移植排斥反應(yīng)ppt課件

1、.,1,移植免疫及相關(guān)問題探討 瑞金醫(yī)院檢驗科 顧志冬,.,2,免疫排斥與器官移植相關(guān)檢驗技術(shù),移植(transplantation):指用自體或異體的正常細(xì)胞、組織或器官置換病變的或功能缺損的細(xì)胞、組織與器官，以維持和重建機(jī)體生理功能的治療方法。 供者（donor） 受者（recipient） 移植物（graft） 移植排斥反應(yīng)（graft rejection）,.,3,目的：救治末期器官衰竭、惡性血液病、 腫瘤以及某些遺傳病。 要求：盡可能讓移植物能在受體體內(nèi)生存 或暫存常時間。 困惑：排斥反應(yīng)、繼發(fā)感染。 策略“immunotolerance”（免疫耐受）， 監(jiān)測和預(yù)防。,.,4,免疫排

2、斥（immune rejection）：指器官、組織或細(xì)胞移植后，受體發(fā)生免疫應(yīng)答，引起針對移植物的免疫損傷而使其喪失功能的一個過程。 表現(xiàn)：hyperacute rejection acute rejection chronic rejection,.,5,移植類型： 1、autologous transplantation自身移植 2、syngeneic transplantation同系移植 3、allogeneic transplantation同種異體、 異基因移植 4、xenogeneic transplantation異種移植 根據(jù)移植物所植部位原位 異位,.,6,.,7,主要內(nèi)

3、容,一、免疫排斥反應(yīng)發(fā)生的機(jī)制 二、移植排斥反應(yīng)的類型 三、移植中的組織配型 四、移植排斥的免疫學(xué)防治 五、干細(xì)胞移植 六、移植排斥的特殊免疫學(xué)問題 七、排斥反應(yīng)的免疫學(xué)檢驗 八、移植后藥物濃度的檢測,.,8,一、免疫排斥反應(yīng)發(fā)生的機(jī)制,（一）移植抗原（transplantation antigen） 1、主要組織相容性抗原 （major histo compatibility antigen，MHA） 又人類白細(xì)胞抗原 （human leukocyte antigen，HLA） 2、次要組織相容性抗原 （minor histo compatibility antigen，mHA） 3、其他同

4、種異型抗原 （血型、不同組織特異性抗原）,.,9,1、主要組織相容性抗原（MHA）：一組存在于各種脊椎動物某對染色體特定區(qū)域的基因群，其編碼的基因產(chǎn)物分布于各種有核細(xì)胞的表面，為重要的細(xì)胞膜抗原，也稱之主要組織相容性復(fù)合體（MHC）。 人和脊椎動物都有各自獨特的MHA。除小鼠 和大鼠有專門命名外，其他種屬的MHA均稱白細(xì)胞抗原（leukocyte antigen，LA）。 （Human leukocyte antigen，HLA）,.,10,HLA：位于人類的第6對染色體的短臂上， 由400萬個堿基組成，分、類（復(fù)雜）。 例 HLA 類基因：HLA-A,-B,-C和-E-H,-X; HLA 類

5、基因：HLA-DP,-DQ,-DR和-DN -DO HLA 類基因：位于HLA-和的之間。 關(guān)于HLA 、類分子的結(jié)構(gòu)（略）。 關(guān)于HLA分型、應(yīng)用與鑒定（后敘）。,.,11,（二）T細(xì)胞識別同種異型抗原的機(jī)制,直接識別 間接識別 同種異型抗原的直接識別和間接識別,.,12,直接識別（direct recognition）：指受者T細(xì)胞直接識別供者抗原遞呈細(xì)胞表面的MHC分子等。（急性、反應(yīng)強(qiáng)） 間接識別（ indirect recognition ）：指受者T細(xì)胞識別經(jīng)過受者抗原遞呈細(xì)胞加工處理的來源供者M(jìn)HC分子的肽。（慢性、弱） direct recognition對環(huán)孢素敏感 indi

