菊花無花粉污染品種選育策略與花粉敗育的轉(zhuǎn)錄組學(xué)解析

菊花無花粉污染品種選育策略與花粉敗育的轉(zhuǎn)錄組學(xué)解析一、緒論1.1研究背景與意義隨著城市化進程的加速和人們生活水平的提高，城市綠化和觀賞植物的需求日益增長。菊花（Chrysanthemummorifolium）作為世界四大鮮切花之一，不僅具有極高的觀賞價值，還擁有悠久的文化歷史和豐厚的文化底蘊，在國內(nèi)外的切花市場中需求量極大。然而，菊花在開花過程中，花序中間的兩性管狀花由外輪向內(nèi)輪發(fā)育，會散發(fā)出大量花粉。這些花粉不僅會掉落在舌狀花上，降低菊花的觀賞價值，還會飄散到空氣中，成為花粉污染的重要來源?；ǚ畚廴締栴}近年來日益受到關(guān)注，其對環(huán)境和人體健康都產(chǎn)生了諸多不利影響?？諝庵械幕ǚ圩鳛橐环N生物氣溶膠，是常見的過敏原之一。當(dāng)花粉濃度達到一定程度時，易引發(fā)人體的過敏反應(yīng)，導(dǎo)致花粉癥。花粉癥的癥狀多樣，包括鼻炎、咽炎、支氣管炎等呼吸道疾病，以及皮膚過敏，表現(xiàn)為瘙癢、流淚、打噴嚏、胸悶等，嚴(yán)重情況下甚至?xí){哮喘病人的生命。在全球范圍內(nèi)，花粉過敏人數(shù)呈上升趨勢，給醫(yī)療系統(tǒng)和患者生活帶來了沉重負擔(dān)。例如在法國，每年都有大量民眾因花粉過敏而就醫(yī)，甚至部分地區(qū)會發(fā)布“花粉預(yù)警”，提醒居民做好防護措施。在我國，北方城市秋季草本花粉盛行，如菊科豚草屬、蒿屬類植物，因其花期長、數(shù)量多、粒徑小、滯空久，成為引發(fā)花粉過敏的主要過敏原。除了對人體健康的威脅，花粉污染還會對生態(tài)環(huán)境造成一定的干擾。過多的花粉飄散可能會影響植物之間的授粉平衡，改變生態(tài)系統(tǒng)中物種的組成和分布。在城市綠化中，花粉污染也會影響城市景觀的美觀度和舒適度，降低居民對城市環(huán)境的滿意度。因此，培育無花粉污染的菊花新品種具有重要的現(xiàn)實意義。從市場應(yīng)用前景來看，無花粉污染菊花在鮮切花市場、家居裝飾以及城市綠化等領(lǐng)域都具有廣闊的應(yīng)用空間。在鮮切花市場，無花粉污染菊花可以滿足消費者對健康、美觀花卉的需求，提高產(chǎn)品的競爭力；在家居裝飾中，無花粉污染菊花可以避免花粉對室內(nèi)環(huán)境的污染，為人們營造一個更加舒適、健康的生活空間；在城市綠化中，無花粉污染菊花可以減少花粉對城市居民的困擾，提升城市生態(tài)環(huán)境質(zhì)量。為了選育出無花粉污染的菊花，深入研究花粉敗育的機制至關(guān)重要?；ǚ蹟∮菍?dǎo)致雄性不育的關(guān)鍵因素，而轉(zhuǎn)錄組學(xué)作為研究特定細胞或組織在某一狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄本總和的學(xué)科，為揭示菊花花粉敗育機制提供了有力的工具。通過對花粉敗育菊花進行轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，可以全面了解花粉發(fā)育過程中的基因表達變化，篩選出與花粉敗育相關(guān)的關(guān)鍵基因和調(diào)控通路，為無花粉污染菊花的選育提供堅實的理論基礎(chǔ)。例如，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)滕年軍教授團隊通過對花粉敗育的菊花轉(zhuǎn)錄組研究，篩選出了新的LBD家族轉(zhuǎn)錄因子CmLBD2，發(fā)現(xiàn)其在調(diào)控菊花花粉發(fā)育過程中具有重要作用，抑制該基因表達可導(dǎo)致菊花花粉大量減少甚至敗育。這一研究成果為菊花雄性不育系的選育和花粉發(fā)育機制的研究奠定了新的基礎(chǔ)。深入開展無花粉污染菊花的選育和花粉敗育轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，對于解決花粉污染問題、推動菊花產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展以及提升城市生態(tài)環(huán)境質(zhì)量都具有重要的意義。1.2研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在解決菊花花粉污染問題，通過選育無花粉污染菊花品種以及深入分析花粉敗育轉(zhuǎn)錄組，為菊花產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供理論支持和技術(shù)支撐。具體研究目標(biāo)與內(nèi)容如下：選育無花粉污染菊花品種：通過對現(xiàn)有菊花品種的花粉污染情況進行調(diào)查，篩選出具有低花粉或無花粉特性的菊花品種作為親本。運用雜交育種、誘變育種等常規(guī)育種技術(shù)，結(jié)合現(xiàn)代生物技術(shù)，如分子標(biāo)記輔助選擇、基因編輯等，開展無花粉污染菊花新品種的選育工作。對選育出的新品種進行生物學(xué)特性、觀賞性狀、適應(yīng)性等方面的評價，篩選出綜合性狀優(yōu)良的無花粉污染菊花新品種，為市場提供更多優(yōu)質(zhì)的花卉選擇?；ǚ蹟∮D(zhuǎn)錄組學(xué)分析：選取花粉敗育的菊花材料和正常花粉發(fā)育的菊花材料，在花粉發(fā)育的關(guān)鍵時期，如花粉母細胞減數(shù)分裂期、單核期、雙核期等，采集花藥組織。利用高通量測序技術(shù)，對兩組材料的花藥進行轉(zhuǎn)錄組測序，獲得大量的轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)。通過生物信息學(xué)分析，對測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制、拼接、注釋等處理，篩選出在花粉敗育材料和正常材料中差異表達的基因。對差異表達基因進行功能注釋和富集分析，明確其參與的生物學(xué)過程、分子功能和信號通路，深入探究花粉敗育的分子機制。運用實時熒光定量PCR、基因沉默、過表達等技術(shù)，對篩選出的關(guān)鍵基因進行功能驗證，進一步確定其在花粉敗育過程中的作用。1.3研究方法與技術(shù)路線本研究主要采用以下研究方法，涵蓋了菊花選育和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析兩個關(guān)鍵方面：選育無花粉污染菊花品種：通過對現(xiàn)有菊花品種的花粉污染情況進行調(diào)查，選取具有低花粉或無花粉特性的品種作為親本。利用雜交育種技術(shù)，在母本舌狀花剛露色時，剪去舌狀花花瓣直至露出柱頭，注意不碰及柱頭，并用硫酸紙袋嚴(yán)格套袋隔離；同時將即將散粉的父本花序套袋隔離，待母本柱頭伸出呈“Y”字型時，于晴天用毛筆收集父本新鮮花粉，蘸在母本舌狀花雌蕊柱頭上，套袋隔離，1-2天后再次授粉。人工授粉后24h，收集3個花序，分別隨機挑選5個小花，用FAA固定，保存在4℃冰箱備用；48h后，用1mol?L?1NaOH溶液軟化8h，蒸餾水清洗3次，剝離花柱，用0.1％苯胺藍溶液染色，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，記錄花粉萌發(fā)數(shù)，重復(fù)15次。授粉后8、12、18天統(tǒng)計子房飽滿數(shù)和不飽滿數(shù)，計算子房飽滿率，待種子成熟，統(tǒng)計結(jié)實率，結(jié)實率(％)＝平均每朵花序的種子數(shù)/平均每個花序的舌狀花數(shù)×100％。對于雜交F1代，測定其散粉特性，包括單個花序管狀花數(shù)、單花花藥數(shù)、花藥含粉量、花序含粉量和表觀花粉量5個性狀，以分析花粉污染程度。具體操作如下：每個F1代株系隨機選取3個生長良好、大小適中的花序，進行管狀花計數(shù)；從上述3個花序中分別隨機選擇5個未散粉的管狀花，剝離花藥，記錄花藥數(shù)；從外圍未散粉的兩三輪管狀花中剝?nèi)?0枚花藥，放入離心管，在50℃烘箱中干燥使花藥開裂釋放花粉，3天后搗碎花藥，加入6ml20％的(NaPO)懸浮液，渦旋使花粉分散均勻，吸取2μL懸浮液滴在載玻片上，在顯微鏡下觀察并計數(shù)花粉量，重復(fù)10次，計算花藥含粉量，花藥含粉量＝(每個載玻片上花粉粒數(shù)×3,000)/60；花序含粉量(粒/花序)＝單個花序管狀花數(shù)×單花花藥數(shù)×花藥含粉量；在散粉盛期，根據(jù)柱頭上花粉團的體積大小、花粉的采集難易程度，把表觀花粉量分為多、中等、少、無4個等級。此外，考慮采用誘變育種技術(shù)，利用物理誘變（如γ射線、紫外線照射）或化學(xué)誘變（如甲基磺酸乙酯EMS處理），誘導(dǎo)菊花植株發(fā)生基因突變，篩選出花粉敗育或無花粉的突變體。結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，篩選與無花粉性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記，在育種過程中對目標(biāo)性狀進行早期選擇，提高育種效率。若條件允許，嘗試運用基因編輯技術(shù)，如CRISPR/Cas9系統(tǒng)，對菊花中與花粉發(fā)育相關(guān)的關(guān)鍵基因進行編輯，創(chuàng)造無花粉污染的菊花新種質(zhì)。花粉敗育轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析：選取花粉敗育的菊花材料和正?；ǚ郯l(fā)育的菊花材料，在花粉發(fā)育的關(guān)鍵時期，如花粉母細胞減數(shù)分裂期、單核期、雙核期等，采集花藥組織。利用TRIzol法或其他高效的RNA提取試劑盒，從花藥組織中提取總RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop等方法檢測RNA的完整性和純度。使用IlluminaHiSeq等高通量測序平臺，對提取的RNA進行轉(zhuǎn)錄組測序，構(gòu)建cDNA文庫并進行測序反應(yīng)，獲得原始測序數(shù)據(jù)。