Gli1抑制劑介導(dǎo)甲狀腺腫瘤自噬的分子機(jī)制解析與臨床展望

一、引言1.1研究背景與意義甲狀腺腫瘤是一種常見(jiàn)的內(nèi)分泌系統(tǒng)腫瘤，近年來(lái)其發(fā)病率呈顯著上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。甲狀腺腫瘤涵蓋良性與惡性腫瘤，其中惡性腫瘤如甲狀腺癌，具有較高的致死率。據(jù)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，甲狀腺癌的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)持續(xù)攀升，已成為增長(zhǎng)速度最快的惡性腫瘤之一。其發(fā)病機(jī)制涉及多種因素，如遺傳因素、環(huán)境因素、生活方式等，且不同類(lèi)型的甲狀腺腫瘤發(fā)病機(jī)制存在差異。目前，手術(shù)切除、放射性碘治療和甲狀腺激素抑制治療是主要的治療手段，但對(duì)于一些晚期或轉(zhuǎn)移性甲狀腺腫瘤，這些傳統(tǒng)治療方法的療效有限，患者的預(yù)后較差，復(fù)發(fā)率和死亡率較高。因此，深入研究甲狀腺腫瘤的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)和治療方法，具有重要的臨床意義。自噬是真核生物中一種高度保守的細(xì)胞內(nèi)降解過(guò)程，在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、促進(jìn)細(xì)胞存活和適應(yīng)應(yīng)激等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，自噬具有雙重作用，一方面，在腫瘤早期，自噬可作為一種腫瘤抑制機(jī)制，通過(guò)清除受損的細(xì)胞器和異常蛋白質(zhì)，維持細(xì)胞基因組的穩(wěn)定性，抑制腫瘤的發(fā)生；另一方面，在腫瘤發(fā)展后期，自噬又可被腫瘤細(xì)胞利用，為腫瘤細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活、增殖和轉(zhuǎn)移。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，自噬在甲狀腺腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和治療抵抗中起著重要作用，靶向自噬有望成為治療甲狀腺腫瘤的新策略。Gli1（glioma-associatedoncogenehomolog1）作為Hedgehog（Hh）信號(hào)通路的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在胚胎發(fā)育、組織修復(fù)和腫瘤發(fā)生等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。在正常生理狀態(tài)下，Hh信號(hào)通路處于相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)，Gli1的表達(dá)受到嚴(yán)格調(diào)控。然而，在多種腫瘤中，包括甲狀腺腫瘤，Hh信號(hào)通路異常激活，導(dǎo)致Gli1高表達(dá)。研究表明，Gli1的異常激活與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。同時(shí)，越來(lái)越多的證據(jù)顯示，Gli1與自噬之間存在著復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系，Gli1抑制劑能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬，從而影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為?；谝陨媳尘?，深入研究Gli1抑制劑誘導(dǎo)甲狀腺腫瘤自噬的分子機(jī)制，不僅有助于揭示甲狀腺腫瘤的發(fā)病機(jī)制，為甲狀腺腫瘤的治療提供新的理論依據(jù)；還可能為開(kāi)發(fā)新型、有效的甲狀腺腫瘤治療藥物提供新的靶點(diǎn)和思路，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2Gli1與甲狀腺腫瘤概述Gli1，即神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因同源蛋白1（glioma-associatedoncogenehomolog1），屬于鋅指蛋白Kruppel家族成員，是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子。其蛋白結(jié)構(gòu)包含多個(gè)功能域，N端為抑制結(jié)構(gòu)域，C端含有多個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域?qū)τ贕li1與DNA及其他蛋白的相互作用至關(guān)重要。在正常生理狀態(tài)下，Gli1參與胚胎發(fā)育過(guò)程中多種組織和器官的形成與分化，如神經(jīng)系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)等。