6、rect recognition對環(huán)孢素不敏感,.,13,（三）移植排斥反應(yīng)的效應(yīng)機(jī)制,1、超急性排斥反應(yīng)： 時間：幾分、幾時48小時 發(fā)生機(jī)制：預(yù)存于受體的抗移植物抗體隨血 流進(jìn)入移植物，通過與血管內(nèi)皮 細(xì)胞結(jié)合，激發(fā)一系列免疫損傷 應(yīng)答。 過程：補(bǔ)體活化- 血小板黏附聚集- 凝血系統(tǒng) 活化- 血栓形成- 缺血性壞死 血型不符、多次妊娠、反復(fù)輸血、移植過,.,14,2、急性排斥反應(yīng)： 時間：數(shù)周數(shù)月內(nèi) 機(jī)制：殘留于供體移植物中的APC對受體的 免疫系統(tǒng)提供最初的抗原性刺激，激 活免疫應(yīng)答（direct path） 通過受體的APC對移植物抗原的識別 后，再刺激并激活免疫應(yīng)答反應(yīng) （indir

7、ect path） 分類：急性體液排斥反應(yīng)/急性細(xì)胞排斥反應(yīng),.,15,1）急性體液排斥反應(yīng)： （急性脈管排斥反應(yīng)），主要由抗內(nèi)皮細(xì)胞表面HLA分子的抗體所介導(dǎo)，不引起血栓，出現(xiàn)移植組織和器官的血管炎。對免疫移植劑治療無效，被迫切除移植物。 2）急性細(xì)胞排斥反應(yīng)： （加速性細(xì)胞排斥反應(yīng)），發(fā)生此類反應(yīng)患者的血液中，可以有抗供者的抗體，但不一定引發(fā)急性脈管排斥反應(yīng)，卻以移植組織或器官實質(zhì)性損害、壞死為主，伴淋巴細(xì)胞侵潤。（CD8+CTL的細(xì)胞毒作用等）,.,16,3、慢性排斥反應(yīng)： 時間：術(shù)后數(shù)月數(shù)年 機(jī)制：與免疫相關(guān) 系急排發(fā)作致移植物退 行性變，由遲發(fā)超敏反 應(yīng)介導(dǎo)的免疫炎癥。 非免疫相關(guān)

8、局部缺血、微生物感染,.,17,二、移植排斥反應(yīng)的類型,HVGR（host versus graft reaction） GVHR（graft versus host reaction） HVGR指宿主對移植物攻擊，排斥 GVHR指移植物中的過路T細(xì)胞對宿主攻擊，排斥 臨床上HVGR多見。,.,18,HVGR：,（一）超急性排斥反應(yīng)（48小時） 受者體內(nèi)預(yù)存針對移植物抗體 （二）急性排斥反應(yīng)（幾天2周） CD4+Th1介導(dǎo)的超敏反應(yīng)，CD8+CTL毒性 受體產(chǎn)生抗移植物抗體；NK、M激活 （三）慢性排斥反應(yīng)（數(shù)周、月、年） 未明了，與上述免疫學(xué)機(jī)制有關(guān)；有非特異性免疫學(xué)機(jī)制參與（感染、并發(fā)癥等

9、）,.,19,GVHR（ GVHD）,發(fā)生的前提： 受、供者HLA型不匹配，移植物中存在足夠量的免疫細(xì)胞（成熟T），受者免疫無能或極低。 移植物抗宿主反應(yīng)導(dǎo)致移植物抗宿主病，臨床表現(xiàn)為急性/慢性，難以逆轉(zhuǎn)死亡率高 T細(xì)胞是介導(dǎo)GVHR的主要效應(yīng)細(xì)胞，去除骨髓中成熟T細(xì)胞有效預(yù)防GVHR的發(fā)生。,.,20,三、移植中的組織配型,（一）選擇組織相匹配的供者 1、一般情況（供物狀態(tài)、全身情況、年齡） 2、ABO血型相容（擬輸血） 3、HLA相容性（受、供者HLA等位基因相合的數(shù)目越多越好） （二）HLA相容程度測試 1、血清學(xué)分型 2、細(xì)胞學(xué)分型 3、基因分型,.,21,1、血清學(xué)分型： 原理利用各

