GB 4789.36-2016 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸埃希氏菌O157H7NM檢驗

中華人民共和國國家標準

GB4789.36—2016

食品安全國家標準

食品微生物學檢驗

大腸埃希氏菌O157:

H7

/

NM

檢驗

2016-12-23發(fā)布2017-06-23實施

中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會

國家食品藥品監(jiān)督管理總局

發(fā)布

GB4789.36—2016

Ⅰ

前言

本標準代替GB/T4789.36—2008《食品衛(wèi)生微生物學檢驗大腸埃希氏菌O157:H7/NM檢驗》。

本標準與GB/T4789.

36—2008相比,主要變化如下:

———標準名稱修改為“食品安全國家標準食品微生物學檢驗大腸埃希氏菌O157:H7/NM檢驗”;

———修改了標準的范圍;

———修改了設備和材料;

———修改了培養(yǎng)基和生化反應的文字描述;

———刪除“第二法免疫磁珠捕獲法的原理”;

———刪除“第三法全自動酶聯(lián)熒光免疫分析儀篩選法”;

———刪除“第四法全自動病原菌檢測系統(tǒng)篩選法”。

GB4789.36—2016

1

食品安全國家標準

食品微生物學檢驗

大腸埃希氏菌O157:

H7

/NM檢驗

1范圍

本標準規(guī)定了食品中大腸埃希氏菌O157:H7/NM(EscherichiacoliO157:H7/NM)的檢驗方法。

本標準適用于食品中大腸埃希氏菌O157:H7/NM的檢驗。

2設備和材料

除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設備外,其他設備和材料如下:

2.1恒溫培養(yǎng)箱:36℃±1℃。

2.2冰箱:2℃~5℃。

2.3恒溫水浴箱:46℃±1℃。

2.4天平:感量0.1g、0.01g。

2.5均質(zhì)器。

2.6顯微鏡:10倍~100倍。

2.7無菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或移液器及吸頭。

2.8無菌均質(zhì)杯或無菌均質(zhì)袋:容量500mL。

2.9無菌培養(yǎng)皿:直徑90mm。

2.10pH計或精密

pH試紙。

2.11長波紫外光燈:365nm,功率≤6W。

2.12微量離心管:1.5mL或2.0mL。

2.13磁板、磁板架、樣品混合器。

2.14微生物鑒定系統(tǒng)。

3培養(yǎng)基和試劑

3.1改良EC肉湯(mEC+n):見A.1。

3.2改良山梨醇麥康凱瓊脂(CT-SMAC):見A.2。

3.3三糖鐵瓊脂(TSI):見A.3。

3.4營養(yǎng)瓊脂:見A.4。

3.5半固體瓊脂:見A.5。

3.6月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-MUG(MUG-LST):見A.6。

3.7氧化酶試劑:見A.7。

3.8革蘭氏染色液:見A.8。

3.9PBS-Tween20洗液:見A.9。

3.10亞碲酸鉀(AR級)。

GB4789.36—2016

2

3.11頭孢克肟(Cefixime)。

3.12大腸埃希氏菌O157顯色培養(yǎng)基。

3.13大腸埃希氏菌O157和H7診斷血清或O157乳膠凝集試劑。

3.14鑒定試劑盒。

3.15抗-E.coliO157免疫磁珠。

第一法常規(guī)培養(yǎng)法

4檢驗程序

大腸埃希氏菌O157:H7/NM常規(guī)培養(yǎng)法檢驗程序見圖1。

圖1大腸埃希氏菌O157:H7/NM常規(guī)培養(yǎng)法檢驗程序

5操作步驟

5.1增菌

以無菌操作取檢樣25g(或25mL)加入到含有225mLmEC+n肉湯的均質(zhì)袋中,在拍擊式均質(zhì)

器上連續(xù)均質(zhì)1min~2min;或放入盛有225mLmEC+n肉湯的均質(zhì)杯中,8000r/min~

10000r/min均質(zhì)1min~2min。36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h。

GB4789.36—2016

3

5.2分離

取增菌后的mEC+n肉湯,劃線接種于CT-SMAC平板和大腸埃希氏菌O157顯色瓊脂平板上,

36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h,觀察菌落形態(tài)。在CT-SMAC平板上,典型菌落為圓形、光滑、較小的無色

