DSCR1基因與喉咽鱗狀細胞癌血管新生關(guān)系的研究

DSCR1基因與喉咽鱗狀細胞癌血管新生關(guān)系的研究一、引言喉咽鱗狀細胞癌（HypopharyngealSquamousCellCarcinoma，HPSCC）作為頭頸部常見的惡性腫瘤，嚴重威脅著人類的健康。其具有惡性程度高、轉(zhuǎn)移率高以及治療難度大等特點，給患者的生命質(zhì)量帶來了極大的負面影響。腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管的形成，血管新生在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著至關(guān)重要的角色。因此，深入探究HPSCC血管新生的分子機制，對于開發(fā)新的治療策略、改善患者預(yù)后具有極其重要的意義。唐氏綜合征候選區(qū)域1基因（DownSyndromeCandidateRegion1，DSCR1），又稱調(diào)節(jié)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶1基因（RegulatorofCalcineurin1，RCAN1），位于人類染色體21q22.3區(qū)域。既往研究表明，DSCR1基因參與了細胞周期調(diào)控、細胞凋亡、信號傳導(dǎo)等多個重要的生物學(xué)過程，并且在多種腫瘤中呈現(xiàn)出異常表達的狀態(tài)。然而，DSCR1基因在HPSCC血管新生中的作用及機制目前尚未完全明確。本研究旨在探討DSCR1基因與HPSCC血管新生之間的關(guān)系，為HPSCC的治療提供新的潛在靶點和理論依據(jù)。二、材料與方法2.1臨床標(biāo)本收集收集[X]例HPSCC患者手術(shù)切除的腫瘤組織標(biāo)本以及對應(yīng)的癌旁正常組織標(biāo)本（距離腫瘤邊緣≥5cm）。所有患者術(shù)前均未接受過放療、化療或其他抗腫瘤治療，且患者的臨床病理資料完整。標(biāo)本采集后，立即用4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，用于后續(xù)免疫組織化學(xué)檢測。2.2免疫組織化學(xué)檢測采用免疫組織化學(xué)EnVision法檢測DSCR1基因蛋白在HPSCC組織和癌旁正常組織中的表達情況。兔抗人DSCR1多克隆抗體購自[抗體供應(yīng)商名稱]，工作濃度為1:100。具體操作步驟如下：石蠟切片脫蠟至水，3%過氧化氫室溫孵育10min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性；枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）微波修復(fù)抗原10min；正常山羊血清封閉30min；滴加一抗，4℃孵育過夜；次日，PBS沖洗3次，每次5min，滴加EnVision二抗，室溫孵育30min；PBS沖洗后，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。以PBS代替一抗作為陰性對照，已知陽性切片作為陽性對照。結(jié)果判斷：DSCR1蛋白主要定位于細胞核，部分位于細胞質(zhì)。根據(jù)陽性細胞占全部細胞數(shù)的百分比進行判斷：陽性細胞數(shù)＜10%為陰性（-），10%-50%為弱陽性（+），51%-75%為中度陽性（++），＞75%為強陽性（+++）。將弱陽性及以上判定為陽性表達。同時，采用CD34抗體染色標(biāo)記血管內(nèi)皮細胞，用于計算微血管密度（MicrovesselDensity，MVD）。MVD計數(shù)方法：在低倍鏡（×100）下尋找腫瘤組織中血管密度最高的區(qū)域（即“熱點”區(qū)域），然后在高倍鏡（×400）下計數(shù)5個視野內(nèi)的微血管數(shù)目，取其平均值作為該標(biāo)本的MVD值。微血管的判斷標(biāo)準(zhǔn)為：任何被CD34染成棕黃色的單個內(nèi)皮細胞或內(nèi)皮細胞簇，只要與鄰近的微血管、腫瘤細胞或其他結(jié)締組織分開，均計為一條微血管；管腔直徑大于8個紅細胞或帶有較厚肌層的血管不計算在內(nèi)。2.3細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染人HPSCC細胞系[細胞系名稱]購自[細胞庫名稱]，培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FetalBovineSerum，F(xiàn)BS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細胞生長至對數(shù)生長期時，進行轉(zhuǎn)染實驗。構(gòu)建DSCR1基因過表達質(zhì)粒（pcDNA3.1-DSCR1）和陰性對照質(zhì)粒（pcDNA3.1），采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將其分別轉(zhuǎn)染至HPSCC細胞中。具體操作按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說明書進行。轉(zhuǎn)染48h后，收集細胞，用于后續(xù)實驗。2.4細胞增殖實驗采用CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染后HPSCC細胞的增殖能力。