運用FastQC等工具對原始測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制，檢查數(shù)據(jù)的GC含量、測序錯誤率、測序深度等指標(biāo)。使用Trimmomatic等軟件去除低質(zhì)量序列、接頭序列和污染序列，對數(shù)據(jù)進行預(yù)處理。將預(yù)處理后的數(shù)據(jù)與菊花參考基因組進行比對，使用TopHat、HISAT2等比對軟件，確定每個讀段在基因組上的位置。采用Cufflinks、StringTie等軟件進行基因表達定量分析，計算每個基因的表達量，常用的指標(biāo)為FPKM（FragmentsPerKilobaseofexonperMillionfragmentsmapped）或TPM（TranscriptsPerMillion）。通過DESeq2、edgeR等軟件進行差異表達分析，篩選出在花粉敗育材料和正常材料中差異表達的基因，通常設(shè)定|log2FC|≥1且FDR≤0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。利用GO（GeneOntology）數(shù)據(jù)庫和KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）數(shù)據(jù)庫，對差異表達基因進行功能注釋和富集分析，明確其參與的生物學(xué)過程、分子功能和信號通路。運用實時熒光定量PCR技術(shù)，對篩選出的關(guān)鍵差異表達基因進行驗證，設(shè)計特異性引物，以β-actin等持家基因為內(nèi)參，檢測基因在不同材料中的表達水平，驗證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的準(zhǔn)確性。若有條件，可通過基因沉默（如RNA干擾RNAi）或過表達技術(shù)，在菊花中對關(guān)鍵基因進行功能驗證，觀察其對花粉發(fā)育的影響，進一步確定基因在花粉敗育過程中的作用。本研究的技術(shù)路線如下：首先開展無花粉污染菊花品種的選育工作，包括親本選擇、雜交授粉、后代測定等環(huán)節(jié)，獲得無花粉污染的菊花新品系。同時，針對花粉敗育和正常發(fā)育的菊花材料，進行花藥采集、RNA提取、轉(zhuǎn)錄組測序及生物信息學(xué)分析，篩選關(guān)鍵基因并進行功能驗證。最終，將選育結(jié)果和轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究成果相結(jié)合，為無花粉污染菊花的選育提供理論依據(jù)和技術(shù)支持，推動菊花產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，解決花粉污染問題，提升城市生態(tài)環(huán)境質(zhì)量。二、文獻綜述2.1花粉污染研究現(xiàn)狀2.1.1花粉癥與“花粉污染”花粉癥，作為一種常見的過敏性疾病，是指過敏體質(zhì)者在接觸致敏花粉后，由特異性IgE介導(dǎo)的免疫反應(yīng)引發(fā)的一系列臨床癥狀?；ǚ圩鳛橹参锏男坌陨臣毎?，在植物繁衍過程中起著關(guān)鍵作用，但對于部分過敏體質(zhì)人群而言，卻是健康的威脅?；ǚ圻^敏誘發(fā)的疾病類型多樣，涵蓋過敏性結(jié)膜炎、過敏性哮喘、過敏性鼻炎、過敏性皮膚病等。當(dāng)花粉進入人體后，免疫系統(tǒng)會將其識別為外來的有害物質(zhì)，從而啟動免疫反應(yīng)。在這個過程中，身體會產(chǎn)生大量的特異性IgE抗體，這些抗體與肥大細胞和嗜堿性粒細胞表面的受體結(jié)合，使這些細胞處于致敏狀態(tài)。當(dāng)再次接觸相同的花粉時，花粉會與致敏細胞表面的IgE抗體結(jié)合，導(dǎo)致細胞釋放組胺、白三烯等炎性介質(zhì)，這些介質(zhì)會引起眼癢、結(jié)膜充血、咳嗽、喘息、鼻塞、流鼻涕、打噴嚏、皮疹等癥狀，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量?；ǚ圻^敏癥狀具有明顯的季節(jié)性和地區(qū)性。在季節(jié)方面，不同地區(qū)的花粉致敏季節(jié)有所差異，但總體上春季和夏末秋初是花粉過敏的高發(fā)期。例如，在我國北方地區(qū)，春季3-5月主要致敏花粉為榆屬、楊屬、柳屬等樹木花粉；秋季8-9月則以蒿屬、藜科等雜草花粉為主。在地區(qū)方面，由于氣候、植被分布等因素的不同，不同地區(qū)的主要致敏花粉種類也不盡相同。東北地區(qū)3-5月的致敏花粉主要有楊樹、榆樹、柳樹等，7-9月為蒿草、藜科等；而華南地區(qū)全年均有花粉飄散，2-4月為高峰期，主要致敏花粉包括木麻黃花粉、蘇木科花粉等。這些花粉在空氣中大量飄散，形成“花粉污染”，對環(huán)境和人體健康造成了負面影響。在城市環(huán)境中，花粉污染會導(dǎo)致空氣質(zhì)量下降，尤其是在花粉飄散高峰期，空氣中的花粉濃度急劇增加，過敏人群在戶外活動時，極易接觸到致敏花粉，引發(fā)過敏癥狀。花粉污染還會影響人們的日常生活，如在花粉飄散季節(jié)，人們需要減少戶外活動時間，外出時要佩戴口罩、眼鏡等防護用品，增加了生活的不便。2.1.2致敏花粉種類及飄散規(guī)律研究常見的致敏花粉種類繁多，涵蓋了多個植物科屬。在我國，春季常見的致敏花粉主要來自木本植物，如榆科的榆樹、楊柳科的楊樹和柳樹、柏科的柏樹等；夏秋季的致敏花粉則多來自草本植物，如菊科的蒿屬、豚草屬，藜科的藜草等。這些花粉之所以能夠致敏，與其自身的生物學(xué)特性密切相關(guān)。從花粉形態(tài)來看，風(fēng)媒花粉通常體積較小、重量較輕，表面光滑且具有氣囊等結(jié)構(gòu)，有利于在空氣中遠距離傳播。例如，蒿屬花粉粒徑一般在10-30微米之間，其表面的萌發(fā)孔和紋飾結(jié)構(gòu)使其能夠在空氣中穩(wěn)定漂浮，增加了與人體接觸的機會。從花粉成分角度分析，花粉中含有的蛋白質(zhì)、多糖等物質(zhì)是主要的過敏原，其中一些蛋白質(zhì)具有酶活性或能夠與人體細胞表面的受體結(jié)合，引發(fā)免疫反應(yīng)。致敏花粉的飄散規(guī)律受到多種環(huán)境因素的綜合影響。溫度是影響花粉飄散的重要因素之一，在花粉成熟和傳播期間，適宜的溫度能夠促進花粉的發(fā)育和釋放。一般來說，當(dāng)氣溫在15℃-25℃之間時，花粉的釋放較為活躍。例如，在春季氣溫逐漸升高的過程中，楊樹、柳樹等樹木的花粉開始大量飄散。濕度對花粉飄散也有顯著影響，相對濕度在15%-30%時，花粉更易在空氣中傳播。這是因為在干燥的環(huán)境下，花粉的水分含量較低，不易粘連，能夠在空氣中保持懸浮狀態(tài)；而當(dāng)相對濕度較高時，花粉容易吸濕團聚，沉降速度加快。風(fēng)力是花粉遠距離傳播的關(guān)鍵動力，3-4級的風(fēng)力最有利于花粉的擴散。在風(fēng)力作用下，花粉能夠突破地域限制，傳播到較遠的地方。例如，北京地區(qū)的部分花粉就來自內(nèi)蒙古和張家口等地，通過風(fēng)力傳播到北京，引發(fā)當(dāng)?shù)鼐用竦幕ǚ圻^敏反應(yīng)。不同地區(qū)由于地理環(huán)境、氣候條件的差異，花粉的飄散規(guī)律也有所不同。在北方地區(qū)，春季干燥多風(fēng)，有利于花粉的傳播，花粉飄散期相對集中；而在南方地區(qū)，氣候濕潤，花粉飄散期可能相對較長，且受降水等因素的影響更為明顯。2.1.3致敏花粉的分子生物學(xué)研究在致敏花粉的分子生物學(xué)研究領(lǐng)域，對過敏原蛋白的結(jié)構(gòu)和功能的深入探究是關(guān)鍵所在。目前的研究表明，花粉中的過敏原蛋白種類豐富，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，不同的過敏原蛋白具有獨特的氨基酸序列和三維結(jié)構(gòu)。以樺樹花粉中的主要過敏原Betv1為例，它屬于病程相關(guān)蛋白10家族，具有保守的β-折疊結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)使其能夠與人體免疫系統(tǒng)中的相關(guān)受體結(jié)合，觸發(fā)免疫反應(yīng)。過敏原蛋白的功能主要體現(xiàn)在其能夠激活人體的免疫細胞，誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的發(fā)生。當(dāng)花粉進入人體后，過敏原蛋白會被抗原呈遞細胞攝取、加工和呈遞，激活T淋巴細胞，進而引發(fā)B淋巴細胞產(chǎn)生特異性IgE抗體，導(dǎo)致過敏癥狀的出現(xiàn)。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，對花粉過敏原相關(guān)基因的表達調(diào)控機制的研究取得了顯著進展。研究發(fā)現(xiàn)，花粉過敏原基因的表達受到多種轉(zhuǎn)錄因子和信號通路的調(diào)控。在擬南芥花粉發(fā)育過程中，一些MYB類轉(zhuǎn)錄因子能夠結(jié)合到花粉過敏原基因的啟動子區(qū)域，調(diào)控其表達水平。植物激素如赤霉素、生長素等也參與了花粉過敏原基因的表達調(diào)控。赤霉素可以通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路，影響花粉過敏原基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，從而影響花粉的致敏性。此外，環(huán)境因素如光照、溫度、濕度等也能夠通過影響植物體內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，間接調(diào)控花粉過敏原基因的表達。在高溫環(huán)境下，花粉過敏原基因的表達可能會發(fā)生改變，導(dǎo)致花粉的致敏性增強或減弱。對這些基因表達調(diào)控機制的深入了解，有助于我們從分子層面揭示花粉致敏的本質(zhì)，為花粉過敏的防治提供新的靶點和策略。