無菌操作技術(shù)原理及實驗

1、無菌操作技術(shù)原理及實驗,無菌操作技術(shù),定義： 指在實驗工作中，控制或防止各類微生物的污染及其干擾的一系列操作方法和有關(guān)措施。,目的： 保證培養(yǎng)物不被環(huán)境中微生物污染； 防止被檢微生物在操作中污染環(huán)境或感染操作人員。,范圍： 微生物無菌操作技術(shù)； 細胞無菌培養(yǎng)。,微生物無菌操作技術(shù)及接種技術(shù),原理： 無菌技術(shù)：指在微生物實驗工作中，控制或防止各類微生物的污染及其干擾的一系列操作方法和有關(guān)措施。 接種：將微生物接到適于它生長繁殖的人工培養(yǎng)基上或活的生物體內(nèi)的過程。,1接種針 2.接種環(huán) 3.接種鉤 4.5.玻璃涂棒 6.接種圈 7.接種鋤 8.小解剖刀,無菌操作材料： 接種工具,無菌器材準備：,滅

2、菌器材：槍頭、玻璃器皿、培養(yǎng)基、無菌衣等進行高壓滅菌處理。,培養(yǎng)基的制備：,目的菌：大腸桿菌 LB培養(yǎng)基：（蛋白胨易吸濕，應(yīng)迅速稱取；稱取一種藥品后，藥匙洗凈擦干后再稱另一種藥品。） pH: 7.4-7.6；（勿調(diào)過頭，以免回調(diào)而影響各離子濃度。） 分裝要求：（分裝時，不要使培養(yǎng)基沾在瓶口，以免玷污瓶塞而引起污染。） 液體：試管：試管高度的1/4； 三角瓶：不超過容積的1/2； 固體：試管：不超過1/5，滅菌后制成斜面； 平皿：15ml。 滅菌條件：121，20min。（溫度時間不宜過高過長，以免破壞營養(yǎng)物質(zhì)） 抗生素的加入：放至50，握緊3s不燙手。 無菌檢查：將滅菌培養(yǎng)基放入37的培養(yǎng)24

3、-48h后觀察。,滅菌方式：,輻射滅菌：60Co-射線，醫(yī)療器械、容器、生產(chǎn)輔助用品、不受輻射破壞的原料藥及成品等。 干熱滅菌法：利用干熱空氣達到殺滅微生物或消除熱原物質(zhì)的方法。 160170*120min 以上、170180*60min 以上或250*45min。 適用于耐高溫但不宜用濕熱滅菌法滅菌的物品滅菌，如玻璃器具、金屬材質(zhì)容器、纖維制品、 固體試藥、液狀石蠟等均可采用本法滅菌。 濕熱滅菌法：熱力滅菌中最有效、應(yīng)用最廣泛。121、30min。藥品、容器、培養(yǎng)基、無菌 衣、膠塞以及其他遇高溫和潮濕不發(fā)生變化或損壞的物品，均可采用本法滅菌。 氣體滅菌法：環(huán)氧乙烷、氣態(tài)過氧化氫、甲醛、臭氧（

4、O3）等。 過濾除菌法：除菌濾膜分親水和疏水，孔徑一般不超過0.22um。過濾器不得對被濾過成分有吸附作用，也不能 釋放物質(zhì)，不得有纖維脫落。 紫外線滅菌：UVC200-300nm，254-257nm滅菌能力最強。 原理：誘導(dǎo)胸腺嘧啶二聚體的形成和DNA鏈的交聯(lián)，從而抑制了DNA的復(fù)制；產(chǎn)生臭氧共同殺菌。,高壓滅菌鍋操作步驟及注意事項：,儀器檢查：儀器擺放在水平地面上，周圍有空隙。 加水：水位至平臺處，不要過多。使用去離子水。 擺放：相互間有適當(dāng)縫隙，有利于蒸汽的穿透，提高滅菌效果。 密封：順時針旋轉(zhuǎn)，直到不到旋轉(zhuǎn)為止。 加熱：打開開關(guān)，檢查溫度和時間。 排氣：打開放氣閥價格你干冷空氣排出。

5、滅菌：干冷空氣排出 后，擰緊閥門。 結(jié)束：關(guān)閉開關(guān)，壓力降至0打開放氣閥排盡余氣后方可打開高壓鍋。,注意： 高壓帶有液體的瓶子時要旋松瓶蓋，防止瓶內(nèi)壓力過大使瓶子碎裂； 包有報紙的物品，立即進行干燥處理。,抗生素的配制及保存：,選用合適溶劑溶解后，0.22um過濾除菌。 氨芐青霉素：-20長期保存，4保存一個月，37保存2-3天。 卡那霉素、四環(huán)素、鏈霉素：-20長期保存，4、37比氨芐保存時間稍長，四環(huán)素避光保存。,無菌環(huán)境的要求與保持：,無菌環(huán)境,無菌室 超凈工作臺（原理：在特定的空間內(nèi)，潔凈空氣（過濾空氣）按 設(shè)定的方向流動而形成的。）,使用前打開紫外燈照射4060分鐘 開啟超凈工作臺工

