第02章-酶分析法

1、第2章酶分析，第1節(jié)酶分析的基本知識(shí)，1.1兩種酶分析，1.2酶分析的特征，1.3酶分析的意義，第2章酶分析，第1節(jié)酶分析的基本知識(shí)，第2節(jié)酶活性的測(cè)定，第3節(jié)酶分析，第4節(jié)酶循環(huán)分析，第5節(jié)固定化酶在酶分析中的應(yīng)用。具有蛋白質(zhì)性質(zhì)的酶是高效、高特異性的生物催化劑，與生命活動(dòng)密切相關(guān)。因此，酶學(xué)在生產(chǎn)實(shí)踐的基礎(chǔ)理論研究中起著非常重要的作用。酶分析法是重要內(nèi)容之一，也是目前發(fā)展迅速的一個(gè)領(lǐng)域。酶的選擇性及其在低濃度下催化底物反應(yīng)的能力對(duì)化學(xué)分析非常有用。酶促反應(yīng)已被用于測(cè)定底物、活化劑、抑制劑和酶。在19世紀(jì)中葉，酶被用來(lái)測(cè)定糖類。20世紀(jì)40年代初，沃伯格提出了一種基于還原型輔酶的測(cè)定NAD和

2、NADP的分光光度法。最新進(jìn)展是電化學(xué)方法和熒光方法的應(yīng)用。酶分析已經(jīng)成為公認(rèn)的分析技術(shù)。1.1酶分析的兩種類型是：以酶為分析對(duì)象，根據(jù)需要測(cè)量樣品中的酶含量或活性，這通常稱為“酶活性測(cè)量”。另一種方法是用酶作為分析試劑，測(cè)定樣品中用一般化學(xué)方法難以檢測(cè)的物質(zhì)，如酶的底物、抑制劑、激活劑和輔因子，一般稱為“酶分析法”。雖然這兩種方法的檢測(cè)對(duì)象不同，但其原理和方法都是基于酶能夠特異、高效地催化化學(xué)反應(yīng)，通過(guò)測(cè)量酶的反應(yīng)速度可以檢測(cè)相應(yīng)物質(zhì)的含量。有必要選擇合適的反應(yīng)條件和測(cè)定方法。1.2酶分析的特征選擇性高。原則上，一種酶只能催化一種反應(yīng)，或者只能催化一種特定的化合物或作用于特定的化學(xué)鍵。這是由

3、酶本身的高度特異性決定的。高靈敏度。一般可達(dá)10-7毫升/升.結(jié)合熒光法，最高可達(dá)10-9mol/L.反應(yīng)速度快，條件溫和。大多數(shù)酶促反應(yīng)可以在30分鐘內(nèi)完成。反應(yīng)條件溫和，例如在常溫、常壓和接近中性的酸堿度下，反應(yīng)速度非?？臁Ｃ傅牧亢苌?，所以很經(jīng)濟(jì)。精確度一般。主要是由于微量移液器的誤差，如量低于1ul，取樣誤差較大。這也與組合方式有關(guān)。適用范圍有一定的限制。僅測(cè)定酶、底物、輔酶、激活劑或抑制劑。簡(jiǎn)單程度很差。有必要進(jìn)行酶學(xué)知識(shí)的操作培訓(xùn)，這通常需要最大限度地減少人為錯(cuò)誤并使所有反應(yīng)系統(tǒng)條件盡可能一致。例如樣品添加、溫度、反應(yīng)時(shí)間等。要求準(zhǔn)確。確定最佳反應(yīng)條件(如溫度、酸堿度等)非常重要。)

