第二章 生物大分子（2 RNA）

1、二、RNA,1. RNA 的種類 2. RNA的結(jié)構(gòu) 3 RNA的進化 4.RNA的功能 5. RNA的提取,1.RNA的種類,rRNA: 占80-85% tRNA 非編碼RNA（ncRNA） mRNA: 占1-5%,占15-20%,rRNA: 34種 tRNA：約50種 mRNA：在1000種以上.,原核生物與真核生物核糖體成分的比較,1. RNA的結(jié)構(gòu),含有尿嘧啶、核糖的單鏈,RNA的一級結(jié)構(gòu)：核苷酸的排列順序,hairpin,bulge,loop,Pseudoknots （假結(jié)）,RNA分子的二級結(jié)構(gòu) 堿基配對,RNA內(nèi)部的非Watson-Crick堿基對 G:U 是另外的常見配對，增強

2、了RNA自我互補配對的能力。 RNA鏈自身折疊形成的局部雙螺旋類似A型DNA。,Figure 6-33 G:U base pair,RNA的二級結(jié)構(gòu),非典型的堿基配對,RNA的三級結(jié)構(gòu)：空間構(gòu)象 由于RNA沒有形成長的規(guī)則螺旋的限制，因此可以形成大量的三級結(jié)構(gòu)。 對RNA三維結(jié)構(gòu)的認識主要來自于對tRNA的研究，因為獲得分子量較大的RNA的結(jié)晶較為困難。,X-射線晶體學(xué)研究顯示，細胞中的tRNA是以L-形的三維結(jié)構(gòu)存在的（酵母的丙氨酰tRNA 76nt）， tRNA在溶液中的構(gòu)型與其晶體結(jié)構(gòu)一致 。,1965年完成測序 1968年諾貝爾獎,1974年,大腸桿菌核糖體的典型三維結(jié)構(gòu)，電鏡、X射線

3、晶體學(xué)、生化方法的結(jié)合,大腸桿菌70S核糖體的 三維結(jié)構(gòu),萊馬克里斯南,施泰茨,尤納斯,2009年諾貝爾化學(xué)獎得主,3. 關(guān)于RNA的進化,RNA作為原始分子的概念則是1968年Crick和Orgel，1967年Woese分別提出的。 1972年和1993年，Noller等提供了一系列的證據(jù)說明核糖體RNA比核糖體蛋白在核糖體的功能中更加重要，為早期的推測提供了實驗證據(jù)。 1982年和1983年， RNA催化功能的發(fā)現(xiàn)為RNA世界合理性的構(gòu)筑提供了更加堅實的基礎(chǔ)。 RNA世界(RNA world)是Gilbert在1986年提出的，其主要興趣在于催化性的RNA是怎么產(chǎn)生了基因的外顯子-內(nèi)含子結(jié)

4、構(gòu)的。,RNA functioned as both a carrier of information and an enzyme. RNA catalyzed the synthesis of proteins, and these proteins catalyzed the transition from RNA to DNA. Proteins and RNPs catalyze the replication of DNA.,生物大分子進化中的地位,RNA世界經(jīng)歷了三個階段： （1）原始的RNA世界 40億年前，RNA分子具有雙重作用，既是信息分子也是生物催化劑，構(gòu)成了一個自我復(fù)制的

5、系統(tǒng)，與其他的核酶一起催化復(fù)雜的代謝，并構(gòu)成了獨立的早期生命形式。,（2）當(dāng)今的RNA： 偶爾獨自發(fā)揮作用，例如：核酶、核糖開關(guān)； 多數(shù)情況下，與蛋白質(zhì)協(xié)同起作用，例如：核糖體和剪接體中的RNA組分保留了催化活性，在端粒酶和信號識別顆粒中，起催化作用的則是蛋白質(zhì)； RNAi機制中，RNA的作用則減少到一個簡單的引導(dǎo)序列這一功能。,（3）RNA技術(shù)的應(yīng)用 雖誕生僅半個世紀(jì)，但是一個充滿活力的領(lǐng)域。 例如：利用適配體（aptamers）檢測人體血清中多種蛋白的濃度在臨床上有應(yīng)用價值；miRNA和反義核酸（抑制miRNA）具有制藥潛力，成為眾多制藥公司研發(fā)的內(nèi)容之一。,4 RNA的功能,信使功能：