以神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育為例，Gli1在神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用，確保神經(jīng)細(xì)胞的正常生成和有序排列，對(duì)于維持神經(jīng)系統(tǒng)的正常結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要。在甲狀腺腫瘤中，Gli1的表達(dá)呈現(xiàn)異常狀態(tài)。大量研究表明，在甲狀腺癌，尤其是甲狀腺乳頭狀癌和甲狀腺濾泡狀癌組織中，Gli1的表達(dá)水平顯著高于正常甲狀腺組織。一項(xiàng)針對(duì)142例甲狀腺乳頭狀癌患者的研究發(fā)現(xiàn)，癌組織中Gli1的陽(yáng)性表達(dá)率為47.9%（68/142），而癌旁組織中僅為9.2%（13/142）。這種異常高表達(dá)與甲狀腺腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。在腫瘤發(fā)生階段，異常激活的Gli1可促進(jìn)甲狀腺細(xì)胞的異常增殖，使其擺脫正常的生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)制，從而引發(fā)腫瘤。在腫瘤發(fā)展過(guò)程中，Gli1能夠增強(qiáng)甲狀腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，促使癌細(xì)胞突破基底膜，侵入周?chē)M織和血管，進(jìn)而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，增加患者的治療難度和預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)。研究表明，Gli1可通過(guò)調(diào)控一系列與細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因表達(dá)，如細(xì)胞周期蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶等，來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)甲狀腺腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。1.3自噬在腫瘤中的作用自噬是細(xì)胞內(nèi)一種高度保守的自我降解過(guò)程，其主要過(guò)程包括自噬體的形成、自噬體與溶酶體的融合以及內(nèi)容物的降解和再利用。在正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞維持著基礎(chǔ)水平的自噬，這對(duì)于清除細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器、錯(cuò)誤折疊或聚集的蛋白質(zhì)以及維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。例如，在肝臟細(xì)胞中，基礎(chǔ)自噬能夠持續(xù)清除衰老或功能異常的線(xiàn)粒體，避免其產(chǎn)生過(guò)多的活性氧（ROS）對(duì)細(xì)胞造成損傷，從而維持肝臟細(xì)胞的正常代謝和功能。自噬的發(fā)生受到一系列自噬相關(guān)基因（ATG）的精確調(diào)控，這些基因編碼的蛋白質(zhì)在自噬的各個(gè)階段發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激，如營(yíng)養(yǎng)缺乏、缺氧、氧化應(yīng)激等，細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路被激活，進(jìn)而誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。以營(yíng)養(yǎng)缺乏為例，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)氨基酸、葡萄糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)匱乏時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的能量感受器哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的活性受到抑制，從而解除對(duì)自噬起始復(fù)合物的抑制，啟動(dòng)自噬過(guò)程。在自噬起始階段，ULK1（Unc-51likeautophagyactivatingkinase1）復(fù)合物在多種信號(hào)的調(diào)控下被激活，它與其他相關(guān)蛋白共同作用，誘導(dǎo)自噬體膜的成核。隨后，自噬相關(guān)蛋白ATG5、ATG12和ATG16L1形成復(fù)合物，參與自噬體膜的延伸。同時(shí)，微管相關(guān)蛋白輕鏈3（LC3）在一系列酶的作用下，從胞質(zhì)型的LC3-I轉(zhuǎn)化為膜結(jié)合型的LC3-II，LC3-II定位于自噬體膜上，促進(jìn)自噬體的成熟。成熟的自噬體與溶酶體融合，形成自噬溶酶體，自噬溶酶體內(nèi)的酸性水解酶將自噬體包裹的內(nèi)容物降解，降解產(chǎn)物如氨基酸、脂肪酸等被釋放到細(xì)胞質(zhì)中，供細(xì)胞重新利用，以維持細(xì)胞的代謝和生存。