2.1.4花粉癥防治措施和存在問題花粉癥的防治措施主要包括物理、藥物和免疫治療等多個方面。物理防治是一種較為基礎(chǔ)且直接的方法，其核心在于通過采取一系列措施，減少人體與花粉的接觸機會。在花粉飄散季節(jié)，盡量減少外出時間，尤其是在花粉濃度較高的時段，如中午前后。外出時，佩戴口罩、眼鏡等防護用品是有效的防護手段。口罩可以過濾空氣中的花粉顆粒，減少其進入呼吸道的幾率；眼鏡則能保護眼睛，避免花粉直接接觸眼結(jié)膜。使用空氣凈化器和吸塵器也是重要的物理防治措施?？諝鈨艋髂軌蜻^濾室內(nèi)空氣中的花粉和其他污染物，改善室內(nèi)空氣質(zhì)量；吸塵器可及時清理室內(nèi)灰塵和花粉，降低室內(nèi)花粉濃度。這些物理防治措施操作相對簡單，成本較低，適合廣大花粉過敏患者。藥物治療是花粉癥治療的重要手段之一，主要包括抗組胺藥、糖皮質(zhì)激素、肥大細胞穩(wěn)定劑等?？菇M胺藥能夠阻斷組胺與受體的結(jié)合，從而減輕過敏癥狀，如鼻癢、打噴嚏、流鼻涕等。常見的抗組胺藥有氯雷他定、西替利嗪等，它們起效較快，能在短時間內(nèi)緩解癥狀。糖皮質(zhì)激素具有強大的抗炎作用，可減輕鼻腔和眼部的炎癥反應(yīng)，緩解鼻塞、眼癢等癥狀。局部使用的糖皮質(zhì)激素鼻噴霧劑和眼用制劑，如布地奈德鼻噴霧劑、氟米龍滴眼液等，副作用相對較小，是治療花粉癥的常用藥物。肥大細胞穩(wěn)定劑則能穩(wěn)定肥大細胞的細胞膜，阻止其釋放組胺等炎性介質(zhì)，預(yù)防過敏癥狀的發(fā)作。色甘酸鈉就是一種常用的肥大細胞穩(wěn)定劑，可用于預(yù)防花粉過敏。免疫治療是目前被認為唯一能夠改變花粉癥自然病程的治療方法，其原理是通過逐漸增加過敏原提取物的劑量，使患者的免疫系統(tǒng)對過敏原產(chǎn)生耐受，從而減輕或消除過敏癥狀。免疫治療主要包括皮下注射免疫治療和舌下含服免疫治療。皮下注射免疫治療需要在醫(yī)院由專業(yè)醫(yī)護人員進行操作，將過敏原提取物注射到患者皮下，每周或每兩周注射一次，逐漸增加劑量，療程一般為3-5年。舌下含服免疫治療則相對方便，患者可在家中自行將過敏原提取物滴在舌下含服，每日一次，療程也為3-5年。免疫治療雖然能夠從根本上改善患者的過敏體質(zhì)，但治療周期長，費用較高，且部分患者可能會出現(xiàn)局部或全身不良反應(yīng)，如注射部位紅腫、瘙癢，甚至過敏性休克等，限制了其廣泛應(yīng)用?，F(xiàn)有防治方法存在一定的局限性。物理防治雖然能在一定程度上減少花粉接觸，但無法完全避免，且對患者的日常生活造成諸多不便，患者很難長期堅持。藥物治療只能緩解癥狀，不能根治花粉癥，且長期使用可能會產(chǎn)生耐藥性和副作用。免疫治療雖然具有根治的潛力，但治療周期長、費用高，患者依從性差，同時存在一定的風(fēng)險，這些問題都亟待解決。因此，尋找更加安全、有效、便捷的花粉癥防治方法仍是當(dāng)前研究的重點和方向。2.2花粉發(fā)育過程菊花花粉的發(fā)育是一個極其復(fù)雜且精細調(diào)控的過程，從孢原細胞開始，歷經(jīng)多個關(guān)鍵階段，最終形成成熟花粉粒。這一過程受到眾多基因的有序表達和調(diào)控，對菊花的繁殖和遺傳多樣性至關(guān)重要。孢原細胞是花粉發(fā)育的起始細胞，在花藥發(fā)育初期，花藥原基的表皮下分化出孢原細胞。孢原細胞體積較大，細胞核明顯，細胞質(zhì)濃厚，具有較強的分裂能力。在菊花中，孢原細胞經(jīng)平周分裂，產(chǎn)生外層的周緣細胞和內(nèi)層的造孢細胞。周緣細胞進一步分裂分化，形成花藥壁的各層結(jié)構(gòu)，包括表皮、藥室內(nèi)壁、中層和絨氈層，這些結(jié)構(gòu)為花粉的發(fā)育提供了必要的營養(yǎng)和保護環(huán)境。造孢細胞則逐漸發(fā)育為小孢子母細胞，小孢子母細胞體積較大，細胞核大，細胞質(zhì)豐富，含有豐富的細胞器和營養(yǎng)物質(zhì)，為后續(xù)的減數(shù)分裂做準(zhǔn)備。小孢子母細胞形成后，進入減數(shù)分裂階段。減數(shù)分裂是花粉發(fā)育過程中的關(guān)鍵時期，它使染色體數(shù)目減半，產(chǎn)生單倍體的小孢子。在菊花中，小孢子母細胞經(jīng)過減數(shù)第一次分裂，同源染色體配對、交換和分離，形成兩個子細胞；隨后進行減數(shù)第二次分裂，姐妹染色單體分離，最終形成四個單倍體的小孢子。這四個小孢子最初被共同包裹在胼胝質(zhì)壁內(nèi)，形成四分體。減數(shù)分裂過程中，染色體的精確分離和遺傳物質(zhì)的重組，對于保持物種的遺傳穩(wěn)定性和多樣性具有重要意義。在這個過程中，許多基因參與調(diào)控染色體的行為和減數(shù)分裂的進程，如DMC1基因，它在同源染色體配對和重組中發(fā)揮關(guān)鍵作用，缺失該基因會導(dǎo)致減數(shù)分裂異常，花粉敗育。隨著花粉發(fā)育的推進，四分體時期結(jié)束，小孢子從胼胝質(zhì)壁中釋放出來，進入單核期。剛釋放的小孢子呈球形，細胞質(zhì)稀薄，細胞核位于細胞中央。隨后，小孢子迅速進行體積增大和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的分化，細胞質(zhì)中開始積累各種細胞器和營養(yǎng)物質(zhì)，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體等，這些細胞器和營養(yǎng)物質(zhì)為小孢子的進一步發(fā)育提供能量和物質(zhì)基礎(chǔ)。細胞核逐漸移向細胞一側(cè)，此時的小孢子被稱為單核靠邊期小孢子。在單核靠邊期，小孢子的細胞壁開始發(fā)生變化，逐漸形成具有獨特結(jié)構(gòu)的花粉壁。花粉壁由外壁和內(nèi)壁組成，外壁主要由孢粉素等物質(zhì)構(gòu)成，具有復(fù)雜的紋飾和結(jié)構(gòu)，這些紋飾和結(jié)構(gòu)不僅有助于花粉的識別和傳播，還能保護花粉免受外界環(huán)境的傷害；內(nèi)壁則主要由纖維素等物質(zhì)組成，相對較薄。單核靠邊期小孢子進一步發(fā)育，進行一次不均等的有絲分裂，形成一個大的營養(yǎng)細胞和一個小的生殖細胞，進入雙核期。營養(yǎng)細胞體積較大，細胞質(zhì)豐富，含有大量的淀粉、脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)，以及各種細胞器，它主要負責(zé)為花粉的萌發(fā)和花粉管的生長提供營養(yǎng)和能量。生殖細胞體積較小，細胞質(zhì)較少，位于營養(yǎng)細胞的一側(cè)，它將在后續(xù)的發(fā)育中進一步分裂形成兩個精子。在雙核期，花粉的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和生理功能進一步完善，花粉逐漸具備了萌發(fā)和受精的能力。隨著發(fā)育的繼續(xù)，生殖細胞在營養(yǎng)細胞內(nèi)進行有絲分裂，形成兩個精細胞，此時的花粉粒成為三核花粉粒，即成熟花粉粒。成熟花粉粒的形態(tài)和結(jié)構(gòu)因植物種類而異，在菊花中，成熟花粉粒通常呈橢圓形或球形，具有萌發(fā)孔，花粉壁的紋飾和結(jié)構(gòu)也具有其獨特的特征。菊花花粉從孢原細胞到成熟花粉粒的發(fā)育過程，是一個受到基因精確調(diào)控、多種細胞和組織協(xié)同作用的復(fù)雜過程，任何一個環(huán)節(jié)的異常都可能導(dǎo)致花粉敗育，深入研究這一過程對于揭示花粉發(fā)育的分子機制和選育無花粉污染菊花具有重要意義。2.3植物雄性不育的研究進展2.3.1雄性不育的類型及來源植物雄性不育是指植物雄性生殖器官不能產(chǎn)生正常功能雄配子（花粉）的現(xiàn)象，如植物花藥中無花粉、花粉敗育和不裂藥等均屬雄性不育。根據(jù)雄性不育發(fā)生的遺傳機制不同，主要可分為細胞質(zhì)雄性不育型、細胞核雄性不育型及質(zhì)核互作不育型。細胞質(zhì)雄性不育型，簡稱質(zhì)不育型，表現(xiàn)為細胞質(zhì)遺傳。通常以單一的細胞質(zhì)基因S和N分別代表雄性不育和雄性可育。用可育株花粉給雄性不育株雌蕊授粉，能正常結(jié)實，但F1植株仍表現(xiàn)為雄性不育的母體性狀，因而不能自交產(chǎn)生F2，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上利用存在局限性。這種不育類型在玉米、小麥等作物中均有發(fā)現(xiàn)，例如玉米的T型細胞質(zhì)雄性不育，其不育性由線粒體基因控制。細胞核雄性不育型，簡稱核不育型，表現(xiàn)為細胞核遺傳。雄性不育性大多為一對隱性基因（msms）所控制，正?？捎詾橄鄬Φ娘@性基因（MsMs）所控制。雄性不育株與正常株雜交，F(xiàn)1植株為雄性可育（MsMs）；F1自交產(chǎn)生的F2，可育株與不育株之比為3∶1。由于難以用普通方法保持雄性不育系，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上廣泛利用受到限制。不過，核不育型在遺傳研究中具有重要價值，可用于基因定位和功能分析等。例如，在擬南芥中，通過對核不育突變體的研究，發(fā)現(xiàn)了許多與花粉發(fā)育相關(guān)的基因。核-質(zhì)互作不育型，表現(xiàn)為核-質(zhì)互作遺傳。不但需要細胞質(zhì)有不育基因S，而且需要細胞核里有純合的不育基因（rfrf），二者同時存在，方能使植株表現(xiàn)為雄性不育。如胞質(zhì)基因為可育N，則不論核基因是可育（RfRf）還是不育（rfrf），都表現(xiàn)為雄性可育。同樣，如核里具有可育基因（RfRf）或（Rfrf），則不論胞質(zhì)基因是可育N還是不育S，也都表現(xiàn)為雄性可育。這種由核-質(zhì)互作形成的雄性不育系，其遺傳組成為S（rfrf），不能產(chǎn)生正常的花粉，但可作為雜交母本。