10、種已知的HLA標(biāo)準(zhǔn)血清型， 與檢測細(xì)胞反應(yīng)，添加補(bǔ)體后觀察 細(xì)胞反應(yīng)（CDC） （micro-complement dependent cytotoxicity） 技術(shù)要點分離淋巴細(xì)胞，與標(biāo)準(zhǔn)抗血清 反應(yīng)，添加補(bǔ)體，死細(xì)胞染色 記數(shù)、判斷 評價較理想，標(biāo)準(zhǔn)抗血清難,.,22,2、細(xì)胞學(xué)分型采用淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)（MLC），分雙向/單向。 雙向MLC受、供體淋巴細(xì)胞混合體外培 養(yǎng)，彼此作用，觀察細(xì)胞形態(tài) 與細(xì)胞增殖，互不影響示受、 供體間HLA型相匹配，否則 技術(shù)要點分離計數(shù)彼此淋巴細(xì)胞，共孵 育，染色計數(shù)轉(zhuǎn)化細(xì)胞 評價用于移植前的交叉配合試驗，但不 能判定HLA-D型,.,23,單向MLC用已處

11、理的標(biāo)準(zhǔn)型細(xì)胞與測試 細(xì)胞共孵育，觀察測試細(xì)胞的 反應(yīng)。 標(biāo)準(zhǔn)型細(xì)胞為只表達(dá)LD抗原的細(xì)胞，經(jīng)絲裂 霉素C或線處理失去增殖能力，作為刺激細(xì) 胞，與測試細(xì)胞孵育，觀察測試細(xì)胞的增殖 反應(yīng)，稱純合子細(xì)胞分型試驗（HTC）。測 試細(xì)胞無增殖反應(yīng)示彼此相同，又稱陰性分 型試驗。,.,24,當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)型細(xì)胞為只能對單倍型細(xì)胞具有識別 而增殖的現(xiàn)處于靜止?fàn)顟B(tài)的淋巴細(xì)胞，經(jīng)預(yù) 處理后成為致敏淋巴細(xì)胞（PL），作為反應(yīng) 細(xì)胞，與測試細(xì)胞孵育時，經(jīng)測試細(xì)胞的刺 激使PL轉(zhuǎn)化、增殖，又稱其為陽性分型試驗 （ PLT）。 HTC/ PLT均為單向MLC，技術(shù)要點類同雙向，但有許多預(yù)處理等。 評價實際但繁瑣、技術(shù)要求高,

12、.,25,3、基因分型 限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）分型 聚合酶鏈反應(yīng)-序列特異性寡核苷酸探針 （PCR-SSOP） PCR-序列特異性引物（PCR-SSP）分型 PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性（PCR-SSCP）分型 PCR指紋圖譜技術(shù) 其他,.,26,限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）分型： 利用不同個體的HLA相應(yīng)堿基序列不同， 其內(nèi)源性酶切位點不同，經(jīng)同一組內(nèi)切酶的 酶切反應(yīng)后，出現(xiàn)酶切片段的個數(shù)、長短不 一（酶切圖譜）。 與已知型的比對、分 析 用以定型。,.,27,聚合酶鏈反應(yīng)-序列特異性寡核苷酸探針 （PCR-SSOP）： 將待檢細(xì)胞HLA基因片段經(jīng)PCR擴(kuò)增、產(chǎn) 物轉(zhuǎn)移至尼龍膜上，再

13、與核素標(biāo)記的特異性 寡核苷酸探針進(jìn)行雜交， 結(jié)合完好說明 其基因序列相似（互補(bǔ)）。,.,28,PCR-序列特異性引物（PCR-SSP）分型： 先設(shè)計特異性引物（SSP），因為此SSP只能 和相應(yīng)的等位基因特異性片段的堿基序列互 補(bǔ)結(jié)合 PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性（PCR-SSCP）分型： 相同長度的單鏈DNA，其堿基順序不同即便只 有單個堿基不同，經(jīng)不變性的中性聚丙烯胺 凝膠電泳后，可反映不同的空間構(gòu)象（泳動 速度、遷移率）。,.,29,PCR指紋圖譜技術(shù)： DNA指紋圖是指，由于不同個體的DNA具有不 同的分子構(gòu)象，其在非變性聚丙烯胺凝膠電 泳中呈現(xiàn)的特異性區(qū)帶圖譜。 操作步驟是，先分別得到供者