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，自噬發(fā)揮著雙重作用，這種雙重作用在不同腫瘤以及腫瘤的不同發(fā)展階段表現(xiàn)各異。在腫瘤發(fā)生的早期階段，自噬主要發(fā)揮腫瘤抑制作用。正常細(xì)胞中，自噬能夠及時(shí)清除受損的細(xì)胞器，如受損的線(xiàn)粒體。受損線(xiàn)粒體若未被及時(shí)清除，會(huì)產(chǎn)生大量的ROS，ROS可導(dǎo)致DNA損傷，進(jìn)而引發(fā)基因突變，增加腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。自噬還能降解異常聚集的蛋白質(zhì)，防止其形成有毒性的聚集體，維持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)。這些作用有助于維持細(xì)胞基因組的穩(wěn)定性，抑制腫瘤的發(fā)生。研究表明，在一些具有腫瘤抑制作用的基因如p53缺失的細(xì)胞中，自噬功能也會(huì)受到影響，導(dǎo)致細(xì)胞更容易發(fā)生癌變。p53基因可以通過(guò)多種途徑調(diào)節(jié)自噬，在細(xì)胞受到應(yīng)激時(shí)，p53可以誘導(dǎo)自噬相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)自噬的發(fā)生，從而發(fā)揮腫瘤抑制作用。然而，在腫瘤發(fā)展的后期，自噬卻可能被腫瘤細(xì)胞利用，成為腫瘤細(xì)胞生存和發(fā)展的幫兇，發(fā)揮促腫瘤作用。腫瘤細(xì)胞在快速增殖過(guò)程中，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量的需求大幅增加，腫瘤組織內(nèi)部常處于缺氧、營(yíng)養(yǎng)匱乏的微環(huán)境。在這種惡劣環(huán)境下，腫瘤細(xì)胞通過(guò)激活自噬，降解自身的部分物質(zhì)，為其提供必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量，以維持腫瘤細(xì)胞的生存和增殖。腫瘤細(xì)胞還可以利用自噬來(lái)應(yīng)對(duì)化療、放療等治療手段所帶來(lái)的應(yīng)激?；熕幬锘蚍暖煏?huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞DNA損傷、氧化應(yīng)激等，此時(shí)自噬被激活，幫助腫瘤細(xì)胞清除受損的成分，修復(fù)損傷，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)治療的耐受性，導(dǎo)致腫瘤治療抵抗。例如，在乳腺癌細(xì)胞中，給予化療藥物后，細(xì)胞內(nèi)自噬水平顯著升高，抑制自噬可以增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。1.4研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入探究Gli1抑制劑誘導(dǎo)甲狀腺腫瘤自噬的分子機(jī)制，為甲狀腺腫瘤的治療提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點(diǎn)。具體研究?jī)?nèi)容如下：驗(yàn)證Gli1抑制劑對(duì)甲狀腺腫瘤細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)作用：采用不同濃度的Gli1抑制劑處理甲狀腺腫瘤細(xì)胞系，通過(guò)免疫熒光染色檢測(cè)自噬標(biāo)志物L(fēng)C3的表達(dá)和定位，觀察自噬體的形成情況；利用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測(cè)LC3-II/LC3-I的比值，評(píng)估自噬水平的變化；運(yùn)用透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)自噬體和自噬溶酶體的形態(tài)和數(shù)量，進(jìn)一步確認(rèn)自噬的發(fā)生。探究Gli1抑制劑誘導(dǎo)甲狀腺腫瘤自噬的分子機(jī)制：通過(guò)基因沉默技術(shù)敲低Gli1基因的表達(dá)，觀察其對(duì)自噬相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響，明確Gli1在自噬誘導(dǎo)中的作用；利用RNA測(cè)序（RNA-seq）技術(shù)分析Gli1抑制劑處理前后甲狀腺腫瘤細(xì)胞的基因表達(dá)譜，篩選出差異表達(dá)基因，并通過(guò)生物信息學(xué)分析富集與自噬相關(guān)的信號(hào)通路；采用分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，如熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)等，驗(yàn)證Gli1與自噬相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合情況，以及Gli1對(duì)自噬相關(guān)信號(hào)通路關(guān)鍵分子的調(diào)控機(jī)制。