4、。一個(gè)熟練的酶學(xué)家會(huì)考慮各種因素，設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)是合理的和可重復(fù)的；沒(méi)有受過(guò)特殊訓(xùn)練的人容易犯錯(cuò)誤。1.3酶分析的意義酶的應(yīng)用大致可分為四個(gè)方面：(1)制造某些產(chǎn)品；(2)去除某些物質(zhì)；(3)鑒定化合物；(4)確定物質(zhì)。(1)和(2)被廣泛使用。例如，可的松由酶法生產(chǎn)，奶酪由凝乳酶生產(chǎn)，果汁由果膠酶澄清。(3)和(4)屬于酶分析的范疇。酶分析迅速發(fā)展的原因之一是，由于酶制劑工業(yè)的發(fā)展，可以容易地獲得各種酶制劑。第二個(gè)原因是由于酶應(yīng)用形式的發(fā)展。由于近十年來(lái)酶固定化技術(shù)的快速發(fā)展，酶的重復(fù)和連續(xù)使用成為可能。固定化酶有很多種。一方面，它們與自動(dòng)測(cè)定技術(shù)相結(jié)合，促進(jìn)了自動(dòng)酶分析的快速普及。另一方面，它

5、正在被進(jìn)一步簡(jiǎn)化，或者它可以被制成含有酶的試紙或制成酶試劑包裝出售，可以直接使用例如，用葡萄糖氧化酶(EC1134)測(cè)定血糖是臨床檢查中常用的方法，某些酶的測(cè)定也是臨床診斷的重要指標(biāo)。在第二節(jié)中，酶活性的測(cè)定，2.1酶活性單位和初始反應(yīng)速度，2.2反應(yīng)條件的測(cè)定，2.3測(cè)定方法，1酶活性的概念，2.1酶活性單位和初始反應(yīng)速度，2.1.1酶量通常用酶活性單位表示。酶活單位是指在一定條件下使酶反應(yīng)達(dá)到一定速度所需的酶量。酶含量可以用每克酶制劑或每毫升酶制劑的酶單位數(shù)來(lái)表示。1959年，國(guó)際生物化學(xué)協(xié)會(huì)酶委員會(huì)接受了拉克的建議，采用“國(guó)際單位”來(lái)表示酶的活性。國(guó)際單位：25，最佳酸堿度，最佳底物濃度

6、，每分鐘催化1L底物反應(yīng)的酶量。當(dāng)?shù)孜锸堑鞍踪|(zhì)、多糖等時(shí)。包括可被酶作用的多個(gè)鍵或基團(tuán)，酶單元可通過(guò)催化作用的基團(tuán)或鍵的微小變化來(lái)表達(dá)；對(duì)于反應(yīng)來(lái)說(shuō)，酶單位可以通過(guò)兩微摩爾的來(lái)計(jì)算.1972年，酶委員會(huì)提出了一個(gè)新的單位Katal。在確定的最佳反應(yīng)條件下，每秒鐘催化1摩爾底物變化所需的酶量為1Kat。1Kat=60106IU .在實(shí)際工作中，為了簡(jiǎn)單起見，人們經(jīng)常使用自己習(xí)慣的單位。有時(shí)它甚至可以直接用測(cè)量的物理量來(lái)表示。例如，酶單位表示為光吸收的變化值。當(dāng)估計(jì)酶制劑的純度時(shí)，使用比活性，也就是說(shuō)，當(dāng)酶是高純度的并且酶的分子量和每個(gè)酶分子上的活性中心的數(shù)量已知時(shí)，它可以用分子活性或轉(zhuǎn)化率(TN

7、)來(lái)表示。TN代表在最佳條件下每分鐘每種酶分子或活性中心的催化底物分子(或相關(guān)基團(tuán))的數(shù)量。這個(gè)單位的意思是，它可以用來(lái)估計(jì)和比較酶的催化效率。2.1.2初始反應(yīng)速度酶促反應(yīng)速度可以用單位時(shí)間內(nèi)底物的減少或產(chǎn)物的增加來(lái)表示。“酶反應(yīng)進(jìn)程曲線”可以通過(guò)繪制產(chǎn)物或底物相對(duì)于時(shí)間的變化來(lái)獲得，該曲線的斜率代表酶反應(yīng)速度。酶活性測(cè)定的目的是通過(guò)測(cè)量酶的反應(yīng)速度來(lái)獲得酶的濃度或含量。測(cè)得的反應(yīng)速度和酶濃度之間必須存在線性比例關(guān)系，這是檢驗(yàn)酶反應(yīng)和測(cè)定系統(tǒng)是否合適和正確的標(biāo)準(zhǔn)。2.2反應(yīng)條件的確定選擇反應(yīng)條件的基本要求是所有待測(cè)的酶分子應(yīng)能正常工作。也就是說(shuō)，在反應(yīng)體系中，除了待測(cè)酶的濃度是影響反應(yīng)速度的