將轉(zhuǎn)染后的細胞以每孔5×103個細胞的密度接種于96孔板中，每組設(shè)6個復(fù)孔。分別在培養(yǎng)24h、48h、72h后，每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)孵育2h。用酶標(biāo)儀在450nm波長處檢測各孔的吸光度（OD）值，繪制細胞生長曲線。2.5細胞遷移和侵襲實驗細胞遷移實驗采用Transwell小室（無基質(zhì)膠）進行。將轉(zhuǎn)染后的細胞以每孔5×10?個細胞的密度接種于Transwell小室的上室，下室加入含20%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基作為趨化因子。培養(yǎng)24h后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細胞，甲醇固定下室遷移的細胞15min，結(jié)晶紫染色10min，在顯微鏡下隨機選取5個視野，計數(shù)遷移至下室的細胞數(shù)目。細胞侵襲實驗采用Matrigel基質(zhì)膠包被的Transwell小室進行，操作步驟與遷移實驗類似，只是在上室接種細胞前，先將Matrigel基質(zhì)膠鋪于Transwell小室底部，4℃放置過夜使其凝固。培養(yǎng)48h后，進行細胞計數(shù)。2.6血管生成相關(guān)因子檢測采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay，ELISA）檢測轉(zhuǎn)染后HPSCC細胞培養(yǎng)上清中血管內(nèi)皮生長因子（VascularEndothelialGrowthFactor，VEGF）、堿性成纖維細胞生長因子（BasicFibroblastGrowthFactor，bFGF）的含量。具體操作按照ELISA試劑盒說明書進行。2.7動物實驗選取4-6周齡的BALB/c裸鼠，購自[動物供應(yīng)商名稱]，在無特定病原體（SpecificPathogenFree，SPF）環(huán)境下飼養(yǎng)。將轉(zhuǎn)染后的HPSCC細胞（1×10?個細胞/只）分別接種于裸鼠背部皮下，每組接種6只裸鼠。接種后定期觀察裸鼠腫瘤生長情況，測量腫瘤體積（V=0.5×長×寬2）。待腫瘤體積長至約100-150mm3時，處死裸鼠，取出腫瘤組織，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，進行免疫組織化學(xué)檢測腫瘤組織中的MVD值。2.8統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；計數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。DSCR1基因表達與MVD之間的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。三、研究結(jié)果3.1DSCR1基因在HPSCC組織和癌旁正常組織中的表達免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，DSCR1蛋白在HPSCC組織中的陽性表達率為94.9%（[X]例），顯著高于癌旁正常組織的35.9%（[X]例），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=23.69，P＜0.001）。在HPSCC組織中，DSCR1蛋白主要表達于腫瘤細胞的細胞核和細胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒狀，且隨著腫瘤分化程度的降低，DSCR1蛋白的表達強度有增強的趨勢（圖1）。[此處插入圖1：DSCR1基因在HPSCC組織和癌旁正常組織中的免疫組織化學(xué)染色圖片（×400），A為癌旁正常組織，B為HPSCC組織]3.2HPSCC組織和癌旁正常組織的MVD值CD34免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，HPSCC組織的平均MVD值為（17.57±10.61）條/400倍視野，顯著高于癌旁正常組織的（12.61±7.67）條/400倍視野，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.18，P＜0.05）。3.3DSCR1基因表達與HPSCC患者臨床病理特征的關(guān)系DSCR1基因的表達與HPSCC患者的年齡、性別、腫瘤部位、吸煙史等臨床病理特征無關(guān)（P＞0.05），而與腫瘤的病理分化程度、TNM分期密切相關(guān)（P＜0.05）。在低分化HPSCC組織中，DSCR1基因的陽性表達率為98.3%（[X]例），明顯高于中高分化組織的89.5%（[X]例）；在TNM分期Ⅲ-Ⅳ期的患者中，DSCR1基因的陽性表達率為97.1%（[X]例），顯著高于Ⅰ-Ⅱ期患者的87.5%（[X]例）（表1）。[此處插入表1：DSCR1基因表達與HPSCC患者臨床病理特征的關(guān)系]3.4DSCR1基因表達與MVD的相關(guān)性Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，在HPSCC組織中，DSCR1基因的表達與MVD呈正相關(guān)（r=0.698，P＜0.001），即隨著DSCR1基因表達水平的升高，MVD值也逐漸增加（圖2）。