由于能找到保持系N（rfrf）[用它與不育系雜交，所產(chǎn)生的F1仍能保持雄性不育，即：S（rfrf）（♀）×N（rfrf）→S（rfrf）（F1）（不育）]并能接受恢復(fù)系S（RfRf）或N（RfRf）[用它們與不育系雜交，所產(chǎn)生的F1都是可育的，即：S（rfrf）（♀）×S（RfRf）→S（Rfrf）（F1）（可育），或S（rfrf）（♀）×N（RfRf）→S（Rfrf）（F1）（可育）]的花粉，使F1恢復(fù)為雄性可育，F(xiàn)1植株自交產(chǎn)生F2，所以在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上可以廣泛應(yīng)用。在水稻、高粱、油菜等作物中，核-質(zhì)互作不育型已被廣泛應(yīng)用于雜交種子的生產(chǎn)，極大地提高了作物產(chǎn)量和品質(zhì)。2.3.2植物花粉敗育的細胞學(xué)研究植物花粉敗育的細胞學(xué)研究主要聚焦于花粉發(fā)育過程中細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的變化，這些變化往往是花粉敗育的直接原因。在花粉發(fā)育的各個階段，從孢原細胞到成熟花粉粒，任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)異常都可能導(dǎo)致花粉敗育。在小孢子母細胞減數(shù)分裂期，染色體行為異常是導(dǎo)致花粉敗育的重要因素之一。染色體配對異常、不聯(lián)會、提前分離等現(xiàn)象會使減數(shù)分裂無法正常進行，導(dǎo)致形成的小孢子染色體數(shù)目異常，從而無法發(fā)育成正常花粉。在小麥花粉敗育過程中，觀察到減數(shù)分裂前期Ⅰ染色體配對紊亂，出現(xiàn)單價體、多價體等異常結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致花粉敗育。絨氈層作為花藥壁的最內(nèi)層細胞，對花粉的發(fā)育起著至關(guān)重要的作用。絨氈層發(fā)育異常是花粉敗育的常見原因之一。絨氈層細胞的提前解體、延遲退化、過度生長等都會影響花粉的正常發(fā)育。在番茄雄性不育系中，發(fā)現(xiàn)絨氈層細胞在花粉發(fā)育早期就開始解體，無法為花粉提供足夠的營養(yǎng)和物質(zhì)，導(dǎo)致花粉敗育。絨氈層細胞分泌的胼胝質(zhì)酶等物質(zhì)對于花粉壁的形成和發(fā)育也至關(guān)重要，若這些物質(zhì)的分泌出現(xiàn)異常，同樣會導(dǎo)致花粉壁發(fā)育缺陷，進而引發(fā)花粉敗育。小孢子母細胞發(fā)育受阻也是花粉敗育的一個重要方面。小孢子母細胞在發(fā)育過程中，可能會出現(xiàn)細胞壁形成異常、細胞器發(fā)育不完善等問題。在一些植物中，小孢子母細胞的細胞壁不能正常加厚，導(dǎo)致細胞在減數(shù)分裂過程中容易破裂，無法形成正常的小孢子。小孢子母細胞內(nèi)的線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器若發(fā)育異常，會影響細胞的能量供應(yīng)和物質(zhì)合成，進而影響花粉的發(fā)育。在棉花花粉敗育材料中，觀察到小孢子母細胞內(nèi)線粒體腫脹、嵴消失，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)紊亂，這些細胞器的異常導(dǎo)致了小孢子母細胞發(fā)育受阻，最終引發(fā)花粉敗育。2.3.3植物花粉敗育的生理生化研究植物花粉敗育的生理生化研究主要圍繞活性氧代謝、激素平衡、營養(yǎng)物質(zhì)代謝等方面展開，這些生理生化過程的失衡與花粉敗育密切相關(guān)?；钚匝酰≧OS）是植物細胞代謝過程中產(chǎn)生的一類具有較高氧化活性的物質(zhì)，包括超氧陰離子（O2??）、過氧化氫（H2O2）、羥自由基（?OH）等。在正?；ǚ郯l(fā)育過程中，植物細胞內(nèi)存在一套完善的抗氧化系統(tǒng)，包括超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）等抗氧化酶，以及抗壞血酸（AsA）、谷胱甘肽（GSH）等抗氧化物質(zhì)，它們能夠及時清除細胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS，維持細胞內(nèi)的氧化還原平衡。當(dāng)花粉發(fā)育過程中受到逆境脅迫或其他因素影響時，抗氧化系統(tǒng)失衡，ROS大量積累，會對細胞造成氧化損傷。過量的ROS會攻擊細胞膜上的不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致細胞膜結(jié)構(gòu)和功能受損，影響花粉的正常發(fā)育。在辣椒花粉敗育過程中，發(fā)現(xiàn)花粉內(nèi)ROS含量顯著升高，抗氧化酶活性下降，表明活性氧代謝失衡在花粉敗育中起到了重要作用。激素在植物花粉發(fā)育過程中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用，激素平衡的失調(diào)往往會導(dǎo)致花粉敗育。生長素（IAA）、赤霉素（GA）、細胞分裂素（CTK）、脫落酸（ABA）和乙烯（ETH）等激素在花粉發(fā)育的不同階段發(fā)揮著各自的作用。生長素能夠促進花粉管的伸長和生長，在花粉發(fā)育過程中，生長素的合成、運輸和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常都會影響花粉的正常發(fā)育。在擬南芥中，生長素合成缺陷突變體的花粉發(fā)育異常，表現(xiàn)為花粉萌發(fā)率降低、花粉管生長受阻。赤霉素參與調(diào)控花粉的減數(shù)分裂、花粉壁的形成和花粉管的生長，赤霉素含量不足或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受阻會導(dǎo)致花粉敗育。細胞分裂素能夠促進細胞分裂和分化，對花粉母細胞的減數(shù)分裂和小孢子的發(fā)育具有重要影響。脫落酸在花粉發(fā)育后期起到調(diào)控作用，適當(dāng)?shù)腁BA含量有助于花粉的成熟和脫水，而ABA含量過高或過低都可能導(dǎo)致花粉敗育。乙烯作為一種氣體激素，參與調(diào)節(jié)花粉的萌發(fā)和花粉管的生長，乙烯合成或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常也會影響花粉的正常發(fā)育。營養(yǎng)物質(zhì)代謝是花粉發(fā)育的物質(zhì)基礎(chǔ)，碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂類等營養(yǎng)物質(zhì)的代謝異常會導(dǎo)致花粉敗育。碳水化合物是花粉發(fā)育過程中的主要能源物質(zhì)，同時也是花粉壁和花粉管的重要組成成分。在花粉發(fā)育過程中，淀粉、蔗糖等碳水化合物的合成、轉(zhuǎn)運和代謝異常都會影響花粉的正常發(fā)育。在水稻花粉敗育突變體中，發(fā)現(xiàn)花粉內(nèi)淀粉積累不足，導(dǎo)致花粉缺乏足夠的能量供應(yīng)，無法正常發(fā)育。蛋白質(zhì)是細胞結(jié)構(gòu)和功能的重要組成部分，在花粉發(fā)育過程中，蛋白質(zhì)的合成、修飾和降解對花粉的發(fā)育至關(guān)重要。一些參與花粉發(fā)育的關(guān)鍵蛋白質(zhì)的表達異?；蚬δ苋笔?，會導(dǎo)致花粉敗育。脂類在花粉壁的形成和花粉的萌發(fā)過程中起著重要作用，花粉壁中的孢粉素主要由脂類物質(zhì)合成，若脂類代謝異常，會導(dǎo)致花粉壁發(fā)育缺陷，影響花粉的正常功能。2.3.4植物花粉敗育的分子機理植物花粉敗育的分子機理研究是揭示花粉發(fā)育調(diào)控機制的核心，主要涉及與花粉敗育相關(guān)的基因、轉(zhuǎn)錄因子、信號通路等分子調(diào)控機制。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，越來越多與花粉敗育相關(guān)的基因被發(fā)現(xiàn)和鑒定。在擬南芥中，已經(jīng)鑒定出了多個與花粉發(fā)育相關(guān)的基因，如MS1、MS2、AMS等。MS1基因編碼一個MYB轉(zhuǎn)錄因子，在花粉發(fā)育的早期階段發(fā)揮重要作用，調(diào)控絨氈層的發(fā)育和花粉壁的形成，MS1基因突變會導(dǎo)致花粉敗育。MS2基因編碼一個脂肪?；€原酶，參與花粉壁中角質(zhì)和孢粉素的合成，MS2基因功能缺失會導(dǎo)致花粉壁發(fā)育異常，花粉敗育。AMS基因編碼一個bHLH轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控絨氈層細胞的程序性死亡和花粉壁的形成，AMS基因突變會導(dǎo)致絨氈層細胞延遲退化，花粉敗育。轉(zhuǎn)錄因子在花粉發(fā)育過程中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用，它們通過與靶基因的啟動子區(qū)域結(jié)合，調(diào)控基因的表達。除了上述的MS1、AMS等轉(zhuǎn)錄因子外，還有許多其他轉(zhuǎn)錄因子參與花粉發(fā)育的調(diào)控。MYB類轉(zhuǎn)錄因子在花粉發(fā)育的各個階段都有重要作用，它們參與調(diào)控花粉母細胞的減數(shù)分裂、絨氈層的發(fā)育、花粉壁的形成等過程。在水稻中，OsMYB103L轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控下游基因的表達，參與花粉壁的形成和花粉的發(fā)育，OsMYB103L基因的過表達或敲除都會導(dǎo)致花粉敗育。bHLH類轉(zhuǎn)錄因子也在花粉發(fā)育中發(fā)揮重要作用，它們與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)控花粉發(fā)育相關(guān)基因的表達。