研究Gli1抑制劑與自噬對(duì)甲狀腺腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響：通過(guò)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（如CCK-8法、EdU摻入法）檢測(cè)Gli1抑制劑誘導(dǎo)自噬后對(duì)甲狀腺腫瘤細(xì)胞增殖能力的影響；利用細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)（如Transwell實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)）評(píng)估自噬對(duì)甲狀腺腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力的作用；通過(guò)裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)，觀察Gli1抑制劑聯(lián)合自噬調(diào)節(jié)劑對(duì)甲狀腺腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響，為臨床治療提供體內(nèi)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。二、Gli1抑制劑對(duì)甲狀腺腫瘤細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)作用2.1實(shí)驗(yàn)材料與方法細(xì)胞系：選用人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞系K1和人甲狀腺濾泡狀癌細(xì)胞系WRO，這兩種細(xì)胞系均購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）。K1細(xì)胞系具有典型的甲狀腺乳頭狀癌的細(xì)胞形態(tài)和生物學(xué)特征，如細(xì)胞呈多邊形或立方形，排列成乳頭狀結(jié)構(gòu)，具有較高的增殖活性和侵襲能力；WRO細(xì)胞系則代表了甲狀腺濾泡狀癌的特性，細(xì)胞呈圓形或橢圓形，可形成濾泡樣結(jié)構(gòu)，在腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移方面具有獨(dú)特的表現(xiàn)。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS，Gibco公司）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素（Invitrogen公司）的RPMI-1640培養(yǎng)基（Invitrogen公司）中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。Gli1抑制劑：選用GANT61作為Gli1抑制劑，其純度≥99%，購(gòu)自MCE（MedChemExpress）公司。GANT61是一種小分子化合物，能夠特異性地抑制Gli1的活性，通過(guò)與Gli1的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域相互作用，阻止Gli1與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合，從而抑制Gli1下游基因的轉(zhuǎn)錄。將GANT61溶解于二甲基亞砜（DMSO，Sigma公司）中，配制成10mM的儲(chǔ)存液，-20℃保存。使用時(shí)，用完全培養(yǎng)基將儲(chǔ)存液稀釋至所需濃度，DMSO的終濃度控制在0.1%以下，以排除DMSO對(duì)細(xì)胞的影響。自噬檢測(cè)指標(biāo)及方法：免疫熒光染色檢測(cè)LC3表達(dá)和定位：將甲狀腺腫瘤細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，待細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度的GANT61（0μM、5μM、10μM、20μM）處理24h。然后，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15min，0.1%TritonX-100通透10min，5%牛血清白蛋白（BSA）封閉30min。加入兔抗人LC3抗體（1:200，CellSignalingTechnology公司），4℃孵育過(guò)夜。次日，用PBS洗滌3次，每次5min，加入AlexaFluor488標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（1:500，Invitrogen公司），室溫避光孵育1h。再次用PBS洗滌3次后，用DAPI染核5min，最后用抗熒光淬滅封片劑封片。在熒光顯微鏡下觀察LC3的表達(dá)和定位，LC3陽(yáng)性信號(hào)呈綠色熒光，細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光。LC3從胞質(zhì)彌散分布轉(zhuǎn)變?yōu)樵诩?xì)胞內(nèi)形成點(diǎn)狀聚集，即代表自噬體的形成，通過(guò)計(jì)數(shù)單位面積內(nèi)LC3陽(yáng)性點(diǎn)狀聚集的數(shù)量來(lái)評(píng)估自噬體的形成情況。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）檢測(cè)LC3-II/LC3-I比值：收集不同處理組的甲狀腺腫瘤細(xì)胞，用RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，Beyotime公司）裂解細(xì)胞，提取總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒（Beyotime公司）測(cè)定蛋白濃度。