14、/受者的DNA指 紋圖；然后將得到供者和受者的混合DNA指紋 圖，并作一致性比較分析,.,30,（三）交叉配型試驗,目的：檢測受者體內(nèi)是否存在抗供者的特異性抗體以及受者對供者HLA抗原的相容程度。 技術(shù)要點：供者淋巴細(xì)胞+受者血清 （混合）供者淋巴細(xì)胞+受者淋巴細(xì)胞 等等 方法：1、微量細(xì)胞毒試驗，2、流式細(xì)胞 術(shù)，3、混合培養(yǎng)，4、CML,.,31,四、移植排斥的免疫學(xué)防治,移植排斥反應(yīng)是根據(jù)臨床表現(xiàn)、移植物功能狀態(tài)、實驗室多種相關(guān)檢測結(jié)果的綜合性判斷的。 移植排斥反應(yīng)是移植失敗的主因；是移植免疫致力克服的關(guān)鍵難題。 關(guān)注點（一）排斥反應(yīng)的監(jiān)測 （二）排斥反應(yīng)的防治,.,32,（一）排斥反應(yīng)

15、的監(jiān)測,1、細(xì)胞免疫學(xué)監(jiān)測T淋巴細(xì)胞數(shù)量、功能以及亞群比例等，殺細(xì)胞活性（CTL和NK）。 2、細(xì)胞因子監(jiān)測：Th1型/ Th2型 Th1型包括IL-2、TNF-a、IFN-r等 Th2型包括IL-4、IL-10等 3、抗HLA抗體檢測 4、蛋白、酶類、補(bǔ)體檢測,.,33,3、抗HLA抗體檢測：,原理：與異體排斥反應(yīng)有關(guān)的體液、細(xì)胞免疫效應(yīng)主要是針對HLA抗原的，移植前所檢測的包括面不夠（其他抗體/群體反應(yīng)性抗體(PRA)？ 群體反應(yīng)性抗體(PRA)： 是指器官移植受者體內(nèi)的抗HLA（特異+其他），因為測得血清中PRA的水平更有助于移植時受者對移植物的敏感程度。 移植術(shù)前后的PRA高低與術(shù)后急

16、性排斥反應(yīng)明顯有關(guān)。,.,34,（二）排斥反應(yīng)的防治,1、HLA配型（組織配型） 2、免疫抑制劑 3、移植耐受的誘導(dǎo) 4、移植物等的預(yù)處理,.,35,1、HLA配型 越接近，成功率越高。 HLA配型應(yīng)包括對HLA-類分子和其類分子的配型。尤其類分子的匹配與否，更關(guān)系到移植物能否長期存活問題。 HLA的配型包括HLA交叉配型、預(yù)存抗體的檢測。 交叉配型包括淋巴細(xì)胞間、T細(xì)胞淋巴細(xì)胞毒性間、 B細(xì)胞淋巴細(xì)胞毒性間、流式細(xì)胞法、自身等。,.,36,2、免疫抑制劑 1）藥物: 皮質(zhì)類固醇 細(xì)胞增殖抑制劑（霉酚酸酯；MMF） 抑制T細(xì)胞活化（環(huán)孢素；CsA） （普樂可復(fù)；FK605） 2）抗體： 抗淋巴