菌落,中心呈現(xiàn)較暗的灰褐色;在大腸埃希氏菌O157顯色瓊脂平板上的菌落特征按產(chǎn)品說明書進行

判定。

5.3初步生化試驗

在CT-SMAC和大腸埃希氏菌O157顯色瓊脂平板上分別挑取5個~10個可疑菌落,分別接種

TSI瓊脂,同時接種MUG-LST肉湯,并用大腸埃希氏菌株(ATCC25922或等效標準菌株)做陽性對照

和大腸埃希氏菌O157:H7(NCTC12900或等效標準菌株)做陰性對照,于36℃±1℃培養(yǎng)18h~

24h。必要時進行氧化酶試驗和革蘭氏染色。在TSI瓊脂中,典型菌株為斜面與底層均呈黃色,產(chǎn)氣或

不產(chǎn)氣,不產(chǎn)生硫化氫(H2S)。置MUG-LST肉湯管于長波紫外燈下觀察,

MUG陽性的大腸埃希氏菌

株應有熒光產(chǎn)生,MUG陰性的應無熒光產(chǎn)生,大腸埃希氏菌O157:

H7/NM為MUG試驗陰性,無熒

光。挑取可疑菌落,在營養(yǎng)瓊脂平板上分純,于36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h,并進行下列鑒定。

5.4鑒定

5.4.1血清學試驗

在營養(yǎng)瓊脂平板上挑取分純的菌落,用O157和H7診斷血清或O157乳膠凝集試劑作玻片凝集試

驗。對于H7因子血清不凝集者,應穿刺接種半固體瓊脂,檢查動力,經(jīng)連續(xù)傳代3次,動力試驗均陰

性,確定為無動力株。如使用不同公司生產(chǎn)的診斷血清或乳膠凝集試劑,應按照產(chǎn)品說明書進行。

5.4.2生化試驗

5.4.2.1自營養(yǎng)瓊脂平板上挑取菌落,進行生化試驗。大腸埃希氏菌O157:H7/NM生化反應特征見

表1。

表1大腸埃希氏菌O157:H7/NM生化反應特征

生化試驗特征反應

三糖鐵瓊脂底層及斜面呈黃色,H2S陰性

山梨醇陰性或遲緩發(fā)酵

靛基質(zhì)陽性

甲基紅-伏普試驗(MR-VP)

MR陽性,VP陰性

氧化酶陰性

西蒙氏檸檬酸鹽陰性

賴氨酸脫羧酶陽性(紫色)

鳥氨酸脫羧酶陽性(紫色)

纖維二糖發(fā)酵陰性

棉子糖發(fā)酵陽性

MUG試驗

陰性(無熒光)

動力試驗有動力或無動力

GB4789.36—2016

4

5.4.2.2如選擇生化鑒定試劑盒或微生物鑒定系統(tǒng),應從營養(yǎng)瓊脂平板上挑取菌落,用稀釋液制備成濁

度適當?shù)木鷳乙?使用生化鑒定試劑盒或微生物鑒定系統(tǒng)進行鑒定。

5.4.3毒力基因測定(可選項目)

樣品中檢出大腸埃希氏菌O157:H7或O157:NM時,如需要進一步檢測Vero細胞毒素基因的存

在,可通過接種Vero細胞或HeLa細胞,觀察細胞病變進行判定;也可使用基因探針檢測或聚合酶鏈反

應(

PCR)方法進行志賀毒素基因(stx1、stx2)、eae、

hly

等基因的檢測。如使用試劑盒檢測上述基因,應

按照產(chǎn)品的說明書進行。

6結果報告

綜合生化和血清學試驗結果,報告25g(或25mL)樣品中檢出或未檢出大腸埃希氏菌O157:H7

或大腸埃希氏菌O157:NM。

第二法免疫磁珠捕獲法

7檢驗程序

大腸埃希氏菌O157:H7/NM免疫磁珠捕獲法檢驗程序見圖2。

圖2大腸埃希氏菌O157:H7/NM免疫磁珠捕獲法檢驗程序

GB4789.36—2016

5

8操作步驟

8.1增菌

同5.