6、催化功能： 調(diào)控功能：,mRNA是遺傳信息傳遞的中介分子。 RNA也可以作為一些病毒的遺傳物質(zhì)，這些病毒的基因組可以自我復(fù)制或者通過DNA中介進行復(fù)制。,（1）信使功能,RNA涉及多種生物學(xué)過程,（2）催化功能,1982, Thomas Cech發(fā)現(xiàn)Tetrahymena thermophila的26S rRNA的單個內(nèi)含子在體外具有自我剪接的能力。 1983, Sidney Altman發(fā)現(xiàn)Escherichia coli的RNase P 中的RNA組分在體外，能夠在沒有其蛋白質(zhì)亞基的條件下進行tRNA前體的加工 。 1989,Cech 和Altman因此獲得諾貝爾化學(xué)獎。,切赫(Thoma

7、s Robert Cech) 美國斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院 資源網(wǎng)址: /,1989年諾貝爾化學(xué)獎,奧爾特曼(Sidney Altman) 美國耶魯大學(xué) 資源網(wǎng)址:/facultystaff/altman.html facultystaff/altman.html,Self-splicing of Tetrahymena thermophila preribosomal RNA(pre-rRNA),電鏡觀察17S和26S rRNA 與rDNA的雜交結(jié)果 同位素標(biāo)記26S 前體RNA在體外以SP6 R

8、NA聚合酶進行轉(zhuǎn)錄。 0：未進一步孵育 -：在30孵育75min，不加GTP +：在30孵育75min，加GTP P為前體RNA,E為連接起來的外顯子， C、 L和N為剪接下來的不同形式的內(nèi)含子,RNase P可以催化tRNA的成熟,(A) tRNA分子的5前導(dǎo)序列的剪接由RNase P 催化 （B)人類RNase P的重組內(nèi)切活性的檢測，說明RNase P的蛋白亞基對其催化 活性是必須的，單獨的H1 RNA無法將前導(dǎo)序列從tRNA上移去。 S為未切割底物tRNATyr，Ctrl為純化的人類RNase P的對照，Rpp是蛋白亞基,RNP參與多種生物學(xué)過程,一些RNA可以直接控制基因表達，調(diào)控途

9、徑多樣，包括不同的RNA折疊，核糖開關(guān)，與非編碼RNA有關(guān)的RNA干擾現(xiàn)象、X染色體隨機失活現(xiàn)象等。,(3)調(diào)控功能, RNA的不同折疊: 細菌中的色氨酸操縱子是典型例子。,大腸桿菌中色氨酸操縱子的轉(zhuǎn)錄衰減,由RNA折疊的變化介導(dǎo)的抑制，轉(zhuǎn)錄衰減效應(yīng)可以達到10倍。,抗終止,終止,終止子發(fā)夾形成,抗終止子發(fā)夾形成,細胞內(nèi)色氨酸充足時，核糖體不會在 TrpL上串聯(lián)的Trp密碼子處停留，迅速到達TrpL的終止密碼。,衰減：細胞內(nèi)的色氨酸不足時，核糖體停滯 在TrpL上串聯(lián)的Trp密碼子處停留，形成 抗終止發(fā)夾，結(jié)構(gòu)基因trpEDCBA的轉(zhuǎn)錄 發(fā)生。,由蛋白質(zhì)介導(dǎo)的抑制與 RNA折疊的變化介導(dǎo)的抑制

10、方式并存時，色氨酸操縱子結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄水平可以改變600倍。,在缺乏色氨酸時，編碼色氨酸生物 合成的酶正常轉(zhuǎn)錄翻譯。,細胞內(nèi)色氨酸充足的時候，與二聚體化的色氨酸 抑制蛋白結(jié)合，誘導(dǎo)其構(gòu)象的變化，使抑制蛋白 和操縱子結(jié)合，阻礙了RNA聚合酶靠近啟動子。,核糖開關(guān) （Riboswitches）,RNA可以與小分子結(jié)合，例如:鳥嘌呤、賴氨酸等，從而改變RNA的結(jié)構(gòu)，是細菌中普遍存在的基因表達的調(diào)控方式，該現(xiàn)象在植物中也有發(fā)現(xiàn)。,一些mRNAs分子中的特定結(jié)構(gòu)域選擇性的結(jié)合一些代謝物，作為可以調(diào)節(jié)的“開-關(guān)”元件，在不需要蛋白轉(zhuǎn)錄因子的條件下就能夠控制基因的表達，稱為核糖開關(guān)。,因此，RNA在功能上就

11、可以作為不同信號的感受器，感受溫度、鹽濃度、離子、氨基酸和其他小分子有機代謝物的變化。 核糖開關(guān)的典型位置是在mRNAs分子的5非翻譯區(qū)（5-untranslated regions，5-UTR）。,在結(jié)構(gòu)上，絕大部分的核糖開關(guān)可以粗略分成兩個結(jié)構(gòu)域： 適配體（aptamer）: 與靶代謝物選擇性結(jié)合的RNA序列，長度在100nt以內(nèi)。 表達平臺（“expression platform”）: 在代謝物結(jié)合時，通過改變RNA的折疊形式，影響基因表達。,核糖開關(guān)的作用機制,左側(cè)：轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控涉及到代謝物的結(jié)合，特定構(gòu)象適配體的穩(wěn)定，進一步形成終止子發(fā)夾，阻止全長mRNA的轉(zhuǎn)錄。 右側(cè)：翻譯水平