17、細(xì)胞、抗胸腺細(xì)胞、抗CD3等 3）輸血： 與活化Ts細(xì)胞、產(chǎn)生封閉抗體等,.,37,3、移植耐受的誘導(dǎo)： 1）照射： X線照射（全淋巴照射-細(xì)胞破壞） 紫外線照射（滅活傳遞細(xì)胞功能，活化 Ts） 2）藥物： 環(huán)磷酰胺、環(huán)孢霉素A等，誘導(dǎo)免疫耐 受可能與誘導(dǎo)Ts細(xì)胞增生有關(guān)。 3）抗體： 抗淋巴細(xì)胞血清、抗T細(xì)胞表面分子抗 體，使得T細(xì)胞等無能,.,38,4、移植物等的預(yù)處理 1）移植物的預(yù)處理： 不同組織器官的移植，其移植物的處理不盡相同（外科修整、動脈灌洗）。 動脈灌洗，清除殘留于待移植器官內(nèi)的血液及細(xì)胞成分，尤其是免疫細(xì)胞（過客細(xì)胞），以防止過客細(xì)胞導(dǎo)致的GVHR。 用灌洗液前例腺素E1、

18、硫酸鎂、Collins液；或添加抗體 2）受體的準(zhǔn)備（略）,五、干細(xì)胞移植,干細(xì)胞指人體中尚未發(fā)育的原始細(xì)胞，具有“樹干”和“根源”的雙重意義。,干細(xì)胞的定向分化,.,40,干細(xì)胞的發(fā)育受多種內(nèi)在機(jī)制和微環(huán)境因素的影響。體外經(jīng)一定條件可使其定向分化細(xì)胞、組織、器官等。 干細(xì)胞種類：胚胎指受精卵分裂發(fā)育成 囊胚時的內(nèi)層細(xì)胞團(tuán)（全能 性）。 成體指成年動物中某些具 再生、修復(fù)能力的干細(xì)胞。,.,41,干細(xì)胞移植的臨床應(yīng)用： 1、作為種子細(xì)胞，用于細(xì)胞治療或組織細(xì)胞替代治療。 2、研究胚胎發(fā)育的調(diào)控機(jī)制 3、作為疾病基因治療的理想載體 4、用于藥物篩選和新藥開發(fā) 5、催生了細(xì)胞性心肌成形術(shù),.,42

19、,六、移植排斥的特殊免疫學(xué)問題,指跨物種間的移植（異種移植），解決供體器官的同時，強(qiáng)烈的排斥反應(yīng) （一）異種間移植的排斥反應(yīng) 1、特性：、 2、類型（附圖） 3、預(yù)防： 脾切除， 阻斷補(bǔ)體活 性， 吸附除去天然抗體 （二）骨髓移植的排斥反應(yīng),.,43,（一）異種間移植的排斥反應(yīng),1、特性：、細(xì)胞表面“異物”更多 、急性血管性排斥反應(yīng) 、加速性細(xì)胞排斥反應(yīng) 、受者體內(nèi)本存抗體，可促進(jìn) ADCC的發(fā)生與發(fā)展 、異種間的免疫障礙大于同種 2、類型（附圖）,.,44,.,45,協(xié)調(diào)性(concordant):指屬異種，但種屬比較近的異種移植排斥；非協(xié)調(diào)性(discordant):指異種移植排斥發(fā)生在種

20、系間較遠(yuǎn)的。 根據(jù)參與反應(yīng)發(fā)生的的機(jī)制不同， 協(xié)調(diào)性容易型/困難型 非協(xié)調(diào)性抗體介導(dǎo)型/補(bǔ)體介導(dǎo)型 協(xié)調(diào)性與非協(xié)調(diào)性區(qū)別：前者為誘導(dǎo)型抗體 后者為天然型抗體,.,46,3、預(yù)防： 脾切除， 阻斷補(bǔ)體活性， 吸附除去天然抗體,.,47,（二）骨髓移植的排斥反應(yīng),同種異基因（異體）骨髓移植用于治療白血病、再障等，目前面臨兩大主要問題： 1、白血病的復(fù)發(fā) 2、移植物抗宿主反應(yīng)（GVHR） GVHR定義（略） GVHR發(fā)生原因（略） GVHR發(fā)生機(jī)制（初）： CD4+Th1/Th2 CD8+Tc1/Tc2 NK、單核、粒細(xì)胞等 慢性GVHR被視為一種自身免疫病。,.,48,七、排斥反應(yīng)的免疫學(xué)檢驗,（