1。

8.2免疫磁珠捕獲與分離

8.2.1應按照生產(chǎn)商提供的使用說明進行免疫磁珠捕獲與分離。當生產(chǎn)商的使用說明與下面的描述

可能有偏差時,按生產(chǎn)商提供的使用說明進行。

8.2.2將微量離心管按樣品和質(zhì)控菌株進行編號,每個樣品使用1只微量離心管,然后插入到磁板架

上。在漩渦混合器上輕輕振蕩E.

coliO157免疫磁珠混懸液后,用開蓋器打開每個微量離心管的蓋子,

每管加入20μLE.coliO157免疫磁珠懸液。

8.2.3取mEC+n肉湯增菌培養(yǎng)物1mL,加入到微量離心管中,蓋上蓋子,然后輕微振蕩10s。每個

樣品更換1只加樣吸頭,質(zhì)控菌株必須與樣品分開進行,避免交叉污染。

8.2.4結合:在18℃~30℃環(huán)境中,將上述微量離心管連同磁板架放在樣品混合器上轉(zhuǎn)動或用手輕微

轉(zhuǎn)動10min,使E.coliO157與免疫磁珠充分接觸。

8.2.5捕獲:將磁板插入到磁板架中濃縮磁珠。在3min內(nèi)不斷地傾斜磁板架,確保懸液中與蓋子上的

免疫磁珠全部被收集起來。此時,在微量離心管壁中間明顯可見圓形或橢圓形棕色聚集物。

8.2.6吸取上清液:取1支無菌加長吸管,從免疫磁珠聚集物對側深入液面,輕輕吸走上清液。當吸到

液面通過免疫磁珠聚集物時,應放慢速度,以確保免疫磁珠不被吸走。如吸取的上清液內(nèi)含有磁珠,則

應將其放回到微量離心管中,并重復8.

2.5步驟。每個樣品換用1支無菌加長吸管。

免疫磁珠的滑落:某些樣品特別是那些富含脂肪的樣品,其磁珠聚集物易于滑落到管底。在吸取上

清液時,很難做到不丟失磁珠,在這種情況下,可保留50μL~100μL上清液于微量離心管中。如果在

后續(xù)的洗滌過程中也這樣做的話,脂肪的影響將減小,也可達到充分捕獲的目的。

8.2.7洗滌:從磁板架上移走磁板,在每個微量離心管中加入1mLPBS-Tween20洗液,放在樣品混合

器上轉(zhuǎn)動或用手輕微轉(zhuǎn)動3min,洗滌免疫磁珠混合物。重復上述步驟8.

2.5~8.2.7。

8.2.8重復上述步驟8.2.5~8.2.6。

8.2.9免疫磁珠懸浮:移走磁板,將免疫磁珠重新懸浮在100μLPBS-Tween20洗液中。

8.2.10涂布平板:將免疫磁珠混勻,各取50μL免疫磁珠懸液分別轉(zhuǎn)移至CT-SMAC平板和大腸埃希

氏菌O157顯色瓊脂平板一側,然后用無菌涂布棒將免疫磁珠涂布平板的一半,再用接種環(huán)劃線接種平

板的另一半。待瓊脂表面水分完全吸收后,翻轉(zhuǎn)平板,于36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h。

注:若CT-SMAC平板和大腸埃希氏菌O157顯色瓊脂平板表面水分過多時,應在36℃±1℃下干燥10min~

20min,涂布時避免將免疫磁珠涂布到平板的邊緣。

8.3菌落識別

大腸埃希氏菌O157:H7/NM在CT-SMAC平板和大腸埃希氏菌O157顯色瓊脂平板上的菌落特

征同5.

2。

8.4初步生化試驗

同5.

3。

8.5鑒定

同5.

4。

GB4789.36—2016

6

9結果報告

同第6章。

GB4789.36—2016

7

附錄A

培養(yǎng)基和試劑

A.1改良EC肉湯(mEC+n)

A.1.1成分

胰蛋白胨

20.0g

3號膽鹽1.12g

乳糖

5.0g

K2HPO4·7H2O4.0g

KH2PO41.5g

NaCl5.0g

新生霉素鈉鹽溶液(

20mg

/mL)

1.0mL

蒸餾水

1000mL

A.1.2制法

除新生霉素外,所有成分溶解在水中,加熱煮沸,在20℃~25℃下校正

pH

至6.