6、作電源，關(guān)閉紫外燈，并用75%的酒精或0.5%過氧乙酸噴灑擦拭消毒工作臺面。 使用中，有機玻璃罩受到污染，嚴禁用酒精棉球擦拭，請用含水棉布檫拭； 請保持超凈臺整潔、干燥，不要堆積雜物； 使用完畢，關(guān)閉煤氣開關(guān)或酒精燈； 使用完畢后，用消毒液擦拭工作臺面，關(guān)閉工作電源，重新開啟紫外燈照射15分鐘. 定期將初效過濾器拆下清洗，清洗周期一般為3-6個月；高效空氣過濾器的使用期限為十八個月。 定期做無菌試驗，以測定凈化臺是否符合無菌要求。,超凈臺的使用與維護,無菌操作要求：,（1）在操作中不應(yīng)有大幅度或快速的動作； （2）使用玻璃器皿應(yīng)輕取輕放。 （3）在火焰上方操作，水平距離5cm范圍內(nèi)為無菌區(qū)域。

7、 （4）接種用具在使用前、后都必須灼燒滅菌； （5）在接種培養(yǎng)物時，動作應(yīng)輕、準。 （6）不能用嘴直接吸吹吸管。 （7）帶有菌液的吸管、玻片等器材應(yīng)及時置于盛有5%來蘇爾溶液的消毒桶內(nèi)消毒。 （8） 酒精燈使用時，酒精量不超其容積的2/3，也不能少于1/3。,接種技術(shù)：,常用接種方法： 斜面接種 劃線接種 液體接種 穿刺接種,接種的基本程序：, 斜面接種： 從已生長好的菌種斜面上挑取少量菌種移植至另一新鮮斜面培養(yǎng)基上的接種方法。 用于需氧性微生物的接種。,標記：接種前在試管上注明菌名、接種日期、接種人姓名 點燃酒精燈。 接種步驟：,由斜面菌接種到液體培養(yǎng)基（如試管或三角瓶等）中的方法。 意義：

8、質(zhì)粒的擴增，蛋白的大量表達。 操作方法： 與斜面法基本一致，只是在將接種環(huán)送入液體培養(yǎng)基時使環(huán)在液體與 管壁接觸的地方輕輕磨擦，使菌體分散，塞上棉塞再輕輕搖勻。 如果菌種是培養(yǎng)在液體培養(yǎng)基中時，一般用移液管或滴管接種, 液體接種,劃線接種與平板涂布,使混合的細菌呈單個分散生長，形成單個菌落，以便獲得純菌、活菌計數(shù)。 方法： 分區(qū)劃線法：適用于含菌量較多的標本 連續(xù)劃線法：適用于含菌量較少的標本,分區(qū)劃線法,連續(xù)劃線法,注意： 平板倒置放置（防止皿蓋水珠滴在菌落上；重力作用下營養(yǎng)下沉為菌體提供營養(yǎng)）。 平皿底部標注姓名、日期及樣品名，防止平皿較多時錯蓋皿蓋弄亂樣品。,用接種針從菌種斜面上挑取少量

9、菌體并把它穿刺到固體或半固體的深層培養(yǎng)基中的接種方法。 用于厭氣性細菌培養(yǎng)、檢查細菌的運動能力、保藏菌種。 只適宜于細菌和酵母的接種培養(yǎng),穿刺接種,接種步驟： （1）手持試管 （2）旋松棉塞 （3）接種針灼燒滅菌，把在穿刺中可能伸入試管的其他部位也灼燒滅菌 （4）拔出棉塞 （5）取菌：用冷卻接種針的針尖沾取少量菌種 （6）穿刺：將接種針自培養(yǎng)基中心平穩(wěn)、快速垂直刺入培養(yǎng)基，至接近試管 底部，然后沿接種線拔出 （7）塞上棉塞 （8）接種針灼燒滅菌,細胞培養(yǎng),細胞室無菌環(huán)境的保持與維護： 進入細胞室前，在緩沖間換實驗服、換拖鞋；每天早上打掃細胞并紫外照射半小時。 培養(yǎng)箱的使用與維護： 定期滅菌； 按位置擺放細胞瓶，方便查找，以免長時間敞開培養(yǎng)箱； 不準對著打開的培養(yǎng)箱說話，以免培養(yǎng)箱的污染； 細胞從培養(yǎng)箱取出時，擰緊瓶蓋。 細胞放進培養(yǎng)箱時，70%酒精擦拭瓶口； 超凈臺內(nèi)處理細胞時，防止操作人的手及任何物品從細胞瓶口上方經(jīng)過，嚴格在酒精燈附近進行操作。,1. 無菌操作的定義及目的是什么？ 2. 在配制培養(yǎng)基過程中應(yīng)注意哪些問題，為什么？ 3. 如何檢查滅菌后的培養(yǎng)