第四章-固相析出分離法2013..ppt

1、第四章 固相析出分離法,通過改變?nèi)芤簵l件，使溶質(zhì)以固體形式從溶液中分出的操作技術。 鹽析法 有機溶劑沉淀法 等電點沉淀法 結(jié)晶法,2,第一節(jié) 鹽析法 (salt precipitation),定義：是利用各種生物分子在濃鹽溶液中溶解度的差異，通過向溶液中引入一定數(shù)量的中性鹽，使目的物或雜蛋白以沉淀析出，達到純化目的的方法。 優(yōu)點：簡單、經(jīng)濟、較少變性 缺點：分辨率不高，要除鹽,3,兩種現(xiàn)象： 鹽溶：低鹽情況，鹽離子強度的增高，蛋白質(zhì)溶解度增大。 鹽析：高鹽，鹽離子強度增加，蛋白質(zhì)溶解度減小。,4,溶解度,鹽濃度,Salting-out,Salting-in,一、基本原理,6,原理,形成離子對，

2、部分中和了蛋白質(zhì)的電性，排斥作用減弱而能相互靠攏，聚集起來。 中性鹽的親水性比蛋白質(zhì)大，使蛋白質(zhì)脫去了水化膜，使其沉淀。,7,在鹽析區(qū)，符合公式,logS=-Ks S蛋白質(zhì)溶解度，g/L； 鹽離子強度, Cii離子濃度，mol/L； Zii離子化合價； 常數(shù),為縱坐標上的截距; Ks鹽析常數(shù)。,8,、 KS,為縱坐標上的截距，是外推截距，與無機鹽種類無關,與蛋白質(zhì)的性質(zhì)有關。 KS是鹽析常數(shù)，與蛋白質(zhì)和鹽的種類有關，但與溫度和pH無關。 兩種類型： （1）在一定的pH和溫度下改變離子強度（鹽濃度）進行鹽析，稱作Ks鹽析法。 （2）在一定離子強度下僅改變pH和溫度進行鹽析，稱作鹽析法。,9,方法

3、: A“Ks”分段鹽析法：在一定pH值及溫度下，改變鹽濃度（即I）達到沉淀的目的。 B“”分段鹽析法：在一定I下，改變?nèi)芤旱膒H值及溫度達到沉淀的目的。 C、應用：一般初步分離用第一種方法，進一步純化時用第二種方法。,（一）鹽的性質(zhì) 鹽析能力：半徑小的高價離子在鹽析時的作用較強，陰離子的鹽析效果比陽離子好，尤其以高價陰離子更為明顯。 PO4 3-SO42CH3COOClNO3I NH4+K+Na+Li+ 鹽析用鹽要考慮幾個因素：常用硫酸銨,11,二、影響鹽析的因素,幾種鹽在不同溫度下的溶解度（克/100毫升水）,鹽種類 0 20 80 100 （NH4)2SO4 70.6 75.4 95.3

4、103 Na2SO4 4.9 18.9 43.3 42.2 NaH2PO4 1.6 7.8 93.8 101 硫酸銨在0時的溶解度，遠遠高于其它鹽類。,（二）蛋白質(zhì)濃度,蛋白質(zhì)濃度提高，鹽用量減少。,13,（三）溫度,溫度的變化會影響值。 在無鹽或稀鹽溶液中，大多數(shù)蛋白質(zhì)溶解度是隨溫度升高而增大的，但在高鹽溶液中常相反。,14,（四）pH值,當溶液的pH在蛋白質(zhì)等電點附近時， 值最小。 利用 值最低點時pH的不同，可以分級沉淀蛋白質(zhì).,15,三、鹽析操作,（一）鹽析用鹽的濃度表示 固體粉末工業(yè)常用 硫酸銨飽和溶液實驗室、小規(guī)模 常用“飽和度”來表征硫酸銨在溶液中的最終濃度，25時(NH4)2S

5、O4的飽和濃度為4.1 molL，定義它為100%飽和度。,16,17,（二）鹽析方法和注意事項,1、分部鹽析法 2、重復鹽析法 3、反抽提法 一定的鹽濃度下將目的蛋白夾帶一定量的雜蛋白一同沉淀。 將沉淀用較低濃度鹽溶液平衡，溶出其中的雜蛋白。,18,分部鹽析法,19,反抽提法(RNA聚合酶),20,注意事項,“局部過濃” 溫度 （室溫） 分離方法,21,第二節(jié) 有機溶劑沉淀法 (Organic Solvent Precipitation),定義：向水溶液中加入一定量親水性的有機溶劑，降低溶質(zhì)的溶解度，使其沉淀析出的分離純化方法。,22,1、降低了介質(zhì)的介電常數(shù)，使溶質(zhì)分子之間的靜電引力增加，