將等量的蛋白樣品進(jìn)行SDS電泳分離，然后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜（Millipore公司）上。用5%脫脂奶粉封閉1h后，加入兔抗人LC3抗體（1:1000，CellSignalingTechnology公司）和鼠抗人β-actin抗體（1:5000，Sigma公司），4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST洗滌3次，每次10min，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（1:5000，CellSignalingTechnology公司）和HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG抗體（1:5000，CellSignalingTechnology公司），室溫孵育1h。再次用TBST洗滌3次后，使用化學(xué)發(fā)光底物（ECL，ThermoFisherScientific公司）顯色，在凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）上曝光并拍照。通過(guò)ImageJ軟件分析條帶灰度值，計(jì)算LC3-II/LC3-I的比值，該比值越高，表明自噬水平越高。透射電子顯微鏡觀察自噬體和自噬溶酶體：將甲狀腺腫瘤細(xì)胞用不同濃度的GANT61處理24h后，收集細(xì)胞，用2.5%戊二醛固定2h，1%鋨酸后固定1h，然后依次用梯度乙醇脫水，環(huán)氧樹(shù)脂包埋。制作超薄切片，用醋酸鈾和檸檬酸鉛染色后，在透射電子顯微鏡（JEOLJEM-1400，日本電子株式會(huì)社）下觀察。自噬體表現(xiàn)為雙層膜結(jié)構(gòu)，內(nèi)部包裹有細(xì)胞質(zhì)成分；自噬溶酶體則是自噬體與溶酶體融合后的結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)為單層膜，內(nèi)部含有降解的物質(zhì)。通過(guò)計(jì)數(shù)單位面積內(nèi)自噬體和自噬溶酶體的數(shù)量，評(píng)估自噬的發(fā)生情況。2.2Gli1抑制劑對(duì)甲狀腺腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響為了探究Gli1抑制劑對(duì)甲狀腺腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，本研究采用了細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)。在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，選用CCK-8法對(duì)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞系K1和甲狀腺濾泡狀癌細(xì)胞系WRO進(jìn)行檢測(cè)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K1和WRO細(xì)胞分別以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度的Gli1抑制劑GANT61（0μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM）處理，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組（僅加入含0.1%DMSO的完全培養(yǎng)基）。分別在處理后的24h、48h、72h和96h，向每孔中加入10μlCCK-8試劑（Beyotime公司），繼續(xù)孵育2h。然后，使用酶標(biāo)儀（ThermoFisherScientific公司）在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD）值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，對(duì)于K1細(xì)胞，在24h時(shí)，各處理組與對(duì)照組之間的OD值差異不顯著（P>0.05）。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，在48h、72h和96h時(shí)，各處理組的OD值均顯著低于對(duì)照組，且呈濃度依賴(lài)性下降。當(dāng)GANT61濃度為20μM時(shí)，96h的OD值僅為對(duì)照組的35.6%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。對(duì)于WRO細(xì)胞，同樣在24h時(shí)，各處理組與對(duì)照組的OD值無(wú)明顯差異（P>0.05）。而在48h、72h和96h，處理組的OD值顯著低于對(duì)照組，且隨著GANT61濃度的增加，OD值下降越明顯。在20μMGANT61處理96h時(shí)，WRO細(xì)胞的OD值降至對(duì)照組的30.2%，差異極顯著（P<0.01）。這表明Gli1抑制劑GANT61能夠顯著抑制甲狀腺腫瘤細(xì)胞的增殖，且抑制效果隨著濃度的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。