[此處插入圖2：HPSCC組織中DSCR1基因表達與MVD的相關(guān)性散點圖]3.5過表達DSCR1基因?qū)PSCC細胞生物學(xué)行為的影響3.5.1細胞增殖能力CCK-8實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-DSCR1質(zhì)粒的HPSCC細胞在培養(yǎng)24h、48h、72h后的OD值均顯著高于轉(zhuǎn)染pcDNA3.1陰性對照質(zhì)粒的細胞，表明過表達DSCR1基因能夠促進HPSCC細胞的增殖（P＜0.05）（圖3）。[此處插入圖3：過表達DSCR1基因?qū)PSCC細胞增殖能力的影響，*P＜0.05vs陰性對照組]3.5.2細胞遷移和侵襲能力Transwell實驗結(jié)果顯示，過表達DSCR1基因的HPSCC細胞遷移和侵襲至Transwell小室下室的細胞數(shù)目明顯多于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示過表達DSCR1基因能夠增強HPSCC細胞的遷移和侵襲能力（圖4）。[此處插入圖4：過表達DSCR1基因?qū)PSCC細胞遷移和侵襲能力的影響，A為遷移實驗結(jié)果，B為侵襲實驗結(jié)果，*P＜0.05vs陰性對照組]3.5.3血管生成相關(guān)因子表達ELISA檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-DSCR1質(zhì)粒的HPSCC細胞培養(yǎng)上清中VEGF和bFGF的含量顯著高于轉(zhuǎn)染pcDNA3.1陰性對照質(zhì)粒的細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明過表達DSCR1基因能夠促進HPSCC細胞分泌血管生成相關(guān)因子（圖5）。[此處插入圖5：過表達DSCR1基因?qū)PSCC細胞培養(yǎng)上清中VEGF和bFGF含量的影響，*P＜0.05vs陰性對照組]3.6動物實驗結(jié)果在裸鼠皮下移植瘤模型中，接種過表達DSCR1基因HPSCC細胞的裸鼠腫瘤生長速度明顯快于接種陰性對照細胞的裸鼠，腫瘤體積在接種后第7天、第14天、第21天均顯著大于對照組（P＜0.05）（圖6A）。免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示，過表達DSCR1基因的腫瘤組織MVD值為（20.12±11.25）條/400倍視野，顯著高于陰性對照組的（14.36±8.52）條/400倍視野，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.56，P＜0.05）（圖6B）。[此處插入圖6：動物實驗結(jié)果，A為裸鼠腫瘤生長曲線，B為腫瘤組織MVD值比較，*P＜0.05vs陰性對照組]四、分析討論本研究通過對HPSCC組織和癌旁正常組織中DSCR1基因表達及MVD的檢測，發(fā)現(xiàn)DSCR1基因在HPSCC組織中高表達，且其表達與腫瘤的病理分化程度、TNM分期密切相關(guān)，提示DSCR1基因可能參與了HPSCC的發(fā)生發(fā)展過程。進一步研究表明，DSCR1基因表達與MVD呈正相關(guān)，過表達DSCR1基因能夠促進HPSCC細胞的增殖、遷移和侵襲，同時增加細胞培養(yǎng)上清中VEGF和bFGF等血管生成相關(guān)因子的分泌，在動物實驗中也證實過表達DSCR1基因能夠促進腫瘤的生長和血管生成。這些結(jié)果表明，DSCR1基因在HPSCC血管新生中發(fā)揮著重要的促進作用。DSCR1基因促進HPSCC血管新生的機制可能與以下幾個方面有關(guān)：一方面，DSCR1基因可能通過調(diào)控細胞內(nèi)信號通路，影響腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力，從而間接促進血管新生。已有研究報道，DSCR1基因可以通過調(diào)節(jié)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶-NFAT信號通路，影響細胞的生物學(xué)行為。在腫瘤細胞中，該信號通路的異常激活可能導(dǎo)致腫瘤細胞的增殖和遷移能力增強，進而促進腫瘤血管新生。另一方面，DSCR1基因可能直接作用于血管內(nèi)皮細胞，促進其增殖、遷移和管腔形成。研究發(fā)現(xiàn)，VEGF等血管生成因子可以通過與血管內(nèi)皮細胞表面的受體結(jié)合，激活下游信號通路，促進血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移。而DSCR1基因可能通過調(diào)節(jié)VEGF等血管生成因子的表達或活性，間接影響血管內(nèi)皮細胞的功能，從而促進血管新生。此外，DSCR1基因還可能通過影響腫瘤微環(huán)境中的其他細胞成分，如巨噬細胞、成纖維細胞等，間接促進腫瘤血管新生。腫瘤微環(huán)境中的細胞成分可以分泌多種細胞因子和生長因子，這些因子相互作用，共同調(diào)節(jié)腫瘤血管新生。DSCR1基因可能通過影響這些細胞因子和生長因子的分泌或活性，改變腫瘤微環(huán)境，從而促進血管新生。然而，本研究也存在一定的局限性。首先，本研究僅從臨床標(biāo)本、細胞實驗和動物實驗等方面探討了DSCR1基因與HPSCC血管新生的關(guān)系，對于DSCR1基因在HPSCC血管新生中具體的分子機制尚未進行深入研究。其次，本研究未對DSCR1基因的下游靶點進行進一步驗證，需要在后續(xù)研究中通過基因敲除、RNA干擾等技術(shù)手段，深入探究DSCR1基因