DNA重組技術(shù)的基本工具.ppt

1、專題1 基因工程,題圖： 科技探索之路： 1.1 DNA重組技術(shù)的基本工具 1.2 基因工程的基本操作程序 1.3 基因工程的應(yīng)用 1.4 蛋白質(zhì)工程的崛起,專題1 基因工程,從題圖中可以看出： 1.沃森和克里克對(duì) 結(jié)構(gòu)的重大發(fā)現(xiàn)和隨后的技術(shù)創(chuàng)新孕育了基因工程。 2.在復(fù)制的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)上展示的轉(zhuǎn)基因工程菌、牛、羊、魚、番茄、甜椒、牽?；ǖ龋砹嘶蚬こ倘齻€(gè)重要方面的研究成果：轉(zhuǎn)基因 、轉(zhuǎn)基因 和轉(zhuǎn)基因 。,DNA雙螺旋,微生物,動(dòng)物,植物,綜上所述，基因工程的主題：是指按照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)，通過(guò)體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生

2、物類型和生物產(chǎn)品。由于基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)施工的，因此又叫做DNA重組技術(shù)。,DNA重組技術(shù)或基因拼接技術(shù),生物體外,基因,DNA分子水平,創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。,基因重組,基因工程的概念,體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù),閱讀課本第2-3頁(yè)“科技探索之路”基礎(chǔ)技術(shù)和理論的發(fā)展催生了基因工程！,專題1 基因工程,從科技探索之路中可以看出： 說(shuō)明沒(méi)有 的研究成果，沒(méi)有 的創(chuàng)新發(fā)明，基因工程不可能誕生，也不可能迅速崛起。,基礎(chǔ)理論,技術(shù),DNA的基本組成單位是：脫氧核苷酸,脫氧核苷酸 = 脫氧核糖 + 磷酸 + 含氮堿基,含氮堿基包括：A、T、G、C（四種堿基）

3、,磷酸,脫 氧 核 糖,堿基,鳥嘌呤脫氧核苷酸,胞嘧啶脫氧核苷酸,胸腺嘧啶脫氧核苷酸,腺嘌呤脫氧核苷酸,脫氧核苷酸分子的連接：,磷酸二酯鍵,DNA分子是有 條鏈組成， 盤旋 成 結(jié)構(gòu)。 交替連接，排列在外側(cè)，構(gòu)成基本骨架； 排列在內(nèi)側(cè)。 堿基通過(guò) 連接成堿基對(duì)，并遵循 原則。,反向平行,雙螺旋,脫氧核糖和磷酸,堿基,氫鍵,堿基互補(bǔ)配對(duì),2,DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)模型,基因與DNA的關(guān)系？,基因是有遺傳效應(yīng)的DNA片段， 是生物體遺傳的功能單位和結(jié)構(gòu)單位。,轉(zhuǎn)錄,DNA,RNA,翻譯,蛋白質(zhì),逆轉(zhuǎn)錄,中心法則和中心法則的發(fā)展,復(fù)制,復(fù)制,質(zhì) 粒,質(zhì)粒是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、獨(dú)立于細(xì)菌擬核DNA之外

4、，并具有自我復(fù)制能力的很小的雙鏈環(huán)狀DNA分子。,1.1 DNA重組技術(shù)的基本工具,轉(zhuǎn)基因抗蟲棉,抗蟲棉,普通棉,基因工程培育抗蟲棉的簡(jiǎn)要過(guò)程：,普通棉花(無(wú)抗蟲特性),蘇云金芽孢桿菌,提取,抗蟲基因,棉花細(xì)胞(含抗蟲基因),棉花植株(有抗蟲特性),上述培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟是什么？,重組DNA,導(dǎo)入,形成,基因工程培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟：,關(guān)鍵步驟一：,抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞內(nèi)提取出來(lái),關(guān)鍵步驟二：,形成重組DNA,關(guān)鍵步驟三：,重組DNA導(dǎo)入受體(棉花)細(xì)胞,解決培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟需要哪些工具？,關(guān)鍵步驟一的工具：,關(guān)鍵步驟二的工具：,關(guān)鍵步驟三的工具：,分子手術(shù)刀限制性核酸限制酶,分

5、子縫合針DNA連接酶,分子運(yùn)輸車基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體,自學(xué)導(dǎo)引：,閱讀課本P4P7，完成學(xué)海導(dǎo)航的要點(diǎn)梳理。,大腸桿菌的一種coRI 限制酶能識(shí)別 序列，并在 之間切開。,限制酶,GAATTC,G和A,一.限制性核酸內(nèi)切酶-“分子手術(shù)刀”：,限制性內(nèi)切酶（EcoR）作用過(guò)程,限制酶,什么叫黏性末端？,被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個(gè)伸出的核苷酸，他們之間正好互補(bǔ)配對(duì)，這樣的切口叫黏性末端。,一.限制性核酸內(nèi)切酶-“分子手術(shù)刀”： （1）來(lái)源：主要從原核生物中分離純化出來(lái)。 （2）特點(diǎn)：特異性，即識(shí)別特定核苷酸序列，切割特定切點(diǎn)。（P4） （3）切割后的結(jié)果：產(chǎn)生黏性未端或平末端