8、唯一因素外，其他因素都應(yīng)處于最佳條件。2.2.1基材(包括合成基材)在物理和化學(xué)性質(zhì)上最好不同于產(chǎn)品。一些底物和產(chǎn)物在酶的作用下具有這樣的特性，如脫氫酶的NAD(P)和NAD(P)H；另一些需要處理色源或熒光源的底物，產(chǎn)品在酶作用后會(huì)產(chǎn)生顏色或熒光。例如，對(duì)硝基苯磷酸可用于磷酸酶測(cè)定。底物濃度為了使酶的反應(yīng)速度不受其限制，反應(yīng)體系應(yīng)使用足夠高的底物濃度。標(biāo)準(zhǔn)是Km，例如，s=100Km，因?yàn)樵谶@種情況下反應(yīng)速度可以達(dá)到最大速度的99%。大多數(shù)酶具有相對(duì)特異性。通常，在可被其作用的各種底物中，選擇具有小Km的底物作為測(cè)定的底物。當(dāng)?shù)孜锉憩F(xiàn)出高底物濃度抑制，或具有低溶解度，或毒性，或使用高濃度太昂

9、貴，且沒(méi)有其它合適的底物可替代時(shí)，只能根據(jù)具體條件選擇合適的底物濃度。并測(cè)定了該濃度下酶反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)水平。例如，酵母中的蔗糖受到高蔗糖濃度的抑制，因此通常選擇蔗糖濃度約為5%進(jìn)行測(cè)定，并且反應(yīng)是零級(jí)的。2.例如，乳酸脫氫酶的反應(yīng)在pH 7時(shí)向乳酸形成方向發(fā)展，在pH10時(shí)傾向于形成丙酮酸。在測(cè)定酶活性時(shí)，應(yīng)注意選擇合適的反應(yīng)酸堿度，并將反應(yīng)保持在此范圍內(nèi)。某些酶反應(yīng)的最佳酸堿度可能會(huì)因反應(yīng)溫度和底物濃度而異。例如，堿性磷酸酶在25、30和37時(shí)的最適酸堿度分別為10.3、10.1和9.9。酶反應(yīng)緩沖體系中離子的pK值應(yīng)接近待調(diào)節(jié)的酸堿度。磷酸鹽緩沖液適用于酸堿度低于7.5的反應(yīng)體系，Tris緩

10、沖液適用于酸堿度高于7.5的反應(yīng)體系。甘氨酸-甘氨酸二肽在pH8時(shí)是一個(gè)很好的緩沖體系。不同的緩沖離子可能影響酶的活性水平，甚至最適的酸堿度。緩沖離子也可能與酶活性的主要成分形成復(fù)合物，導(dǎo)致酶活性的抑制。例如，磷酸可以與多價(jià)陽(yáng)離子如Ca2結(jié)合，硼酸可以與各種有機(jī)化合物如呼吸鏈中間體結(jié)合，從而抑制相應(yīng)的酶活性。2.2.3溫度直接影響化學(xué)反應(yīng)本身的速度、酶的穩(wěn)定性、酶的構(gòu)象和酶的催化機(jī)理。如果溫度變化1，速度差異可能超過(guò)10。為了獲得高度可重復(fù)的結(jié)果，溫度變化應(yīng)控制在0.1以內(nèi)。1961年，生化協(xié)會(huì)建議將酶的反應(yīng)溫度定為25，1964年又建議改為30；國(guó)際臨床化學(xué)聯(lián)合會(huì)也推薦30種。然而，許多臨床