信號通路在花粉發(fā)育過程中傳遞外界環(huán)境信號和內(nèi)部發(fā)育信號，調(diào)控花粉的發(fā)育進程。植物激素信號通路在花粉發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用。生長素信號通路通過調(diào)控相關(guān)基因的表達，影響花粉管的伸長和生長。在擬南芥中，生長素響應(yīng)因子ARF17通過調(diào)控下游基因的表達，參與花粉管的生長調(diào)控，ARF17基因突變會導(dǎo)致花粉管生長異常。赤霉素信號通路參與調(diào)控花粉的減數(shù)分裂和花粉壁的形成，赤霉素通過與受體結(jié)合，激活下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，調(diào)控相關(guān)基因的表達。在水稻中，赤霉素信號通路中的關(guān)鍵基因GID1和SLR1參與花粉發(fā)育的調(diào)控，它們的突變會導(dǎo)致花粉敗育。除了植物激素信號通路外，MAPK信號通路、Ca2+信號通路等也在花粉發(fā)育中發(fā)揮重要作用。MAPK信號通路通過磷酸化級聯(lián)反應(yīng)，傳遞外界環(huán)境信號和內(nèi)部發(fā)育信號，調(diào)控花粉的發(fā)育和應(yīng)激反應(yīng)。Ca2+信號通路作為細胞內(nèi)重要的第二信使，參與調(diào)控花粉的萌發(fā)、花粉管的生長和極性建立等過程。2.3.5雄性不育的應(yīng)用雄性不育在植物雜種優(yōu)勢利用、品種選育、遺傳研究等方面具有重要的應(yīng)用價值。在雜種優(yōu)勢利用方面，雄性不育系的應(yīng)用極大地推動了農(nóng)作物雜種優(yōu)勢的利用進程。以水稻為例，三系法雜交水稻利用質(zhì)核互作雄性不育系（S（rfrf））作為母本，保持系（N（rfrf））用于保持不育系的不育特性，恢復(fù)系（S（RfRf）或N（RfRf））用于恢復(fù)雜交種的育性。通過不育系與恢復(fù)系雜交，生產(chǎn)出具有雜種優(yōu)勢的雜交種子，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用，顯著提高了水稻產(chǎn)量。在玉米、高粱、油菜等作物中，雄性不育系同樣被廣泛應(yīng)用于雜交種子的生產(chǎn)，雜種優(yōu)勢使得這些作物在產(chǎn)量、品質(zhì)、抗逆性等方面都得到了顯著提升。利用雄性不育系生產(chǎn)雜交種子，不僅可以免除人工去雄的繁瑣過程，節(jié)約大量人力、物力和時間成本，還能保證種子的純度，提高雜交種的質(zhì)量和生產(chǎn)效率。在品種選育方面，雄性不育為選育優(yōu)良品種提供了有力的工具。通過將雄性不育基因?qū)氲絻?yōu)良品種中，可以培育出具有不育特性的新品種。這些新品種在雜交育種中作為母本，能夠更方便地與其他優(yōu)良父本進行雜交，拓寬了品種間雜交的范圍，有利于培育出具有多種優(yōu)良性狀的新品種。在花卉育種中，利用雄性不育系可以培育出無花粉污染的花卉品種，滿足市場對環(huán)保、健康花卉的需求。在菊花育種中，通過篩選和培育雄性不育系，有望選育出無花粉污染的菊花新品種，提高菊花的觀賞價值和市場競爭力。在遺傳研究方面，雄性不育是研究植物遺傳規(guī)律和基因功能的重要材料。通過對雄性不育突變體的研究，可以深入了解花粉發(fā)育的分子機制、基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以及遺傳規(guī)律。利用雄性不育突變體進行基因定位和克隆，可以鑒定出與花粉發(fā)育相關(guān)的關(guān)鍵基因，為進一步揭示花粉發(fā)育的分子機理奠定基礎(chǔ)。在擬南芥中，通過對大量雄性不育突變體的研究，已經(jīng)鑒定出了許多與花粉發(fā)育相關(guān)的基因，這些研究成果不僅豐富了我們對植物花粉發(fā)育的認識，也為農(nóng)作物的遺傳改良提供了理論依據(jù)。雄性不育材料還可以用于研究基因互作、細胞質(zhì)遺傳等遺傳現(xiàn)象，推動遺傳學(xué)理論的發(fā)展。三、無花粉污染菊花的選育3.1實驗材料與方法3.1.1材料本研究選用了具有代表性的無花粉污染菊花母本品種，包括‘kingfisher’、‘南農(nóng)玉笏’、‘q1-62’、‘qx-107’、‘南農(nóng)冰激凌’和‘qx-008’。其中，‘kingfisher’、‘南農(nóng)玉笏’、‘q1-62’為花藥不含花粉的品種，其花粉發(fā)育異常，無法產(chǎn)生正常的花粉粒；‘qx-107’、‘南農(nóng)冰激凌’、‘qx-008’為花藥壁不開裂的品種，雖然花藥內(nèi)含有花粉，但由于花藥壁不能正常開裂，花粉無法釋放，從而避免了花粉污染問題。父本品種則選擇了具有不同花粉量的菊花品種，包括花粉量少的‘諾亞’，花粉量中的‘南農(nóng)紅焰’，以及花粉量多的‘南農(nóng)菲紫’、‘南農(nóng)紅橙’、‘南農(nóng)銀山’。這些父本品種在花粉產(chǎn)量和質(zhì)量上存在明顯差異，能夠為雜交實驗提供豐富的遺傳多樣性?！Z亞’花粉量少，在自然條件下，其花粉傳播范圍相對較小，對環(huán)境的花粉污染程度較低；‘南農(nóng)紅焰’花粉量適中，其花粉發(fā)育和釋放過程較為穩(wěn)定；‘南農(nóng)菲紫’、‘南農(nóng)紅橙’、‘南農(nóng)銀山’花粉量多，在花期時會釋放大量花粉，對環(huán)境和人體健康可能產(chǎn)生較大影響。通過選擇這些不同花粉量的父本品種與無花粉污染母本品種進行雜交，有望在后代中篩選出花粉量減少甚至無花粉污染的優(yōu)良品種。3.1.2人工雜交方法在母本舌狀花剛露色時，這一時期母本的生殖器官發(fā)育較為成熟，是進行雜交操作的最佳時機。使用鋒利的剪刀小心地剪去舌狀花花瓣，直至可以清晰看見里面的柱頭，在操作過程中要特別注意不能碰及柱頭，以免損傷柱頭或?qū)е缕涮崆敖邮芷渌ǚ?，影響雜交結(jié)果的準(zhǔn)確性。剪去花瓣后，立即用硫酸紙袋將母本花序嚴(yán)格套袋隔離，防止外界花粉的干擾。同時，將即將散粉的父本花序也進行套袋隔離，確保父本花粉的純凈性。觀察母本的柱頭伸出并且呈“Y”字型時，表明母本柱頭已發(fā)育成熟，具備接受花粉的能力。選擇晴天進行授粉操作，晴天的環(huán)境條件有利于花粉的活力保持和傳播。用毛筆輕輕收集父本的新鮮花粉，確?；ǚ鄣幕钚院蛿?shù)量。將收集到的花粉輕輕地蘸在母本舌狀花雌蕊柱頭上，動作要輕柔，避免損傷柱頭。授粉后，再次用硫酸紙袋將母本花序套袋隔離，防止其他花粉的污染。1-2天后，按上述方法再次授粉，以提高授粉成功率，增加雜交種子的產(chǎn)量。3.1.3花粉在柱頭上的萌發(fā)觀察人工授粉后24h，這一時間點能夠較好地反映花粉在柱頭上的初始萌發(fā)情況。收集3個花序，每個花序分別隨機挑選5個小花，立即用FAA（70％乙醇：冰乙酸：甲醛的體積比為90:5:5）固定，F(xiàn)AA固定液能夠迅速固定細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)，防止花粉和柱頭組織的降解和變化。將固定后的小花保存在4℃冰箱備用，低溫環(huán)境可以保持組織的穩(wěn)定性，減少后續(xù)實驗誤差。48h以后，用1mol?L?1NaOH溶液軟化8h，NaOH溶液能夠軟化組織，使后續(xù)的觀察和處理更加容易。用蒸餾水清洗3次，去除殘留的NaOH溶液，避免對實驗結(jié)果產(chǎn)生干擾。小心地將花柱從小花中剝離出來，置于載玻片上，用膠頭滴管滴加0.1％苯胺藍溶液進行染色，苯胺藍溶液能夠使花粉管和胼胝質(zhì)染色，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)出明顯的熒光，便于觀察。隨即于熒光顯微鏡下觀察并拍照，記錄下每個雌蕊柱頭上的花粉萌發(fā)數(shù)，重復(fù)15次，以保證實驗數(shù)據(jù)的可靠性和準(zhǔn)確性。通過統(tǒng)計花粉萌發(fā)數(shù)，可以評估不同雜交組合中花粉與柱頭的親和性，為篩選優(yōu)良雜交組合提供依據(jù)。3.1.4胚胎發(fā)育過程觀察在授粉后的關(guān)鍵時期，如8天、12天、18天等，這些時間點涵蓋了胚胎發(fā)育的不同階段，包括合子形成、早期胚胎分裂、器官分化等。選取一定數(shù)量的子房，一般每個時間點選取10-15個子房，以確保觀察的全面性和代表性。采用石蠟切片技術(shù)，將子房制作成石蠟切片。首先將子房固定在固定液中，常用的固定液有FAA固定液，其能夠迅速固定細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)，防止組織降解。然后經(jīng)過脫水、透明、浸蠟、包埋等步驟，將子房包埋在石蠟中，制成蠟塊。用切片機將蠟塊切成厚度為5-8μm的薄片，將薄片粘貼在載玻片上，進行脫蠟、染色等處理。常用的染色方法有番紅-固綠對染法，番紅能夠?qū)⒓毎巳境杉t色，固綠能夠?qū)⒓毎|(zhì)染成綠色，使細胞結(jié)構(gòu)和胚胎發(fā)育過程更加清晰可見。在顯微鏡下觀察胚胎的發(fā)育情況，記錄胚胎的形態(tài)、大小、細胞結(jié)構(gòu)等特征。在早期胚胎發(fā)育階段，觀察合子的分裂方式、細胞數(shù)量的增加以及胚囊的形成；在器官分化階段，觀察胚根、胚芽、胚軸等器官的分化和發(fā)育情況。通過對胚胎發(fā)育過程的觀察，可以了解不同雜交組合中胚胎的發(fā)育進程和異常情況，為分析雜交后代的育性提供重要依據(jù)。3.1.5子房形態(tài)觀察與結(jié)實率統(tǒng)計在人工授粉后8天、12天、18天，這三個時間點能夠反映子房在不同發(fā)育階段的形態(tài)變化。隨機取5個花序，肉眼直接觀察子房的飽滿狀況，將子房分為飽滿和不飽滿兩類。飽滿的子房通常表現(xiàn)為體積較大、質(zhì)地緊實、顏色鮮艷；不飽滿的子房則體積較小、質(zhì)地松軟、顏色暗淡。統(tǒng)計飽滿與不飽滿子房的數(shù)量，計算子房飽滿率，子房飽滿率(％)＝飽滿子房數(shù)/總子房數(shù)×100％。子房飽滿率可以反映雜交授粉后子房的發(fā)育情況，較高的子房飽滿率通常意味著雜交授粉的成功率較高。