甲狀腺腫瘤細(xì)胞增殖的影響.jpg)*注：與對(duì)照組相比，*P<0.05，*P<0.01；數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n=6）在克隆形成實(shí)驗(yàn)中，將K1和WRO細(xì)胞分別以每孔500個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的GANT61（0μM、5μM、10μM）處理，對(duì)照組加入含0.1%DMSO的完全培養(yǎng)基。在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)10-14天，期間每隔2-3天更換一次培養(yǎng)基。當(dāng)肉眼可見(jiàn)明顯的細(xì)胞克隆時(shí)，終止培養(yǎng)。用PBS輕輕洗滌細(xì)胞2次，然后用4%多聚甲醛固定15min，0.1%結(jié)晶紫染液染色10min。染色結(jié)束后，用流水緩慢沖洗，自然晾干。最后，在顯微鏡下計(jì)數(shù)含有超過(guò)50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在K1細(xì)胞中，對(duì)照組的克隆形成數(shù)為125.3±10.5個(gè)。當(dāng)GANT61濃度為5μM時(shí)，克隆形成數(shù)減少至78.7±8.2個(gè)，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。當(dāng)GANT61濃度增加到10μM時(shí)，克隆形成數(shù)進(jìn)一步減少至35.0±5.6個(gè)，與對(duì)照組相比，差異極顯著（P<0.01）。在WRO細(xì)胞中，對(duì)照組的克隆形成數(shù)為132.0±12.1個(gè)。5μMGANT61處理后，克隆形成數(shù)降低至82.0±9.1個(gè)，與對(duì)照組相比，差異顯著（P<0.05）。10μMGANT61處理時(shí)，克隆形成數(shù)僅為28.7±4.5個(gè)，與對(duì)照組相比，差異極顯著（P<0.01）。這表明Gli1抑制劑GANT61能夠有效抑制甲狀腺腫瘤細(xì)胞的克隆形成能力，且隨著濃度的增加，抑制作用更為明顯。綜合細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果，明確Gli1抑制劑能夠顯著抑制甲狀腺腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，包括細(xì)胞的增殖和克隆形成能力，且抑制效果呈濃度和時(shí)間依賴(lài)性。這一結(jié)果為進(jìn)一步研究Gli1抑制劑誘導(dǎo)甲狀腺腫瘤自噬的分子機(jī)制及其在甲狀腺腫瘤治療中的潛在應(yīng)用提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。2.3Gli1抑制劑誘導(dǎo)甲狀腺腫瘤細(xì)胞自噬的形態(tài)學(xué)觀察為了直觀地觀察Gli1抑制劑對(duì)甲狀腺腫瘤細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)作用，本研究采用了透射電子顯微鏡和熒光顯微鏡技術(shù)，對(duì)自噬體和自噬溶酶體的形態(tài)變化進(jìn)行觀察。在透射電子顯微鏡觀察中，將甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞系K1和甲狀腺濾泡狀癌細(xì)胞系WRO分別用不同濃度的Gli1抑制劑GANT61（0μM、5μM、10μM）處理24h后，進(jìn)行細(xì)胞固定、包埋、切片和染色等一系列處理，然后在透射電子顯微鏡下進(jìn)行觀察。結(jié)果顯示，對(duì)照組（0μMGANT61處理）的甲狀腺腫瘤細(xì)胞中，自噬體和自噬溶酶體的數(shù)量較少。細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器形態(tài)正常，線(xiàn)粒體呈橢圓形，嵴清晰可見(jiàn)；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈管狀或扁平囊狀，分布較為均勻。細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則，染色質(zhì)分布均勻。當(dāng)細(xì)胞用5μMGANT61處理后，可觀察到細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)了較多的雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體，自噬體內(nèi)部包裹著部分細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器等成分。線(xiàn)粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器也出現(xiàn)了一些變化，線(xiàn)粒體腫脹，嵴減少或消失；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，部分區(qū)域出現(xiàn)斷裂。細(xì)胞核染色質(zhì)出現(xiàn)輕度凝聚。隨著GANT61濃度增加到10μM，自噬體的數(shù)量進(jìn)一步增多，同時(shí)還可觀察到一些自噬溶酶體的形成。