11、化學(xué)家經(jīng)常使用37作為酶反應(yīng)溫度。2.2.4輔因子一些酶需要金屬離子，而另一些需要相應(yīng)的輔酶物質(zhì)。在反應(yīng)體系中，我們要滿足酶對(duì)這些輔因子的需求，在添加這些物質(zhì)時(shí)也要注意它們的特異性，有些激活劑在高濃度下可能有抑制作用。為了提高酶在反應(yīng)體系中的穩(wěn)定性，有時(shí)需要一些相應(yīng)的物質(zhì)。例如，巰基乙醇、二硫蘇糖醇等可以加入到巰基酶中。為了防止待測(cè)酶在樣品制備和反應(yīng)過(guò)程中被蛋白酶降解，通常添加蛋白酶抑制劑。2.2.5樣品許多待測(cè)樣品通常包含各種干擾因素，例如可能作用于同一底物或產(chǎn)品的其他酶。因此，在確定之前，有必要檢查系統(tǒng)中是否存在這些干擾因素。同時(shí)，采用不同的測(cè)定方法，同時(shí)檢測(cè)底物和產(chǎn)物的變化，然后觀察測(cè)定

12、結(jié)果是否一致。通過(guò)這些比較分析，確定是否存在干擾。GPT或GOT可以催化氨基的轉(zhuǎn)移。該測(cè)定方法與脫氫酶反應(yīng)相結(jié)合。前者可與乳酸脫氫酶(LDH)偶聯(lián)，后者可與蘋果酸脫氫酶(MDH)偶聯(lián)，然后測(cè)量反應(yīng)過(guò)程中340納米處NADH光吸收的減少。在這些樣品中，如果含有谷氨酸脫氫酶(GluDH)，可能會(huì)發(fā)生干擾。反應(yīng)平衡趨向于形成左旋谷氨酸，這也導(dǎo)致在340納米處光吸收的減少。葡萄糖脫氫酶在正常血清中很少見，但在腦、肝和其他組織中極其豐富。在某些病理?xiàng)l件下，血清中這種酶的活性可能顯著增加。酶反應(yīng)需要NH4，其Km非常大。如果反應(yīng)體系可以避免NH4，這種干擾可以消除。同時(shí)，進(jìn)行了空白試驗(yàn)。2.2.6空白和對(duì)

13、照空白是指由混雜反應(yīng)和自發(fā)反應(yīng)引起的變化，提供未知因素的影響?？瞻字悼梢酝ㄟ^(guò)不添加酶、底物或兩者都添加的反應(yīng)系統(tǒng)獲得，但是酶是預(yù)先失效的。對(duì)照是指用純酶或標(biāo)準(zhǔn)酶制劑測(cè)定的結(jié)果，主要用作比較或校準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)。2.3測(cè)定方法測(cè)量方法包括取樣法和連續(xù)法。取樣方法：在酶反應(yīng)開始后的不同時(shí)間從反應(yīng)體系中取出一定量的反應(yīng)溶液，用適當(dāng)?shù)姆椒ㄍＶ狗磻?yīng)，然后分析產(chǎn)物和底物的化學(xué)性質(zhì)，得到單位時(shí)間內(nèi)酶反應(yīng)的變化量。連續(xù)法：基于th2.3.1光吸收測(cè)量是一種基于產(chǎn)品和基質(zhì)在某一波長(zhǎng)或波段的明顯特征吸收差異的連續(xù)觀察方法。光學(xué)吸收測(cè)量被廣泛使用。幾乎所有的氧化還原酶都可以用這種方法測(cè)定。實(shí)施例1:脫氫酶的輔酶NAD(P)

14、H在340納米處有吸收峰，但氧化形式?jīng)]有。實(shí)施例2:細(xì)胞色素氧化酶的底物是細(xì)胞色素c，其在550納米處的吸收系數(shù)在還原狀態(tài)下為2.81104厘米/摩爾，在氧化狀態(tài)下為0.80104厘米/摩爾。這種光吸收的差異也可用于測(cè)定。一些氧化還原酶很難獲得天然供體和受體，因此可以使用簡(jiǎn)單的人工供體和受體(見下表)。這可以通過(guò)光吸收來(lái)確定-還有那些催化雙鍵飽和或雙鍵形成的酶反應(yīng)，以及那些催化環(huán)狀結(jié)構(gòu)變化的酶反應(yīng)。實(shí)施例1:富馬酸酶催化反應(yīng)，富馬酸在300納米處有很強(qiáng)的光吸收，而蘋果酸沒(méi)有。實(shí)施例2:尿酸氧化酶催化尿酸氧化成尿囊素。尿酸在290納米處被吸收，但尿囊素不被吸收。光吸收法的特點(diǎn)是靈敏度高(可以檢測(cè)