12、的調(diào)控則是通過代謝物或溫度誘導(dǎo)的結(jié)構(gòu)變化，阻止核糖體和mRNA的結(jié)合。,核糖開關(guān)的作用機制： 通過對小分子的濃度改變進行應(yīng)答，來調(diào)控基因的表達，這一調(diào)控是通過改變RNA的二級結(jié)構(gòu)來完成的。,2004年發(fā)現(xiàn)具有催化活性的RNA參與了遺傳調(diào)控。 例如：glmS對添加的GlcN6P 應(yīng)答，進而切割自身mRNA。,GlmS是6-磷酸葡糖胺（GlcN6P）合成相關(guān)的酶，由glmS mRNA編碼， 其中含有核酶序列。 在有GlcN6P時，核酶切割自身的mRNA，阻止進一步的生成GlcN6P。,RNA干擾： 不僅涉及mRNA水平的事件，也調(diào)節(jié)染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)。實際上，在染色體著絲粒區(qū)高度異染色質(zhì)化的維持依賴RN

13、Ai的活性。, X染色體隨機失活 大分子量的ncRNA常常在合成它們的染色體位點上起作用，通過吸引蛋白對染色質(zhì)進行修飾，關(guān)閉基因表達，這種效應(yīng)可以擴展到整條染色體，例如：Xist RNA將整條X染色體凝集，產(chǎn)生基因劑量補償（gene dosage compensation）。,RNA的生物學(xué)功能,RNA 是一些病毒的遺傳物質(zhì)。 與蛋白質(zhì)合成有關(guān)，mRNA 在功能上是基因和蛋白合成機器之間的中介；tRNA在功能上是mRNA上密碼子和氨基酸之間的銜接分子。 有些RNA具有催化活性（核酶） 。 RNA可以通過多種途徑調(diào)節(jié)基因表達。,5. RNA的提取,提取原則：一般分子量較小，不易被機械拉力打斷；最

14、重要的是抑制RNA酶（RNase）的活性，防止RNA被降解。 RNase的特點： 該酶的穩(wěn)定性極高，活性也不依賴二價陽離子，可以耐受多種處理（煮沸、酸、堿等）而不失活。 存在廣泛，環(huán)境中的灰塵、實驗器皿、試劑以及人的汗液、唾液中均存在。,RNA操作的要點創(chuàng)造一個無RNA酶的環(huán)境！,（1） 防止外源RNase污染: 潔凈實驗室環(huán)境 一次性手套，勤換；操作時可以帶口罩。 環(huán)境潔凈（避免飛塵中細菌、真菌產(chǎn)生外源性RNA酶污染，無空氣對流） 玻璃和塑料器皿處理 玻璃：常規(guī)洗凈后，200干烤4小時 塑料器皿（離心管、槍頭等）：用0.1%的DEPC水常溫浸泡過夜，滅菌干燥后使用。 溶液配制：加0.1%DE

15、PC處理的雙蒸水配制，高壓除去殘留的DEPC。,DEPC的特點和使用,DEPC （焦碳酸二乙酯）是一種強烈但并不徹底的RNA酶抑制劑，通過和RNA酶中His結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，抑制RNA酶活性。 DEPC是一種潛在的致癌物質(zhì)，在操作中應(yīng)盡量在通風(fēng)的條件下進行，并避免接觸皮膚，不小心占到手上注意立即沖洗。 DEPC毒性并不是很強，但吸入的毒性是最強的，使用時戴口罩。 高壓蒸汽滅菌 121，25min 后，DEPC分解成二氧化碳和酒精。,（2）抑制內(nèi)源的RNase的活性： 常用的抑制RNase的試劑有： 異硫氰酸胍：強烈變性劑，能迅速溶解蛋白質(zhì)，導(dǎo)致細胞結(jié)構(gòu)破碎，使RNA從細胞中釋放。 -巰基乙醇和異硫氰酸胍能使細胞內(nèi)各種RNA酶失活。 十二烷基肌酸鈉：使核糖體蛋白質(zhì)與RNA分離。 RNasin：RNA酶的一種非競爭性抑制劑，反轉(zhuǎn)錄實驗常用。,RNA的保存： 實際操作中，RNA提取并檢驗