6、聚集形成沉淀。 2、水溶性有機溶劑本身的水合作用降低了自由水的濃度，壓縮了親水溶質(zhì)分子表面原有水化層的厚度，降低了它的親水性，導致脫水凝集。,23,一、基本原理,一些溶劑的介電常數(shù),24,優(yōu)點： 乙醇等有機溶劑易除去，產(chǎn)品更純凈；密度差較大，離心收集。 缺點： 容易使蛋白質(zhì)變性，操作常需低溫，成本高，需防火防爆。,25,二、影響沉淀效果的因素,（一）有機溶劑種類及用量 常用的溶劑有乙醇、丙酮、甲醇等。 （二）pH的影響 許多蛋白質(zhì)在等電點附近時溶解度最低，溶液pH應在等電點附近，還須考慮蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。,26,（三）溫度（低溫沉淀） 有機溶劑存在下，大多數(shù)蛋白質(zhì)的溶解度隨溫度降低而顯著地減小。

7、 （四）無機鹽的含量 低鹽：有利于沉淀，還有保護蛋白質(zhì)，防止變性。 高鹽：增大蛋白質(zhì)在有機溶劑水溶液中的溶解度，沉淀物中可能夾帶鹽。,27,多價陽離子，如Ca2+、Zn2+能與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復合物，使蛋白質(zhì)溶解度降低。 胰島素精制：,28,（五）某些金屬離子的助沉淀作用,（六）樣品濃度,濃度小時，增加溶劑投入量和損耗。 濃度大時，增加共沉作用，降低分辨率。 蛋白質(zhì)濃度0.5%2%； 粘多糖濃度1%2%。,29,第三節(jié) 其他沉淀法,一、等電點沉淀法 對于兩性物質(zhì)，等電點時凈電荷為零，分子間排斥電位降低，吸引力增大，能相互聚集起來，發(fā)生沉淀。,30,胰島素純化： 胰島素 pH8 除去堿性雜蛋白 p

8、H3 除去酸性雜蛋白,31,金屬離子沉淀：與生物分子的酸性功能團作用的金屬復合鹽法； 有機酸類復合鹽沉淀:與生物分子的堿性功能團作用的有機酸復合鹽法（如苦味酸鹽、苦酮酸鹽、丹寧酸鹽等）。,32,二、成鹽沉淀法,1金屬離子沉淀： Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Zn2+、Ca2+、Ba2+、Mg2+等； 2有機酸類復合鹽沉淀 （1）丹寧即鞣酸 （2）雷凡諾 （3）三氯乙酸（TCA）,33,雷凡諾,34,豬心提取液 洗脫液 上清液 上清 細胞色素C 沉淀（去除）,35,吸附,人造沸石,鹽析,45%飽和硫酸銨,沉淀,TCA,透析,三、親和沉淀,利用親和反應原理，將配基與可溶性的載體偶聯(lián)后形成

9、載體-配基復合物（親和沉淀劑），該復合物可選擇性地與蛋白質(zhì)結(jié)合，在一定條件下沉淀出來。 中性可溶，酸性沉淀。,36,37,四、高分子聚合物沉淀 水溶性非離子型高分子聚合物，如不同分子量的聚乙二醇（PEG）、葡聚糖、右旋糖苷硫酸酯等，能使蛋白質(zhì)水合作用減弱而發(fā)生沉淀。 五、表面活性劑 十六烷基三甲基季胺溴化物（CTAB） 十六烷基氯化吡啶（CPC）,38,酸性多糖,39,六、選擇性變性沉淀法,熱變性沉淀法 酸堿變性沉淀法 利用試劑（氯仿）,40,第四節(jié) 結(jié)晶(crystallization),溶液中的溶質(zhì)在一定條件下，因分子有規(guī)則的排列而結(jié)合成晶體，晶體的化學成分均一，具有各種對稱的晶體，其特征

10、為離子和分子在空間晶格的結(jié)點上呈規(guī)則的排列。 固體有結(jié)晶和無定形兩種狀態(tài)。 結(jié)晶：析出速度慢，溶質(zhì)分子有足夠時間進行排列，粒子排列有規(guī)則 無定形固體：析出速度快，粒子排列無規(guī)則-沉淀。,41,只有同類分子或離子才能排列成晶體，因此結(jié)晶過程有良好的選擇性。 通過結(jié)晶，溶液中大部分的雜質(zhì)會留在母液中，再通過過濾、洗滌，可以得到純度較高的晶體。 結(jié)晶過程具有成本低、設備簡單、操作方便，廣泛應用于氨基酸、有機酸、抗生素、維生素、核酸等產(chǎn)品的精制。,AFM（原子力顯微鏡）下的抗生素晶體,AFM下的抗生素晶體層,一、結(jié)晶過程,飽和溶液：當溶液中溶質(zhì)濃度等于該溶質(zhì)在同等條件下的飽和溶解度時，該溶液稱為飽和溶

11、液。 過飽和溶液：溶質(zhì)濃度超過飽和溶解度時，該溶液稱之為過飽和溶液。 溶質(zhì)只有在過飽和溶液中才能析出。 溶質(zhì)溶解度與溫度、溶質(zhì)分散度（晶體大小）有關。,凱爾文（Kelvin）公式：,指溶質(zhì)自動從過飽和溶液中析出形成新相的過程。 C2 小晶體的溶解度；C1 普通晶體的溶解度； 晶體密度；M 晶體質(zhì)量； 晶體與溶液間的界面張力； 2 小晶體的半徑； 1 普通晶體的半徑；,46,結(jié)晶過程的實質(zhì),結(jié)晶是指溶質(zhì)自動從過飽和溶液中析出，形成新相的過程。 這一過程不僅包括溶質(zhì)分子凝聚成固體，還包括這些分子有規(guī)律地排列在一定晶格中，這一過程與表面分子化學鍵力變化有關。 因此，結(jié)晶過程是一個表面化學反應過程。,