15、到nmol/L水平的變化)，簡(jiǎn)單易行，一般可在短時(shí)間內(nèi)完成測(cè)定。光吸收法被廣泛使用。除上述氧化還原酶外，還有許多激酶(轉(zhuǎn)移酶)、酯酶、肽酶等。在這種方法中被廣泛使用。2.3.2熒光分析如果酶反應(yīng)的底物或產(chǎn)物具有熒光，熒光強(qiáng)度的變化率可用作酶反應(yīng)速度的量度。用這種方法可以測(cè)定兩種酶反應(yīng)：一種是脫氫酶反應(yīng)，另一種是其他反應(yīng)，它們的底物在酶反應(yīng)過(guò)程中有熒光變化。例如，NAD(磷)氫的中性溶液發(fā)出強(qiáng)烈的藍(lán)白色熒光(460納米)，而NAD(磷)不發(fā)出。另一種是使用熒光源底物的酶反應(yīng)。例如，脂肪酶可由二丁基熒光素測(cè)定，二丁基熒光素不發(fā)熒光，但水解后釋放熒光素。熒光分析的優(yōu)點(diǎn)：其靈敏度比光吸收分析高23個(gè)數(shù)

16、量級(jí)，特別適合于酶或底物量極低時(shí)的快速酶分析。與此相關(guān)的是熒光光譜和熒光偏振測(cè)量。近年來(lái)，它們被廣泛用于研究酶的作用機(jī)理。熒光測(cè)量的缺點(diǎn)熒光讀數(shù)和濃度之間沒(méi)有正比關(guān)系。而且往往是由于溫度、散射、儀器等測(cè)定條件。因此，如果你想用一個(gè)確定的單位來(lái)表示酶的活性，你應(yīng)該首先準(zhǔn)備一個(gè)校準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)這個(gè)曲線精確地量化它。這種方法容易受到其他物質(zhì)的干擾。重鉻酸鉀等物質(zhì)經(jīng)常會(huì)奪取能量并降低熒光強(qiáng)度；有些物質(zhì)，如蛋白質(zhì)，可以吸收和發(fā)射熒光，這種干擾在紫外區(qū)特別明顯，所以最好用可見光測(cè)量熒光，特別是紅色熒光。2.3.3電化學(xué)方法具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確度，可與光學(xué)方法相比。測(cè)量系統(tǒng)中有一些物質(zhì)，不會(huì)影響結(jié)果。這

17、種方法需要一定的儀器和設(shè)備。最常見的離子選擇電極法是用玻璃電極測(cè)量酸度的變化?？捎糜诋a(chǎn)酸反應(yīng)的測(cè)定。這種方法操作簡(jiǎn)單，但有兩個(gè)缺點(diǎn)：第一，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，酸堿度會(huì)不斷變化，酶的活性也會(huì)變化；其次，測(cè)量系統(tǒng)的酸堿度取決于介質(zhì)的緩沖能力，而蛋白質(zhì)是一種高緩沖物質(zhì)，待測(cè)的粗樣品往往含有大量的惰性蛋白質(zhì)，因此很難保證恒定的緩沖強(qiáng)度，測(cè)量結(jié)果也很難準(zhǔn)確。連續(xù)滴定或恒酸滴定可以克服上述困難。所謂恒酸滴定是指在反應(yīng)過(guò)程中，不斷向反應(yīng)體系中加入酸或堿以保持酸堿度恒定，反應(yīng)速度由加入酸或堿的速率來(lái)表示。恒酸滴定儀就是為滿足這一需求而設(shè)計(jì)的一種精密測(cè)量?jī)x器。它能自動(dòng)加入酸和堿來(lái)控制酸堿度，并記錄下反應(yīng)時(shí)間可以進(jìn)行選擇