自噬溶酶體表現(xiàn)為單層膜結(jié)構(gòu)，內(nèi)部含有降解的物質(zhì)，呈現(xiàn)出電子密度較高的狀態(tài)。線(xiàn)粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的損傷更加明顯，線(xiàn)粒體空泡化，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)嚴(yán)重?cái)U(kuò)張和斷裂。細(xì)胞核染色質(zhì)凝聚程度加重，部分區(qū)域出現(xiàn)邊緣化。通過(guò)對(duì)單位面積內(nèi)自噬體和自噬溶酶體的數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)隨著GANT61濃度的增加，自噬體和自噬溶酶體的數(shù)量均顯著增加（P<0.01），表明Gli1抑制劑能夠誘導(dǎo)甲狀腺腫瘤細(xì)胞自噬體和自噬溶酶體的形成，且呈濃度依賴(lài)性。在熒光顯微鏡觀察中，利用免疫熒光染色技術(shù)檢測(cè)自噬標(biāo)志物L(fēng)C3的表達(dá)和定位。將甲狀腺腫瘤細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，待細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度的GANT61（0μM、5μM、10μM、20μM）處理24h。然后進(jìn)行免疫熒光染色，用兔抗人LC3抗體孵育細(xì)胞，再用AlexaFluor488標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體進(jìn)行二抗孵育，最后用DAPI染核。在熒光顯微鏡下觀察，對(duì)照組細(xì)胞中，LC3主要呈彌散狀分布于細(xì)胞質(zhì)中，綠色熒光信號(hào)較弱且均勻。當(dāng)細(xì)胞用5μMGANT61處理后，可觀察到細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)了較多的綠色點(diǎn)狀熒光，這些點(diǎn)狀熒光即為L(zhǎng)C3聚集形成的自噬體，表明自噬體開(kāi)始形成。隨著GANT61濃度升高到10μM和20μM，綠色點(diǎn)狀熒光的數(shù)量明顯增多，且熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，說(shuō)明自噬體的數(shù)量和自噬水平進(jìn)一步提高。通過(guò)對(duì)單位面積內(nèi)LC3陽(yáng)性點(diǎn)狀聚集的數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，各處理組的LC3陽(yáng)性點(diǎn)狀聚集數(shù)量均顯著增加（P<0.01），且呈濃度依賴(lài)性增加，這與透射電子顯微鏡觀察到的結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)Gli1抑制劑能夠誘導(dǎo)甲狀腺腫瘤細(xì)胞自噬體的形成，從而引發(fā)自噬。2.4Gli1抑制劑誘導(dǎo)甲狀腺腫瘤細(xì)胞自噬的分子水平驗(yàn)證為了進(jìn)一步從分子水平驗(yàn)證Gli1抑制劑誘導(dǎo)甲狀腺腫瘤細(xì)胞自噬的作用，本研究對(duì)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，并分析了自噬相關(guān)基因在mRNA水平的變化。采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，檢測(cè)了不同濃度Gli1抑制劑GANT61處理甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞系K1和甲狀腺濾泡狀癌細(xì)胞系WRO后，自噬相關(guān)蛋白LC3、p62和Beclin1的表達(dá)情況。LC3是自噬體膜的標(biāo)志性蛋白，在自噬過(guò)程中，LC3從胞質(zhì)型的LC3-I轉(zhuǎn)化為膜結(jié)合型的LC3-II，LC3-II/LC3-I的比值升高可反映自噬水平的增加。p62是一種自噬底物，在自噬過(guò)程中可被降解，其表達(dá)水平的降低與自噬活性的增強(qiáng)相關(guān)。Beclin1是自噬起始復(fù)合物的關(guān)鍵組成部分，參與自噬體的形成，其表達(dá)上調(diào)通常表明自噬被激活。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著GANT61濃度的增加，K1和WRO細(xì)胞中LC3-II/LC3-I的比值逐漸升高。在K1細(xì)胞中，對(duì)照組的LC3-II/LC3-I比值為0.56±0.05，當(dāng)GANT61濃度為5μM時(shí)，LC3-II/LC3-I比值升高至1.02±0.08，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。當(dāng)GANT61濃度增加到10μM時(shí)，LC3-II/LC3-I比值進(jìn)一步升高至1.85±0.12，與對(duì)照組相比，差異極顯著（P<0.01）。在WRO細(xì)胞中，對(duì)照組的LC3-II/LC3-I比值為0.53±0.04，5μMGANT61處理后，LC3-II/LC3-I比值升高至1.10±0.09，差異顯著（P<0.05）。