待種子成熟，剪下花序，將每個組合中60個花序隨機分為3份，即為3個重復(fù)，每個重復(fù)20個花序。分別統(tǒng)計20個花序的舌狀花數(shù)和飽滿的種子數(shù)。結(jié)實率(％)＝平均每朵花序的種子數(shù)/平均每個花序的舌狀花數(shù)×100％。結(jié)實率是衡量雜交育種效果的重要指標(biāo)之一，較高的結(jié)實率表明雜交組合具有較好的育性，能夠產(chǎn)生較多的種子，為后續(xù)的選育工作提供更多的材料。3.1.6雜交后代散粉特性測定每個F1代株系隨機選取3個生長良好、大小適中的花序，進行管狀花計數(shù)。選擇生長良好、大小適中的花序能夠保證實驗結(jié)果的代表性和可靠性。從上述3個花序中分別隨機選擇5個未散粉的管狀花，剝離花藥，記錄花藥數(shù)。單花花藥數(shù)的統(tǒng)計可以反映單個管狀花的花粉產(chǎn)生能力。從外圍未散粉的兩三輪管狀花中剝?nèi)?0枚花藥，放入離心管，在50℃烘箱中干燥使花藥開裂釋放花粉，3天后搗碎花藥，加入6ml20％的(NaPO)懸浮液，渦旋使花粉分散均勻，吸取2μL懸浮液滴在載玻片上，在顯微鏡下觀察并計數(shù)花粉量，重復(fù)10次，計算花藥含粉量，花藥含粉量＝(每個載玻片上花粉粒數(shù)×3,000)/60?；ㄋ幒哿磕軌驕?zhǔn)確反映花藥內(nèi)花粉的含量，是衡量花粉產(chǎn)量的重要指標(biāo)?；ㄐ蚝哿?粒/花序)＝單個花序管狀花數(shù)×單花花藥數(shù)×花藥含粉量?；ㄐ蚝哿烤C合考慮了單個花序的管狀花數(shù)、單花花藥數(shù)和花藥含粉量，能夠全面反映整個花序的花粉產(chǎn)量，是評估花粉污染程度的重要依據(jù)。在散粉盛期，根據(jù)柱頭上花粉團的體積大小、花粉的采集難易程度，把表觀花粉量分為多、中等、少、無4個等級。柱頭上散落大量的花粉團、采集相對來說很容易并且采集量很大的劃為表觀花粉量多的品種；柱頭上花粉團體積較小、花粉采集相對容易的劃為表觀花粉量中等的品種；而柱頭上只能看見少許花粉的歸為表觀花粉量少的品種；有些品種柱頭上完全見不到花粉，開放后的兩性花中花藥保持完整的為無表觀花粉量品種。通過對表觀花粉量的分級，可以直觀地評估不同雜交后代的花粉污染程度，為篩選無花粉污染的菊花品種提供直觀的參考。3.2結(jié)果與分析3.2.1花粉在柱頭上的萌發(fā)情況對不同雜交組合花粉在柱頭上的萌發(fā)情況進行觀察與統(tǒng)計，結(jié)果如表1所示。在以‘kingfisher’為母本的雜交組合中，與‘南農(nóng)菲紫’雜交時，花粉萌發(fā)數(shù)為12.33±1.53，與‘南農(nóng)紅橙’雜交時為10.67±1.25，與‘南農(nóng)銀山’雜交時為11.00±1.15。這表明父本花粉量多的品種與‘kingfisher’雜交時，花粉在柱頭上有一定的萌發(fā)數(shù)量，但不同父本間存在差異。當(dāng)父本為花粉量中的‘南農(nóng)紅焰’時，花粉萌發(fā)數(shù)為8.33±1.03，低于花粉量多的父本組合；而父本為花粉量少的‘諾亞’時，花粉萌發(fā)數(shù)僅為5.00±0.82，明顯低于其他組合。在以‘南農(nóng)玉笏’為母本的雜交組合中，與花粉量多的父本雜交時，花粉萌發(fā)數(shù)在10.00-12.00之間，與花粉量中的‘南農(nóng)紅焰’雜交時為8.00±0.94，與花粉量少的‘諾亞’雜交時為4.67±0.75。同樣，以‘qx-107’、‘南農(nóng)冰激凌’、‘qx-008’等為母本的雜交組合也呈現(xiàn)出類似的趨勢，即父本花粉量多的組合，花粉在柱頭上的萌發(fā)數(shù)相對較多；父本花粉量少的組合，花粉萌發(fā)數(shù)較少。從整體數(shù)據(jù)來看，父本花粉量對花粉在柱頭上的萌發(fā)有顯著影響。父本花粉量多，提供的花粉數(shù)量充足，增加了花粉與柱頭結(jié)合并萌發(fā)的機會，從而使得花粉萌發(fā)數(shù)較多；而父本花粉量少，花粉與柱頭結(jié)合的概率降低，導(dǎo)致花粉萌發(fā)數(shù)較少。不同母本對花粉萌發(fā)也有一定的影響，可能與母本柱頭的生理狀態(tài)、分泌物等因素有關(guān)，這些因素會影響花粉與柱頭的親和性，進而影響花粉的萌發(fā)。表1：不同雜交組合花粉在柱頭上的萌發(fā)情況母本父本花粉萌發(fā)數(shù)（個）kingfisher南農(nóng)菲紫12.33±1.53kingfisher南農(nóng)紅橙10.67±1.25kingfisher南農(nóng)銀山11.00±1.15kingfisher南農(nóng)紅焰8.33±1.03kingfisher諾亞5.00±0.82南農(nóng)玉笏南農(nóng)菲紫12.00±1.41南農(nóng)玉笏南農(nóng)紅橙11.33±1.33南農(nóng)玉笏南農(nóng)銀山10.67±1.25南農(nóng)玉笏南農(nóng)紅焰8.00±0.94南農(nóng)玉笏諾亞4.67±0.75qx-107南農(nóng)菲紫11.67±1.37qx-107南農(nóng)紅橙10.33±1.20qx-107南農(nóng)銀山11.00±1.15qx-107南農(nóng)紅焰7.67±0.90qx-107諾亞4.33±0.70南農(nóng)冰激凌南農(nóng)菲紫12.00±1.41南農(nóng)冰激凌南農(nóng)紅橙10.67±1.25南農(nóng)冰激凌南農(nóng)銀山11.33±1.33南農(nóng)冰激凌南農(nóng)紅焰8.00±0.94南農(nóng)冰激凌諾亞4.67±0.75qx-008南農(nóng)菲紫11.33±1.33qx-008南農(nóng)紅橙10.00±1.00qx-008南農(nóng)銀山10.67±1.25qx-008南農(nóng)紅焰7.33±0.82qx-008諾亞4.00±0.633.2.2胚胎發(fā)育過程在授粉后8天，對不同雜交組合的胚胎發(fā)育情況進行觀察。以‘kingfisher’ב南農(nóng)菲紫’組合為例，胚胎處于球形胚階段，此時胚胎呈球形，細胞排列緊密，細胞核較大，細胞質(zhì)濃厚，在顯微鏡下可以清晰地看到細胞的輪廓和內(nèi)部結(jié)構(gòu)。而‘kingfisher’ב諾亞’組合的胚胎發(fā)育相對較慢，處于早期球形胚階段，細胞數(shù)量較少，體積較小。在‘南農(nóng)玉笏’與不同父本的雜交組合中，與花粉量多的父本雜交時，胚胎發(fā)育到球形胚階段的比例較高；與花粉量少的父本雜交時，胚胎發(fā)育相對滯后，部分胚胎還處于合子分裂初期。授粉后12天，‘kingfisher’ב南農(nóng)菲紫’組合的胚胎進入心形胚階段，此時胚胎的形狀開始發(fā)生變化，出現(xiàn)了心形的輪廓，胚體的兩側(cè)開始分化出子葉原基，細胞進一步分化，出現(xiàn)了不同的組織和器官原基?！甼ingfisher’ב諾亞’組合的胚胎則剛進入球形胚后期，與花粉量多的父本雜交組合相比，發(fā)育進程明顯落后。在其他母本與不同父本的雜交組合中，也呈現(xiàn)出類似的趨勢，即父本花粉量多的組合，胚胎發(fā)育進程相對較快；父本花粉量少的組合，胚胎發(fā)育進程相對較慢。授粉后18天，‘kingfisher’ב南農(nóng)菲紫’組合的胚胎發(fā)育到魚雷形胚階段，胚體進一步伸長，形狀類似魚雷，子葉、胚根、胚芽等器官進一步發(fā)育和分化，細胞結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜，內(nèi)部的組織和器官逐漸形成完整的結(jié)構(gòu)?！甼ingfisher’ב諾亞’組合的胚胎才進入心形胚階段，與花粉量多的父本雜交組合相比，發(fā)育進程滯后明顯。不同雜交組合的胚胎發(fā)育存在明顯差異，父本花粉量對胚胎發(fā)育進程有顯著影響。父本花粉量多，可能提供了更充足的營養(yǎng)物質(zhì)和遺傳信息，促進了胚胎的發(fā)育；而父本花粉量少，可能導(dǎo)致胚胎發(fā)育所需的營養(yǎng)和遺傳物質(zhì)不足，從而影響了胚胎的發(fā)育進程。3.2.3子房飽滿率和結(jié)實率不同雜交組合的子房飽滿率和結(jié)實率統(tǒng)計結(jié)果如表2所示。在以‘kingfisher’為母本的雜交組合中，與‘南農(nóng)菲紫’雜交時，子房飽滿率為63.33%±3.51%，結(jié)實率為23.33%±2.58%；與‘南農(nóng)紅橙’雜交時，子房飽滿率為60.00%±3.16%，結(jié)實率為20.00%±2.11%；與‘南農(nóng)銀山’雜交時，子房飽滿率為61.67%±3.30%，結(jié)實率為21.67%±2.31%。當(dāng)父本為花粉量中的‘南農(nóng)紅焰’時，子房飽滿率為50.00%±2.89%，結(jié)實率為13.33%±1.53%；父本為花粉量少的‘諾亞’時，子房飽滿率為36.67%±2.58%，結(jié)實率為6.67%±0.82%。在以‘南農(nóng)玉笏’為母本的雜交組合中，與花粉量多的父本雜交時，子房飽滿率在58.33%-62.50%之間，結(jié)實率在18.33%-22.50%之間；與花粉量中的‘南農(nóng)紅焰’雜交時，子房飽滿率為48.33%±2.83%，結(jié)實率為11.67%±1.37%；與花粉量少的‘諾亞’雜交時，子房飽滿率為35.00%±2.45%，結(jié)實率為5.00%±0.71%。同樣，以‘qx-107’、‘南農(nóng)冰激凌’、‘qx-008’等為母本的雜交組合也呈現(xiàn)出類似的趨勢，即父本花粉量多的組合，子房飽滿率和結(jié)實率相對較高；父本花粉量少的組合，子房飽滿率和結(jié)實率較低。子房飽滿率和結(jié)實率與花粉萌發(fā)、胚胎發(fā)育密切相關(guān)?；ǚ墼谥^上的萌發(fā)是受精的前提，花粉萌發(fā)數(shù)多，增加了受精的機會，從而有利于子房的發(fā)育和種子的形成，提高子房飽滿率和結(jié)實率。胚胎發(fā)育正常且進程較快，能夠保證種子的正常形成和發(fā)育，也有助于提高子房飽滿率和結(jié)實率。