(高清版)DB21∕T 3378-2021 遼寧省松材線蟲病檢驗鑒定技術(shù)規(guī)程　

DB21/T3378—2021遼寧省松材線蟲病檢驗鑒定技術(shù)規(guī)程2021-01-30發(fā)布2021-03-02實施遼寧省市場監(jiān)督管理局發(fā)布I 1 1 1 2 2 3 3 5 6 8 歸口管理部門通訊地址：遼寧省林業(yè)和草原局（沈陽市和平區(qū)太原北街2號），聯(lián)系電話：標(biāo)準(zhǔn)起草單位通訊地址：遼寧省林業(yè)發(fā)展服務(wù)中心（遼寧省林業(yè)和草原有（沈陽市和平區(qū)太原北街2號綜合樓B-6），1遼寧省松材線蟲病檢驗鑒定技術(shù)規(guī)程松材線蟲Bursaphelenchusxylophilus（SteineretBuhrer）Nickle屬于線蟲門（Nematoda側(cè)尾腺綱（Secernentea滑刃目（Aphelenchida滑刃總科（Aphelenchoidoidea滑刃科（Aphelenchoidoidae傘滑亞科（Bursaphelenchinae傘滑刃屬2從表現(xiàn)出異常癥狀的松科植物或松木制品上4.1感病松樹現(xiàn)地取樣方法4.1.1感病松樹典型癥狀4.1.2感病松樹病癥表現(xiàn)時間4.2松木及其制品取樣方法采用貝爾曼漏斗法、淺盤法進行（參見附錄C）。分離時間一般需要4h-12h。將分離液體收集管或者燒杯中，通過自然沉淀或使用離心機處理后得5.2鏡檢5.3培養(yǎng)5.4形態(tài)特征3根據(jù)松材線蟲的形態(tài)特征、松材線蟲和擬松材線蟲形態(tài)5.5檢驗記錄常用的分子生物學(xué)鑒定方法有松材線蟲PCR檢測、松材線蟲自動化分子檢測和實時熒光PCR檢測。4℃恒溫箱，一般在1個月內(nèi)完成分離檢驗。），省級檢驗鑒定機構(gòu)應(yīng)當(dāng)在收到送檢樣品10個工作日內(nèi)出具檢驗鑒定報告報告樣式參見附錄I）檢驗鑒定結(jié)果可能為新增松材線蟲病疫區(qū)和疫點時，省級檢驗鑒定機構(gòu)應(yīng)當(dāng)在檢驗鑒定后3個工作省級檢驗鑒定機構(gòu)每半年需將檢驗鑒定開展情況上報省林業(yè)和草原行政主管部門所屬的防治檢疫45(資料性)松材線蟲形態(tài)特征松材線蟲的雌、雄蟲都呈蠕蟲形，蟲體細長。唇區(qū)高，縊縮明顯，前緣圓?？卺樇氶L，中食道球卵圓形，占體寬的2/3以上。雌蟲陰門寬，上陰唇長，向下覆蓋。尾部末端近圓柱形，尾端橢圓或尾尖突，雄蟲交合刺大，呈弓形，成對，交合刺末端膨大尖突。尾部末端尖，側(cè)面向腹彎曲呈爪狀，端部包裹卵形交合傘。6優(yōu)先抽取尚未完全枯死或剛枯死的松樹。可參照以下特征選擇取樣松如果檢驗有則不需要繼續(xù)取樣，如果沒有要繼續(xù)取樣檢驗，直至全部取樣部之間）、上部（主干與主側(cè)枝交界處）3個部位取樣。對于僅部分枝條表現(xiàn)癥狀的，在其表現(xiàn)癥狀的枝條上取樣。對于樹干內(nèi)發(fā)現(xiàn)媒介昆蟲蛹的，優(yōu)先在蛹室在取樣部位剝凈樹皮，用砍刀或斧頭直接砍取100g-200g木片；或剝凈樹皮，用手搖鉆從木質(zhì)部表面至髓心鉆取100g-200g木屑；或者將枯死松樹伐倒，在取樣部位分別截取2cm厚的圓7原木取樣時在取樣部位剝凈樹皮，直接砍取100g-200g木片；或用手搖鉆從木質(zhì)部至髓心鉆取100g-200g木屑；或分別截取2cm厚的圓盤。松木制品進行取樣時可直接砍取100g-200g木片；或直接帶8(資料性)將樣品去皮后劈成長約1cm-4cm,直徑1cm-3cm的細條或直接取木屑約10g置于漏斗中的面巾紙，如果有氣泡可以松開止水夾放出一些水，沖掉氣泡。室溫不低于20℃,分離浸泡用的水溫在20℃-30℃之間，線蟲游離出一定數(shù)量后可鏡檢，一般需要輕輕打開止水夾，用培養(yǎng)皿或燒杯在橡皮管下接取分離液約10ml;或用離心沉淀管接取分離液C.2淺盤法濕紗布鋪于篩盤上，把樣品劈碎(或木屑)置于篩盤的紗布上，慢慢注入清水，沒過樣品。12h-24h后，漏斗漏斗紗布分離材料乳膠管止水夾9水紗布淺盤忍F督平將線蟲分離液取一滴放在載玻片上，將載玻片在酒精燈火焰上來回移動5s-6s，加熱過度會破壞線蟲體內(nèi)器官或使其表皮熟化變白，影響觀察。也可以將線蟲分離液放在試管中，把試管放在60℃-65℃cinerea)或盤多毛孢（Pestalotiaspp.)，此外用鐮刀孢（F下將盤多毛孢、鐮刀孢或灰葡萄孢接種在PDA平板上，盤多毛孢或鐮刀孢28℃恒溫培養(yǎng)4d-5d，灰葡萄(資料性)前體部特征雄蟲尾部弓形雄蟲尾部交合傘雌蟲尾部指形雌蟲尾部短尾尖突雌蟲陰門擬松材線蟲B.muctonatus(MamiyaetEnda)在形態(tài)學(xué)和生物學(xué)方面都與松材線蟲相似，但分布較類別松材線蟲擬松材線蟲雌蟲尾部圓錐形，末端有明顯的尾尖突，長度在雄蟲尾部交合刺遠端有盤狀突，交合傘為卵形交合刺遠端無盤狀突，交合傘為近方形制作線蟲裂解液(200mmol/LTris-HC1、200mmol/LNaC1、100mmol/LEDTA、2%SDS、G.1.2反應(yīng)體系松材線蟲自動化分子檢測系統(tǒng)48，松材線蟲自動化分子檢測系統(tǒng)1121314151617181DB21/T3378—20G.3.4反應(yīng)程序反應(yīng)混合液在95℃預(yù)變性10min;進入循環(huán)95℃變性15s,60℃運行35s,共35個循環(huán)。G.3.5檢測結(jié)果循環(huán)閾值(Cyclethresholdvalue)Ct值：是在PCR擴增過程中，熒光信號開始由本底進入指數(shù)增長階段的拐點所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)，是實時熒光定量PCR檢測結(jié)果判讀的