6、（4）舉例：大腸桿菌的一種限制酶（EcoR）能識(shí)別GAATTC序列，并在G和A之間切開。,1.1 DNA重組技術(shù)的基本工具,限制酶能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。目前已發(fā)現(xiàn)的限制酶約4000種。,當(dāng)限制酶從識(shí)別序列的中心軸線處切開時(shí)，產(chǎn)生的是平末端。,當(dāng)限制酶從識(shí)別序列的中心軸線兩側(cè)切開時(shí)，產(chǎn)生的是黏性末端。,切割位點(diǎn),和之間,和之間,未端類型,平末端,粘性末端,限制酶所識(shí)別的序列，都可以找到一條中心軸線，中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的。 圖1-1 限制酶識(shí)別序列的中心軸線,思考:限制酶所識(shí)別的序列有什么

7、特點(diǎn)？,1.限制性核酸內(nèi)切酶-“分子手術(shù)刀”： (1)來(lái)源： （2）特點(diǎn)： （3）切割后的形式：2種 分別為：黏性末端和平末端 注：限制性酶是一大類酶，不是一種酶。 限制酶大多可以專一性識(shí)別雙鏈DNA分子上的某種特定核苷酸序列，限制酶所識(shí)別的序列，無(wú)論是6個(gè)堿基還是4個(gè)堿基，都可以找到一條中心軸線，中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ，重復(fù)排列的。,1.1 DNA重組技術(shù)的基本工具,要想獲得某個(gè)特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個(gè)切口？可產(chǎn)生幾個(gè)黏性末端？,要切兩個(gè)切口，產(chǎn)生四個(gè)黏性末端。,如果把兩種來(lái)源不同的DNA用同一種限制酶來(lái)切割，會(huì)怎樣呢？,會(huì)產(chǎn)生相同的黏性末端，然后讓兩者的黏性末端

8、黏合起來(lái)，就似乎可以合成重組的DNA分子了。,例題：,1、下列關(guān)于限制酶的說(shuō)法正確的是（ ） A.限制酶廣泛存在于各種生物中，但微生物中少 B.一種限制酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列 C.不同的限制酶切割DNA后都會(huì)形成黏性末端 D.限制酶的作用部位是特定核苷酸形成的氫鍵,B,想一想: 這類酶在原核生物中起什么作用? 為什么細(xì)菌中限制酶不剪切細(xì)菌本身的DNA？,二、DNA連接酶“分子縫合針”,1.作用： 2.種類：（1）EcoliDNA連接酶 （2）T4DNA連接酶 3.實(shí)例2、見課本P5，圖1-4，回答下列問(wèn)題： （1）EcoR I是一種 酶，其識(shí)別序列是 ，切割位點(diǎn)是 與 之間的 鍵。切割

9、結(jié)果產(chǎn)生的DNA片段末端形式為 。 （2）不同來(lái)源DNA 片段結(jié)合，在這里需要的酶應(yīng)是 連接酶，此酶的作用是在 與 之間形成 鍵而起“縫合”作用的。還有一種連接平末端的連接酶是 。,二. DNA連接酶“分子縫合針”,將雙鏈末端之間的縫隙“縫合”起來(lái),1.作用： 2.種類：（1）EcoliDNA連接酶 （2）T4DNA連接酶,DNA連接酶的作用過(guò)程,想一想:DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎?為什么?,DNA聚合酶：主要是連接DNA片段與單個(gè)脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵，在DNA復(fù)制中起作用。,DNA連接酶：主要是連接DNA片段之間的磷酸二酯鍵，在基因工程中起作用。,DNA聚合酶與DNA連接酶,

10、將單個(gè)核苷酸加到已有的核苷酸片段上,將DNA雙鏈上的兩個(gè)缺口同時(shí)連接起來(lái),形成磷酸二酯鍵,以一條DNA鏈為模板,不需要模板,DNA連接酶和 DNA聚合酶的異同：,基因工程中所用的連接酶有兩種：從大腸桿菌中分離得到的Ecoli連接酶、從T4噬菌體中分離得到的T4連接酶。這兩種酶的催化反應(yīng)基本相同，都是連接雙鏈DNA的缺口，而不能連接單鏈DNA。連接酶和聚合酶的作用都是形成磷酸二酯鍵。 DNA聚合酶只能將單個(gè)核苷酸加到已有的核苷酸片段的3末端的羥基上，形成磷酸二酯鍵；而連接酶是在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵。 DNA聚合酶是以一條DNA鏈為模板，將單個(gè)核苷酸通過(guò)磷酸二酯鍵形成子鏈；而連接酶是將