12、晶體的形成,形成新相（固體）需要一定的表面自由能。因此，溶液濃度達到飽和溶解度時，晶體尚不能析出，只有當溶質(zhì)濃度超過飽和溶解度后，才可能有晶體析出。 首先形成晶核，由Kelvin公式，微小的晶核具有較大的溶解度。實質(zhì)上，在飽和溶液中，晶核是處于一種形成溶解再形成的動態(tài)平衡之中，只有達到一定的過飽和度以后，晶核才能夠穩(wěn)定存在。,過飽和度S：,最先析出的微小顆粒是以后晶體的中心，稱為晶核。,晶體的形成過程： 過飽和溶液的形成 晶核的形成 晶體生長 其中，溶液達到過飽和狀態(tài)是結(jié)晶的前提；過飽和度是結(jié)晶的推動力。,溫度與溶解度的關系,由于物質(zhì)在溶解時要吸收熱量、結(jié)晶時要放出結(jié)晶熱。因此，結(jié)晶也是一個質(zhì)

13、量與能量的傳遞過程，它與體系溫度的關系十分密切。 溶解度與溫度的關系可以用飽和曲線和過飽和曲線表示。,將能夠與固相處于平衡的溶液稱為該固體的飽和溶液。 對于一個平衡體系溫度 和濃度之間有一個確定的關 系，這種關系用溫度濃度 圖來表示，就是一條飽和曲 線。,（飽和區(qū)）,溶解度-溫度圖,53,飽和曲線和過飽和曲線,表 各區(qū)域內(nèi)溶液特性及其與溶質(zhì)晶體關系,二、過飽和溶液的形成,（一）蒸發(fā)法 （二）冷卻法 （三）化學反應結(jié)晶法 （四）鹽析結(jié)晶法 （五）等電點法 （六）復合法 （七）共沸蒸餾結(jié)晶法,55,蒸發(fā)法,是借蒸發(fā)除去部分溶劑的結(jié)晶方法，在常壓或減壓下加熱蒸發(fā)除去一部分溶劑，以達到或維持溶液過飽和

14、度。 此法適用于溶解度隨溫度變化不顯著的物質(zhì)或隨溫度升高溶解度降低的物質(zhì)。 要求物質(zhì)有一定的熱穩(wěn)定性。 適用于小分子化合物的結(jié)晶，蛋白質(zhì)和酶類不 宜采用。,鹽析結(jié)晶法 是生化制藥中應用最多的結(jié)晶方法。其作用是通過向結(jié)晶溶液中引入中性鹽，逐漸降低溶質(zhì)的溶解度使其過飽和，經(jīng)過一定時間后晶體形成并逐漸長大。 引入中性鹽的方法： 1、向溶液中加固體鹽粉末 2、向溶液中加飽和鹽溶液,鹽析結(jié)晶法,58,等電點法,利用蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物大分子在PI時其溶解度最小易沉淀的原理而設計的結(jié)晶法稱為等電點結(jié)晶法。 生物制藥中，常根據(jù)已知大分子溶質(zhì)的pI，調(diào)節(jié)被結(jié)晶溶液的PH在其pI附近，而后與鹽析法、有機溶劑法

15、相結(jié)合，便可得到較滿意的結(jié)晶。,等電點法,60,三、晶核的形成,(1) 初級成核:過飽和溶液中的自發(fā)成核現(xiàn)象。 a 均相成核：沒有外來表面的均相溶液中。 b 非均相成核：外來表面的溶液中。 (2) 二次成核：向介穩(wěn)態(tài)過飽和溶液中加入晶種，會有新晶核產(chǎn)生。 機理: 附著在晶體表面的微小晶體受到剪切作用，或碰撞而脫離晶體，形成新的晶核。,四、晶體的生長,在過飽和溶液中已有晶核形成或加入晶種后，以過飽和度為推動力，晶核或晶種將長大，稱為晶體的生長。 是以濃度差推動力的擴散傳質(zhì)和晶體表面反應（晶格排列）的兩步串連過程。,三、提高晶體質(zhì)量的途徑,工業(yè)上通常希望得到粗大而均勻的晶體，便于過濾與洗滌。 （一）晶體大小 影響晶體大小的主要因素有過飽和度、溫度、攪拌速度、晶種等。,63,（二）晶體形狀 改變晶體外形，可用:選擇不同的溶劑、控制過飽和度、結(jié)晶溫度、調(diào)節(jié)溶液的pH和有目的地加入某種能改變晶形的雜質(zhì)等。 （三）晶體純度 晶體表面具有一定的物理吸附能力。 重結(jié)晶：即