21、一）體液免疫水平的檢測 檢測指標(biāo)ABO血型、其他血型、抗HLA抗體及供者組織細(xì)胞抗體、血管內(nèi)皮、細(xì)胞抗體、冷凝集素抗體等。 測定方法（略）,.,49,（二）細(xì)胞免疫水平檢測 檢測指標(biāo)參與細(xì)胞免疫有關(guān)的細(xì)胞數(shù)量、 功能和產(chǎn)生細(xì)胞因子水平。 檢測手段外周血T細(xì)胞及其亞類的計數(shù) T細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗（4h） NK細(xì)胞活性測定 血清細(xì)胞因子的測定 黏附分子及其配體的檢測,.,50,（三）補(bǔ)體水平的檢測 檢測指標(biāo)補(bǔ)體成分（C1q）、其裂解產(chǎn)物 （C3a）及總補(bǔ)體活性（CH50） 檢測方法（略） （四）急性時相反應(yīng)物質(zhì)的檢測 檢測指標(biāo)C反應(yīng)蛋白、TNF-a、IL-1、-6 檢測方法（略）,.,51,八、移植后藥

22、物濃度的檢測,為什么要進(jìn)行藥物濃度監(jiān)測 如何進(jìn)行藥物濃度監(jiān)測 1）藥物濃度監(jiān)測的臨床指征 2）藥物濃度監(jiān)測的目的 3）藥物監(jiān)測的種類與方法 4）藥物濃度監(jiān)測的要點,.,52,.,53,.,54,治療藥物監(jiān)測的臨床意義,一治療藥物檢測的概念 治療藥物監(jiān)測是指臨床生化實驗室通過理化方法測定病人體液中藥物濃度，對病人施行個體化的治療方案以保證較好的治療效果和較高的安全性的一種措施。,.,55,藥物濃度監(jiān)測的缺點,費用昂貴 影響因素復(fù)雜,.,56,需進(jìn)行監(jiān)測的常見藥物,.,57,移植和免疫抑制劑的應(yīng)用,1596年，意大利外科醫(yī)生成功進(jìn)行最早一次成功的自體組織移植. 19世紀(jì)初，嘗試異體皮膚移植,但因排

23、斥而失敗。 1940年，Medewar證實了同種異體移植排斥是一種免疫現(xiàn)象. 1954年，美國醫(yī)生Murray在單卵雙生姐妹間進(jìn)行腎移植獲得成功。 1962年，應(yīng)用HLA分型技術(shù)選擇合適的供體，第一次用無親緣關(guān)系的供體腎進(jìn)行異體移植，獲得成功。 80年代初，由于環(huán)孢素A等應(yīng)用，明顯提高了器官移植的成功率，器官移植已廣泛應(yīng)用于臨床。,.,58,免疫抑制劑的發(fā)展,1960年前，硫唑嘌呤 1963年，去氫氫化可的松 1968年，抗胸腺細(xì)胞球蛋白 1978年，CSA 1992年，F(xiàn)K506 1999年，重組抗CD3陽性細(xì)胞單抗 2002年，雷帕霉素 2004年，依羅莫司,.,59,免疫抑制劑的發(fā)展,其它有發(fā)展前景的藥物 康樂霉素C 布列奎鈉（BQR） 來氟米特和同類物（MNA） CTLA41g,.,60,藥物監(jiān)測的種類與方法,方法（常見）： 熒光偏振免疫分析（ FPIA ） 微粒子熒光免疫分析（MEIA） ,.,61,1、競爭法原理,檢測抗原. 2、與熒光標(biāo)記抗原競爭結(jié)合抗體. 3、大小分子的不同旋轉(zhuǎn)速度改變偏振光方向. 4、偏振光的改變與被檢測藥物 濃度有關(guān).,微粒子熒光免疫分析法(MEIA)原理,.,64,ELISA原理：,.,65,MPA 全球質(zhì)控,環(huán)孢霉素 作用機(jī)制