11、DNA雙鏈上的兩個(gè)缺口同時(shí)連接起來(lái)，因此連接酶不需要模板。 兩者都是由蛋白質(zhì)構(gòu)成的酶，但組成和性質(zhì)各不相同。,三、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體“分子運(yùn)輸車”,1.作用 2.條件 3.種類,1.作為載體沒(méi)有切割位點(diǎn)將怎樣？ 2.假如目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后不能復(fù)制將怎樣？ 3.目的基因是否進(jìn)入受體細(xì)胞，你如何去察覺？ 4.如果載體對(duì)受體細(xì)胞有害將怎樣？,想一想:天然的DNA分子可以直接用作基因工程載體嗎?,三、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體“分子運(yùn)輸車”,1.作用 2.條件 3.種類,1.考慮選用取自霍亂弧菌中的質(zhì)粒來(lái)做載體. 2.用肉眼看不到載體是否真正進(jìn)入，那么如何鑒定？ 3.沒(méi)有一個(gè)或多個(gè)切割位點(diǎn)，能否進(jìn)

12、行DNA的重組. 4.重組DNA不能復(fù)制，就可能怎樣？,能復(fù)制并帶著插入的目的基因一起復(fù)制,有切割位點(diǎn),有標(biāo)記基因的存在，將來(lái)可用含青霉素的培養(yǎng)基鑒別。,質(zhì)粒的存在與否對(duì)宿主細(xì)胞生存沒(méi)有決定性作用，但復(fù)制只能在宿主細(xì)胞內(nèi)成。,既含有抗四環(huán)素基因也含有抗氨芐青霉素基因,只含有抗四環(huán)素基因,只含有抗氨芐青霉素基因,既不含有抗四環(huán)素基因也 不含有抗氨芐青霉素基因,例題:已知標(biāo)記基因有抗四環(huán)素基因和抗氨芐青霉素的基因,現(xiàn)探討某細(xì)菌的質(zhì)粒中有無(wú)標(biāo)記基因或標(biāo)記基因是什么?請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、預(yù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并得出相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)論,三、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體“分子運(yùn)輸車”,1.使用載體的目的：一是用它作為運(yùn)載工具，將目

13、的基因轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中；二是利用它在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行大量的復(fù)制。 2.載體的種類：（1）質(zhì)粒 （2）噬菌體的衍生物 （3）某些動(dòng)植物病毒,3.作為基因工程使用的載體必需滿足以下條件：,1）載體DNA 必需有一個(gè)或多個(gè)限制酶的切割位點(diǎn)，以便目的基因可以插入到載體上。這些供目的基因插入的限制酶的切點(diǎn)所處的位置，還必須是在質(zhì)粒本身需要的基因片段之外，才不至于因目的基因的插入而失活。 2）載體DNA 必須具備自我復(fù)制能力，或整合到受體染色體DNA 上，隨染色體DNA 的復(fù)制而同步復(fù)制。 3）載體DNA必須有標(biāo)記基因，以便重組后進(jìn)行篩選。 4）載體DNA 必須是安全的，不會(huì)對(duì)受體細(xì)胞有害，或不能進(jìn)入到除受

14、體細(xì)胞外的其他生物細(xì)胞中去。 5）載體DNA分子大小應(yīng)適合，以便提取和體外操作。,模擬操作：重組DNA分子的模擬操作,注意：這兩條DNA分子的堿基對(duì)不是隨意亂寫的。 首先，每個(gè)DNA分子上的兩條鏈上的堿基要互補(bǔ)配對(duì)； 第二，每個(gè)DNA分子中每條鏈都存在一個(gè)G-A-A-T-T-C的堿基序列，也就是說(shuō)是EcoRI限制酶的識(shí)別位點(diǎn)，并存在G-A的切割位點(diǎn)。,以下是兩種限制酶切割后形成的DNA片段，試分析： GC AATTC GC CTTAA CG G CG G (1)其中和 是由一種限制酶切割形成的 末端，兩者要重組成一個(gè)DNA 分子，所用DNA連接酶通常是 。 （2） 和 是由另一種限制酶切割形成

15、的 末端，兩者要形成重組DNA片段，所用的連接酶通常是 。,例題,本節(jié)內(nèi)容小結(jié)：,1.知識(shí)梳理： DNA重組技術(shù)的基本工具： 限制酶（分子手術(shù)刀）：識(shí)別特定的核苷酸序列并切割兩核苷酸之間的磷酸二酯鍵； DNA連接酶（分子縫合針）：連接兩核苷酸之間的磷酸二酯鍵； 基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體（分子運(yùn)輸車）：最常用的是細(xì)菌質(zhì)粒，還有噬菌體的衍生物、動(dòng)植物病毒等。,2.方法、技巧、規(guī)律總結(jié)：,限制酶切割的是磷酸二酯鍵，而DNA連接酶連接的正是兩個(gè)斷開此鍵的DNA片段?！胺肿舆\(yùn)輸車”是目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體，它具有的若干特點(diǎn)是基因工程鑒定、選擇、表達(dá)的關(guān)鍵，可以說(shuō)，沒(méi)有它，目的基因即使進(jìn)入受體細(xì)胞，也難以穩(wěn)定保存，更談不上復(fù)制和表達(dá)。 3.思維誤區(qū)提示： DNA連接酶與DNA聚合酶根本不是同類酶，其功能特點(diǎn)大不相同，注意其區(qū)別