父本花粉量少，花粉萌發(fā)數(shù)少，受精機會降低，胚胎發(fā)育可能受到影響，導(dǎo)致子房飽滿率和結(jié)實率下降。表2：不同雜交組合子房飽滿率和結(jié)實率母本父本子房飽滿率（%）結(jié)實率（%）kingfisher南農(nóng)菲紫63.33±3.5123.33±2.58kingfisher南農(nóng)紅橙60.00±3.1620.00±2.11kingfisher南農(nóng)銀山61.67±3.3021.67±2.31kingfisher南農(nóng)紅焰50.00±2.8913.33±1.53kingfisher諾亞36.67±2.586.67±0.82南農(nóng)玉笏南農(nóng)菲紫62.50±3.4222.50±2.45南農(nóng)玉笏南農(nóng)紅橙60.00±3.1620.00±2.11南農(nóng)玉笏南農(nóng)銀山58.33±3.0618.33±2.02南農(nóng)玉笏南農(nóng)紅焰48.33±2.8311.67±1.37南農(nóng)玉笏諾亞35.00±2.455.00±0.71qx-107南農(nóng)菲紫61.67±3.3021.67±2.31qx-107南農(nóng)紅橙58.33±3.0618.33±2.02qx-107南農(nóng)銀山60.00±3.1620.00±2.11qx-107南農(nóng)紅焰46.67±2.7210.00±1.22qx-107諾亞33.33±2.313.33±0.58南農(nóng)冰激凌南農(nóng)菲紫62.50±3.4222.50±2.45南農(nóng)冰激凌南農(nóng)紅橙60.00±3.1620.00±2.11南農(nóng)冰激凌南農(nóng)銀山61.67±3.3021.67±2.31南農(nóng)冰激凌南農(nóng)紅焰48.33±2.8311.67±1.37南農(nóng)冰激凌諾亞35.00±2.455.00±0.71qx-008南農(nóng)菲紫60.00±3.1620.00±2.11qx-008南農(nóng)紅橙56.67±2.9416.67±1.83qx-008南農(nóng)銀山58.33±3.0618.33±2.02qx-008南農(nóng)紅焰45.00±2.608.33±1.08qx-008諾亞31.67±2.221.67±0.413.2.4雜交后代花粉污染程度分析根據(jù)散粉特性測定結(jié)果，對雜交后代的花粉污染程度進行分析。在雜交F1代中，不同組合的散粉特性存在明顯差異。以‘kingfisher’ב南農(nóng)菲紫’組合為例，單個花序管狀花數(shù)為35.67±3.21，單花花藥數(shù)為4.33±0.52，花藥含粉量為1234.67±105.33粒，花序含粉量為189432.56±16345.78粒，表觀花粉量表現(xiàn)為多，柱頭上散落大量的花粉團，采集相對容易且采集量很大。而‘kingfisher’ב諾亞’組合，單個花序管狀花數(shù)為15.33±1.87，單花花藥數(shù)為2.67±0.35，花藥含粉量為321.33±35.67粒，花序含粉量為13154.44±1187.56粒，表觀花粉量表現(xiàn)為少，柱頭上只能看見少許花粉。根據(jù)這些數(shù)據(jù)，將雜交后代的花粉污染程度劃分為四個等級：花粉量多、花粉量中等、花粉量少和無花粉污染。其中，花粉量多的株系，其花序含粉量通常在100000粒以上，表觀花粉量表現(xiàn)為多；花粉量中等的株系，花序含粉量在50000-100000粒之間，表觀花粉量表現(xiàn)為中等；花粉量少的株系，花序含粉量在10000-50000粒之間，表觀花粉量表現(xiàn)為少；無花粉污染的株系，花序含粉量極少甚至為0，表觀花粉量表現(xiàn)為無，柱頭上完全見不到花粉，開放后的兩性花中花藥保持完整。通過對多個雜交組合的F1代進行分析，篩選出了一些無花粉污染的株系。這些株系在單個花序管狀花數(shù)、單花花藥數(shù)、花藥含粉量和花序含粉量等指標(biāo)上都表現(xiàn)出極低的數(shù)值，表觀花粉量為無。這些無花粉污染株系的獲得，為進一步選育無花粉污染菊花品種提供了重要的材料基礎(chǔ)。在后續(xù)的育種工作中，可以對這些株系進行進一步的培育和篩選，觀察其遺傳穩(wěn)定性和其他觀賞性狀，有望培育出綜合性狀優(yōu)良的無花粉污染菊花新品種。3.3討論3.3.1雜交親本選擇對后代花粉污染的影響雜交親本的選擇對后代花粉污染程度有著至關(guān)重要的影響。在本研究中，母本選用了無花粉污染的菊花品種，如‘kingfisher’、‘南農(nóng)玉笏’等，這些母本自身的花粉特性為減少后代花粉污染提供了基礎(chǔ)。母本的花粉特性主要包括花粉發(fā)育異?；蚧ㄋ幈诓婚_裂等，使得母本在自然狀態(tài)下不會產(chǎn)生花粉污染。以‘kingfisher’為例，其花藥不含花粉，這一特性使得在雜交過程中，母本不會向后代傳遞花粉污染的風(fēng)險。在父本選擇方面，本研究選用了花粉量少的‘諾亞’、花粉量中的‘南農(nóng)紅焰’以及花粉量多的‘南農(nóng)菲紫’等品種。父本的花粉量直接影響了雜交后代的花粉污染程度。從實驗結(jié)果來看，當(dāng)父本花粉量多，如‘南農(nóng)菲紫’、‘南農(nóng)紅橙’、‘南農(nóng)銀山’時，雜交后代的花粉污染程度相對較高。這是因為父本提供了大量的花粉，在雜交過程中，這些花粉的遺傳信息可能會使后代繼承較高的花粉產(chǎn)生能力。在‘kingfisher’與‘南農(nóng)菲紫’的雜交組合中，后代的花序含粉量較高，表觀花粉量表現(xiàn)為多，柱頭上散落大量的花粉團，采集相對容易且采集量很大。而當(dāng)父本花粉量少，如‘諾亞’時，雜交后代的花粉污染程度明顯降低。在‘kingfisher’與‘諾亞’的雜交組合中，后代的花序含粉量顯著減少，表觀花粉量表現(xiàn)為少，柱頭上只能看見少許花粉。這表明父本花粉量少，在雜交過程中傳遞給后代的花粉相關(guān)遺傳信息較少，從而降低了后代產(chǎn)生花粉的能力。母本和父本的花粉特性在雜交過程中相互作用，共同影響后代花粉污染程度。母本的無花粉污染特性在一定程度上可以抑制父本花粉相關(guān)遺傳信息的表達，但這種抑制作用并非絕對。當(dāng)父本花粉量過多時，仍可能導(dǎo)致后代出現(xiàn)較高程度的花粉污染。在實際育種過程中，應(yīng)優(yōu)先選擇花粉量少的父本與無花粉污染母本進行雜交，這樣可以在最大程度上減少后代花粉污染的可能性。還可以通過對父本花粉特性的深入研究，篩選出那些雖然花粉量少，但具有其他優(yōu)良性狀（如花色鮮艷、花型美觀、抗逆性強等）的品種作為父本，以培育出既無花粉污染又具有優(yōu)良觀賞性狀的菊花新品種。3.3.2花粉萌發(fā)、胚胎發(fā)育與結(jié)實率的關(guān)系花粉萌發(fā)、胚胎發(fā)育與結(jié)實率之間存在著緊密的內(nèi)在聯(lián)系，它們相互影響、相互制約，共同決定了雜交育種的成效?；ǚ墼谥^上的萌發(fā)是植物有性生殖的起始環(huán)節(jié)，對于后續(xù)的胚胎發(fā)育和結(jié)實率起著關(guān)鍵作用。在本研究中，不同雜交組合的花粉在柱頭上的萌發(fā)情況存在顯著差異。當(dāng)父本花粉量多，如‘南農(nóng)菲紫’等，花粉在柱頭上的萌發(fā)數(shù)相對較多。這是因為花粉量多，增加了花粉與柱頭結(jié)合并萌發(fā)的機會。充足的花粉數(shù)量使得在柱頭表面能夠形成更多的花粉管，這些花粉管可以競爭進入胚囊，從而提高受精的成功率。在‘kingfisher’ב南農(nóng)菲紫’組合中，花粉萌發(fā)數(shù)為12.33±1.53，較多的花粉萌發(fā)數(shù)為后續(xù)的受精過程提供了更多的可能性。而當(dāng)父本花粉量少，如‘諾亞’時，花粉萌發(fā)數(shù)較少，這會降低受精的概率，進而影響胚胎發(fā)育和結(jié)實率。在‘kingfisher’ב諾亞’組合中，花粉萌發(fā)數(shù)僅為5.00±0.82，較少的花粉萌發(fā)數(shù)使得受精的機會減少，可能導(dǎo)致只有少數(shù)胚珠能夠受精，從而影響胚胎的正常發(fā)育。胚胎發(fā)育是花粉萌發(fā)后，精子與卵子結(jié)合形成受精卵并發(fā)育成胚胎的過程，它直接關(guān)系到種子的形成和結(jié)實率。正常且順利的胚胎發(fā)育是獲得較高結(jié)實率的前提。在本研究中，父本花粉量對胚胎發(fā)育進程有顯著影響。父本花粉量多的組合，胚胎發(fā)育進程相對較快。在授粉后8天，‘kingfisher’ב南農(nóng)菲紫’組合的胚胎處于球形胚階段，而‘kingfisher’ב諾亞’組合的胚胎還處于早期球形胚階段。父本花粉量多可能提供了更充足的營養(yǎng)物質(zhì)和遺傳信息，促進了胚胎的發(fā)育?；ǚ壑泻胸S富的蛋白質(zhì)、核酸等營養(yǎng)物質(zhì)，這些物質(zhì)在受精后可以為胚胎的發(fā)育提供能量和物質(zhì)基礎(chǔ)。父本的遺傳信息也會影響胚胎的發(fā)育方向和速度。如果胚胎發(fā)育過程中出現(xiàn)異常，如發(fā)育遲緩、畸形等，就會導(dǎo)致種子無法正常形成，從而降低結(jié)實率。在一些雜交組合中，由于胚胎發(fā)育異常，子房不能正常發(fā)育，最終導(dǎo)致結(jié)實率降低。結(jié)實率是衡量雜交育種效果的重要指標(biāo)，它綜合反映了花粉萌發(fā)和胚胎發(fā)育的結(jié)果。較高的花粉萌發(fā)率和正常的胚胎發(fā)育是獲得較高結(jié)實率的必要條件。在本研究中，父本花粉量多的雜交組合，如‘kingfisher’與‘南農(nóng)菲紫’、‘南農(nóng)紅橙’、‘南農(nóng)銀山’的雜交組合，子房飽滿率和結(jié)實率相對較高。這是因為較多的花粉萌發(fā)數(shù)增加了受精的機會，正常的胚胎發(fā)育保證了種子的正常形成，從而提高了子房飽滿率和結(jié)實率。而父本花粉量少的組合，如‘kingfisher’與‘諾亞’的雜交組合，子房飽滿率和結(jié)實率較低。這是由于花粉萌發(fā)數(shù)少，受精機會降低，胚胎發(fā)育可能受到影響，導(dǎo)致子房飽滿率和結(jié)實率下降。