9±0.1,分裝。于

121℃高壓滅菌15min,備用。制備濃度為20mg/mL的新生霉素儲備溶液,過濾法除菌。待培養(yǎng)基溫

度冷至50℃以下時,按1000mL培養(yǎng)基內(nèi)加1mL新生霉素儲備液,使最終濃度為20mg/L。

A.2改良山梨醇麥康凱(CT-SMAC)瓊脂

A.2.1山梨醇麥康凱(SMAC)瓊脂

A.2.1.1成分

蛋白胨

20.0g

山梨醇

10.0g

3號膽鹽1.5g

氯化鈉

5.0g

中性紅

0.03g

結晶紫

0.001g

瓊脂

15.0g

蒸餾水

1000mL

A.2.1.2制法

除瓊脂、結晶紫和中性紅外,所有成分溶解在蒸餾水中,加熱煮沸,在20℃~25℃下校正

pH

至

7.2±0.2,加入瓊脂、結晶紫和中性紅,煮沸溶解,分裝。于121℃高壓滅菌15min。

A.2.2亞碲酸鉀溶液

A.2.2.1成分

亞碲酸鉀

0.5g

GB4789.36—2016

8

蒸餾水

200mL

A.2.2.2制法

將亞碲酸鉀溶于水,過濾法除菌。

A.2.3頭孢克肟(Cefixime)溶液

A.2.3.1成分

頭孢克肟

1.0mg

95%乙醇200mL

A.2.3.2制法

將頭孢克肟溶解于95%乙醇中,靜置1h待其充分溶解后過濾除菌。分裝試管,儲存于-20℃,有

效期1年。解凍后的頭孢克肟溶液不應再凍存,且在2℃~8℃下有效期14d。

A.2.4CT-SMAC制法

取1000mL滅菌融化并冷卻至46℃±1℃的山梨醇麥康凱(SMAC)瓊脂,加入1mL亞碲酸鉀溶

液和10mL頭孢克肟溶液,使亞碲酸鉀濃度達到2.

5mg

/L,頭孢克肟濃度達到0.

05mg

/L,混勻后傾注

平板。

A.3三糖鐵瓊脂(TSI)

A.3.1成分

蛋白胨

20.0g

牛肉浸膏

5.0g

乳糖

10.0g

蔗糖

10.0g

葡萄糖

1.0g

硫酸亞鐵銨[(NH4)

2Fe(SO4)2·6H2O]0.2g

氯化鈉

5.0g

硫代硫酸鈉

0.2g

酚紅

0.025g或5.0g/L溶液5.0mL

瓊脂

12.0g

蒸餾水

1000mL

A.3.2制法

除酚紅和瓊脂外,將其他成分加于400mL蒸餾水中,煮沸溶解,在20℃~25℃下校正

pH

至7.

4

±0.2。另將瓊脂加于600mL蒸餾水中,煮沸溶解。

將上述兩溶液混合均勻后,加入5%酚紅水溶液5mL,混勻,分裝小號試管,每管約2mL~4mL。

于121°C10min或115°C15min,制成高層斜面。冷卻后呈桔紅色。如不立即使用,在2℃~8℃條

件下可儲存一個月。

GB4789.36—2016

9

A.4營養(yǎng)瓊脂

A.4.1成分

蛋白胨

10.0g

牛肉膏

3.0g

氯化鈉

5.0g

瓊脂

15.0g

蒸餾水

1000mL

A.4.2制法

將各成分溶解于蒸餾水中,加熱煮沸至完全溶解,校正

pH

至7.

4±0.2,分裝。于121℃高壓滅菌

15min。

A.5半固體瓊脂

A.5.1成分

蛋白胨

1.0g

牛肉膏

0.3g

氯化鈉

0.5g

瓊脂

0.3g~0.4g

蒸餾水

100mL

A.5.2制法

將各成分溶解于蒸餾水中,加熱煮沸至完全溶解,校正

pH

至7.

4±0.2,分裝小試管,于121℃高壓

滅菌15min。直立凝固備用。

A.6月桂基硫酸鹽蛋白胨肉湯-MUG(LST-MUG)

A.6.1成分

胰蛋白胨

20.0g

氯化鈉

5.0g

乳糖

5.0g

磷酸氫二鉀(K

2HPO4)2.75g

磷酸二氫鉀(KH2PO4)

2.75g

十二烷基硫酸鈉

0.1g

4-甲基傘形酮-

β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)

0.1g

蒸餾水

1000mL

A.6.2制法

將各成分溶解于蒸餾水中,加熱煮沸至完全溶解,于20℃~25℃下校正

pH

至6.

8±0.2,分裝到帶

有倒管的試管中,每管10mL,于121℃高壓滅菌15min。

GB4789.36—2016

10

A.7氧化酶試劑

A.7.1成分

N,N'-二甲基對苯二胺鹽酸鹽

或N,N,N',N'-四甲基對苯二胺鹽酸鹽

1.0g

蒸餾水

100mL

A.7.2制法

少量新鮮配制,于冰箱內(nèi)避光保存,在7d內(nèi)使用。

A.7.3試驗方法

用無菌棉拭子取單個菌落,滴加氧化酶試劑,

10s內(nèi)呈現(xiàn)粉紅或紫紅色,即為氧化酶試驗