性息肉（Atteneuated FAP）:腺瘤少于100個，發(fā)病晚，癌變率較低。,其他：APC基因突變相關的疾病和腫瘤還有遺傳性大腸癌組

51、織APC基因突變率高達70% -90% 以上，散發(fā)性大腸癌組織中也有30%以上的突變率. 癌組織體細胞APC基因突變，意味著癌變的早期分子事件，腫瘤的亞克隆選擇，去分化惡性演進，浸潤轉移耐藥等生物學行為暫未發(fā)生，預后尚好。 肺癌、胃癌、食道癌、肝癌、乳腺癌等也有不同比例的APC基因突變。,注意事項：,檢查材料主要是腸鏡病理活檢息肉或腫瘤組織，石蠟包埋病變組織，血液等。 APC基因與NHPCC微衛(wèi)星不穩(wěn)定都是早期癌基因檢測互補項目，最好結合應用。 大腸多發(fā)性腺瘤性息肉病APC基因突變測序，也可檢測胃癌，乳腺癌，胰腺癌及癌前病變和少數肉瘤的APC癌基因突變。它反映早期的癌變趨勢。,Ras基因,Ra

52、s基因家族由H-ras、K-ras和N-ras組成。 我們檢測K-RAS最常突變第一外顯子點突變常位于第12、13、59或61密碼子處，不同的ras基因突變在不同的腫瘤中呈優(yōu)勢激活。,臨床應用：,腫瘤診斷： K-ras突變：腸癌、胃癌、胰腺癌、肺癌等為主 H-ras突變：急慢性淋巴造血系腫瘤為主 N-ras突變: 泌尿系腫瘤為主 癌前及家系檢查： 癌前疾病患者ras基因突變提示細胞早期的惡性轉化。 癌病家族受檢者ras基因突變提示正常細胞的惡性演進和癌變。,ApoE基因,APOE（載脂蛋白E）基因位于19q，全長3.7 Kb，含有4個外顯子，產生的APOE功能蛋白是低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白

53、和乳糜微粒受體的配基。既進行脂質代謝，也活化水解脂肪的酶類。 APOE表型異?；颊弑憩F為脂質代謝疾?。ǜ吣懝檀及Y）、心腦血管病、高血壓、肥胖、糖尿病、腦卒中和冠心病、神經再生退行性變（老年性癡呆）和免疫調節(jié)紊亂（橋本甲狀腺功能低下和腫瘤易感）、它汀降脂類耐藥及高血壓耐藥等。,APOE基因在正常人群中呈多態(tài)性表現，即人群中有不同的APOE類型，導致人類發(fā)病種類和危險頻率呈明顯的差異性。 APOE在同一基因座位有三個不同的等位基因（2 3 4）可編碼成三個純合子（2/2 ， 3/3、4/4）和三個雜合子（2/3 、2/ 4 3/4 ），形成6種不同的基因型，從而表現出不同的致病狀態(tài)。 APOE的等位基因中3 頻度最高達60-80， 4 的頻度約10，2 頻度小于10，這正是人類檢測APOE多態(tài)性的目的意義。,臨床應用：,預報老年性癡呆發(fā)病率可能概率，特別是家族性受檢者。 檢查高脂血癥發(fā)病和分型，治療療效和耐藥。 監(jiān)測腦血管病復發(fā)性出血（腦梗塞）并作出警示性預報。 監(jiān)測冠心病發(fā)病狀況。 監(jiān)測糖尿病和腎病發(fā)病狀況。 對原發(fā)性高血壓可評估家族性發(fā)病，治療耐藥及內臟器質損害現象。 對絕經和更年期婦女進行激素替代治療。2 基因者可使總膽固醇明顯升高，故需事先檢測APO