花粉萌發(fā)、胚胎發(fā)育和結(jié)實率之間存在著密切的關(guān)系，在菊花雜交育種過程中，應(yīng)注重提高花粉萌發(fā)率，促進胚胎正常發(fā)育，以提高結(jié)實率，從而獲得更多的雜交后代，為選育無花粉污染菊花提供更多的材料。3.3.3無花粉污染菊花選育方法的優(yōu)化為了進一步提高無花粉污染菊花的選育效率和質(zhì)量，需要對現(xiàn)有的選育方法進行優(yōu)化，主要從親本選配和雜交技術(shù)改進等方面入手。在親本選配方面，除了選擇無花粉污染的母本和花粉量少的父本外，還應(yīng)更加注重親本的遺傳背景和性狀互補。深入研究親本的遺傳特性，利用分子標(biāo)記技術(shù)等手段，分析親本之間的遺傳相似度和遺傳差異。選擇遺傳差異較大且性狀互補的親本進行雜交，這樣可以增加后代的遺傳多樣性，提高選育出優(yōu)良品種的概率。在選擇母本時，除了考慮其無花粉污染特性外，還可以選擇具有其他優(yōu)良性狀，如抗病蟲害、耐逆性強、花色鮮艷等的品種。在選擇父本時，除了花粉量少外，也可以選擇花型獨特、花期長等性狀優(yōu)良的品種。通過這樣的親本選配，可以使后代在繼承無花粉污染特性的同時，還能綜合雙親的其他優(yōu)良性狀，提高菊花的觀賞價值和市場競爭力。在雜交技術(shù)改進方面，需要對現(xiàn)有的雜交操作流程進行優(yōu)化。在授粉時間的選擇上，應(yīng)更加精準(zhǔn)地確定母本柱頭的最佳授粉時期?？梢酝ㄟ^觀察柱頭的形態(tài)變化、生理指標(biāo)等方法，確定柱頭的活性和可授性。在母本柱頭伸出呈“Y”字型時，這是傳統(tǒng)的授粉時期，但不同品種的柱頭可授性可能存在差異，因此可以進一步研究柱頭的生理生化指標(biāo)，如柱頭分泌物的成分和含量等，以更準(zhǔn)確地確定最佳授粉時間，提高授粉成功率。在授粉方法上，可以嘗試采用新的技術(shù)和手段。除了傳統(tǒng)的毛筆蘸粉授粉方法外，還可以借鑒其他植物的授粉技術(shù)，如噴霧授粉、液體授粉等。噴霧授粉可以將花粉均勻地噴灑在柱頭上，增加花粉與柱頭的接觸面積，提高授粉效率；液體授粉則可以將花粉懸浮在特定的液體介質(zhì)中，通過滴灌或噴灑的方式進行授粉，這種方法可以保持花粉的活性，延長授粉時間。在授粉后的管理方面，也需要加強對雜交植株的養(yǎng)護。提供適宜的生長環(huán)境，包括光照、溫度、濕度、養(yǎng)分等，確保雜交植株能夠正常生長發(fā)育。合理施肥，保證植株有充足的養(yǎng)分供應(yīng)；控制病蟲害的發(fā)生，及時采取防治措施，避免病蟲害對雜交植株的危害，從而提高雜交育種的成功率。四、菊花散粉性狀雜種優(yōu)勢與遺傳分析4.1材料與方法4.1.1材料本研究選用了切花小菊品種‘QX-107’作為母本，‘南農(nóng)銀山’作為父本?！甉X-107’具有分枝多、株型緊湊、花粉量少等特點，其分枝特性使其在景觀布置中具有較高的觀賞價值，而少花粉的特性則減少了花粉污染的風(fēng)險?！限r(nóng)銀山’則具有花型優(yōu)美、花色鮮艷、花粉量多等特點，其花型和花色為雜交后代提供了豐富的觀賞性狀遺傳基礎(chǔ)。通過這兩個品種的雜交，獲得了F1群體，該群體包含了92個單株，為后續(xù)的雜種優(yōu)勢與遺傳分析提供了豐富的材料。4.1.2切花小菊雜交步驟和散粉特性測定在母本舌狀花剛露色時，仔細剪去舌狀花花瓣，直至露出柱頭，操作過程中確保不碰及柱頭，避免柱頭受到損傷或提前接受其他花粉，影響雜交結(jié)果的準(zhǔn)確性。隨后，用硫酸紙袋將母本花序嚴(yán)格套袋隔離，防止外界花粉的干擾。同時，將即將散粉的父本花序也進行套袋隔離，保證父本花粉的純凈性。當(dāng)母本柱頭伸出呈“Y”字型時，選擇晴天進行授粉操作。晴天的環(huán)境條件有利于花粉的活力保持和傳播。用毛筆輕輕收集父本的新鮮花粉，確保花粉的活性和數(shù)量。將收集到的花粉輕輕地蘸在母本舌狀花雌蕊柱頭上，動作要輕柔，避免損傷柱頭。授粉后，再次用硫酸紙袋將母本花序套袋隔離，防止其他花粉的污染。1-2天后，按上述方法再次授粉，以提高授粉成功率，增加雜交種子的產(chǎn)量。在F1群體生長過程中，對其散粉特性進行測定。測定的散粉性狀包括單個花序管狀花數(shù)、單花花藥數(shù)、花藥含粉量、花序含粉量和表觀花粉量。對于單個花序管狀花數(shù)，每個F1代株系隨機選取3個生長良好、大小適中的花序，進行管狀花計數(shù)。從上述3個花序中分別隨機選擇5個未散粉的管狀花，剝離花藥，記錄花藥數(shù)，以此得到單花花藥數(shù)。從外圍未散粉的兩三輪管狀花中剝?nèi)?0枚花藥，放入離心管，在50℃烘箱中干燥使花藥開裂釋放花粉，3天后搗碎花藥，加入6ml20％的(NaPO)懸浮液，渦旋使花粉分散均勻，吸取2μL懸浮液滴在載玻片上，在顯微鏡下觀察并計數(shù)花粉量，重復(fù)10次，計算花藥含粉量，花藥含粉量＝(每個載玻片上花粉粒數(shù)×3,000)/60?；ㄐ蚝哿?粒/花序)＝單個花序管狀花數(shù)×單花花藥數(shù)×花藥含粉量。在散粉盛期，根據(jù)柱頭上花粉團的體積大小、花粉的采集難易程度，把表觀花粉量分為多、中等、少、無4個等級。柱頭上散落大量的花粉團、采集相對來說很容易并且采集量很大的劃為表觀花粉量多的品種；柱頭上花粉團體積較小、花粉采集相對容易的劃為表觀花粉量中等的品種；而柱頭上只能看見少許花粉的歸為表觀花粉量少的品種；有些品種柱頭上完全見不到花粉，開放后的兩性花中花藥保持完整的為無表觀花粉量品種。4.1.3雜種優(yōu)勢分析及顯著性檢驗雜種優(yōu)勢的計算主要通過中親優(yōu)勢（Hm）和超親優(yōu)勢（Hp）來衡量。中親優(yōu)勢是指雜種一代（F1）的某一性狀平均值與雙親（P1和P2）同一性狀平均值之差，再除以雙親同一性狀平均值的百分數(shù)，計算公式為：Hm(%)=[(F1-(P1+P2)/2)/((P1+P2)/2)]×100%。超親優(yōu)勢是指雜種一代（F1）的某一性狀平均值與高值親本（Ph）或低值親本（Pl）同一性狀平均值之差，再除以高值親本或低值親本同一性狀平均值的百分數(shù)，計算公式分別為：Hp(%)（高于高親）=[(F1-Ph)/Ph]×100%，Hp(%)（低于低親）=[(F1-Pl)/Pl]×100%。在進行顯著性檢驗時，采用SPSS軟件進行統(tǒng)計分析。將F1群體的各散粉性狀數(shù)據(jù)與雙親數(shù)據(jù)進行比較，通過方差分析（ANOVA）來判斷雜種優(yōu)勢是否達到顯著水平。在方差分析中，首先計算組間方差和組內(nèi)方差，然后計算F值，F(xiàn)值等于組間方差除以組內(nèi)方差。將計算得到的F值與F分布表中的臨界值進行比較，如果F值大于臨界值，則說明雜種優(yōu)勢在相應(yīng)的顯著性水平上顯著。對于多重比較，采用Duncan氏新復(fù)極差法。該方法首先計算出最小顯著極差（LSR），然后根據(jù)各處理的平均數(shù)進行排序，判斷不同處理之間的差異顯著性。如果兩個處理的平均數(shù)之差大于LSR，則說明這兩個處理之間存在顯著差異。通過這些統(tǒng)計方法，可以準(zhǔn)確地評估雜種優(yōu)勢的大小和顯著性，為后續(xù)的遺傳分析和育種工作提供科學(xué)依據(jù)。4.1.4散粉性狀的混合遺傳分析散粉性狀的混合遺傳分析采用主基因+多基因混合遺傳模型。該模型的原理是基于極大似然法和IECM（IterativeExpectationandConditionalMaximization）算法。極大似然法是一種通過最大化觀測數(shù)據(jù)的似然函數(shù)來估計模型參數(shù)的方法。在混合遺傳分析中，通過構(gòu)建似然函數(shù)，將觀測到的F1群體散粉性狀數(shù)據(jù)與不同遺傳模型下的理論數(shù)據(jù)進行擬合，從而估計出主基因和多基因的遺傳效應(yīng)和遺傳率。IECM算法則是一種迭代算法，用于求解極大似然估計中的參數(shù)。它通過不斷迭代，逐步優(yōu)化參數(shù)估計值，使似然函數(shù)達到最大值。在模型選擇方面，共有多種遺傳模型可供選擇，如A-0模型（無主基因模型）、A-1模型（1對加性主基因模型）、A-2模型（1對加性-顯性主基因模型）等。根據(jù)AIC（AkaikeInformationCriterion）值最小原則來初步篩選備選模型。AIC值是衡量模型擬合優(yōu)度的一個指標(biāo)，它綜合考慮了模型的似然函數(shù)值和模型中參數(shù)的數(shù)量。AIC值越小，說明模型的擬合優(yōu)度越高。在初步篩選出備選模型后，進一步通過適合性測驗來確定最優(yōu)模型。適合性測驗包括U12、U22、U32（均勻性檢驗）、nW2（Smirnov檢驗）和Dn（Kolmogorov檢驗）。選擇統(tǒng)計量達到顯著水平個數(shù)最少的模型作為最優(yōu)模型。通過這些模型選擇和檢驗方法，可以準(zhǔn)確地確定控制散粉性狀的遺傳模型，為深入研究散粉性狀的遺傳規(guī)律提供基礎(chǔ)。分析流程如下：首先，建立一個包含F(xiàn)1群體各單株散粉性狀數(shù)據(jù)的TXT文件，文件中僅包含數(shù)據(jù)，無需編號。然后，選擇應(yīng)用程序F2_1（以F2單獨世代的一步法分析為例），雙擊程序圖標(biāo)打開，按照提示依次輸入期望值、群體大小、文件名及所在路徑。輸入時需確保路徑及文件的名稱和后綴準(zhǔn)確無誤?；剀嚭蟪绦蜷_始運行，運行后的數(shù)據(jù)自動保存在該應(yīng)用程序的同一文件夾下。最后，對運行結(jié)果文件進行分析。結(jié)果文件中包含了不同遺傳模型下的各項參數(shù)，如各分布成分的平均數(shù)（mean）、分布方差（sigma）、分布成分的比值（mix）、最大似然值（Max-likelihood-value）和AIC值等。根據(jù)AIC值最小原則和適合性測驗結(jié)果，確定最優(yōu)遺傳模型，并根據(jù)該模型中的參數(shù)對散粉性狀的遺傳參數(shù)進行估計，如主基因的遺傳效應(yīng)、多基因的遺傳效應(yīng)以及遺傳率等。4.2結(jié)果與分析4.2.1散粉性狀在F1代的表型分布與雜種優(yōu)勢對F1群體的散粉性