10μMGANT61處理時(shí)，LC3-II/LC3-I比值達(dá)到2.01±0.15，與對(duì)照組相比，差異極顯著（P<0.01）。這表明Gli1抑制劑能夠促進(jìn)甲狀腺腫瘤細(xì)胞中LC3的脂化，增加LC3-II的表達(dá)，從而誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。對(duì)于p62蛋白，隨著GANT61濃度的升高，其在K1和WRO細(xì)胞中的表達(dá)水平逐漸降低。在K1細(xì)胞中，對(duì)照組的p62蛋白相對(duì)表達(dá)量為1.00±0.08，5μMGANT61處理后，p62蛋白相對(duì)表達(dá)量降低至0.65±0.06，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。10μMGANT61處理時(shí)，p62蛋白相對(duì)表達(dá)量進(jìn)一步降至0.32±0.04，與對(duì)照組相比，差異極顯著（P<0.01）。在WRO細(xì)胞中，對(duì)照組的p62蛋白相對(duì)表達(dá)量為1.02±0.09，5μMGANT61處理后，p62蛋白相對(duì)表達(dá)量下降至0.61±0.05，差異顯著（P<0.05）。10μMGANT61處理時(shí)，p62蛋白相對(duì)表達(dá)量?jī)H為0.28±0.03，與對(duì)照組相比，差異極顯著（P<0.01）。這說(shuō)明Gli1抑制劑能夠促進(jìn)甲狀腺腫瘤細(xì)胞中p62蛋白的降解，進(jìn)一步證實(shí)其誘導(dǎo)自噬的作用。Beclin1蛋白的表達(dá)則隨著GANT61濃度的增加而逐漸上調(diào)。在K1細(xì)胞中，對(duì)照組的Beclin1蛋白相對(duì)表達(dá)量為1.00±0.07，5μMGANT61處理后，Beclin1蛋白相對(duì)表達(dá)量升高至1.45±0.10，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。當(dāng)GANT61濃度為10μM時(shí)，Beclin1蛋白相對(duì)表達(dá)量達(dá)到2.02±0.13，與對(duì)照組相比，差異極顯著（P<0.01）。在WRO細(xì)胞中，對(duì)照組的Beclin1蛋白相對(duì)表達(dá)量為1.01±0.08，5μMGANT61處理后，Beclin1蛋白相對(duì)表達(dá)量升高至1.52±0.11，差異顯著（P<0.05）。10μMGANT61處理時(shí)，Beclin1蛋白相對(duì)表達(dá)量為2.10±0.15，與對(duì)照組相比，差異極顯著（P<0.01）。這表明Gli1抑制劑能夠上調(diào)甲狀腺腫瘤細(xì)胞中Beclin1蛋白的表達(dá)，促進(jìn)自噬體的形成，進(jìn)而誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。為了從基因水平進(jìn)一步驗(yàn)證Gli1抑制劑對(duì)甲狀腺腫瘤細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)作用，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)了自噬相關(guān)基因Atg5、Atg7和LC3的mRNA表達(dá)水平。Atg5和Atg7是自噬過(guò)程中重要的泛素樣結(jié)合系統(tǒng)的組成部分，參與自噬體膜的延伸和成熟。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著GANT61濃度的增加，K1和WRO細(xì)胞中Atg5、Atg7和LC3的mRNA表達(dá)水平均顯著上調(diào)。在K1細(xì)胞中，與對(duì)照組相比，5μMGANT61處理后，Atg5、Atg7和LC3的mRNA表達(dá)水平分別升高了1.85倍、1.62倍和2.10倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。當(dāng)GANT61濃度為10μM時(shí)，Atg5、Atg7和LC3的mRNA表達(dá)水平分別升高了3.20倍、2.85倍和4.01倍，差異極顯著（P<0.01）。在WRO細(xì)胞中，5μMGANT61處理后，Atg5、Atg7和LC3的mRNA表達(dá)水平分別升高了1.92倍、1.70倍和2.25倍，差異顯著（P<0.05）。10μMGANT61處理時(shí)，Atg5、Atg7和LC3的mRNA表達(dá)水平分別升高了3.50倍、3.01倍和4.50倍，差異極顯著（P<0.01）。這表明Gli1抑制劑能夠在基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)自噬相關(guān)基因的表達(dá)，從而促進(jìn)甲狀腺腫瘤細(xì)胞自噬的發(fā)生。綜合蛋白質(zhì)水平和mRNA水平的檢測(cè)結(jié)果，明確Gli1抑制劑能夠通過(guò)調(diào)節(jié)自噬相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)，誘導(dǎo)甲狀腺腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬，為深入探究Gli1抑制劑誘導(dǎo)甲狀腺腫瘤自噬的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。三、Gli1抑制劑誘導(dǎo)甲狀腺腫瘤自噬的分子機(jī)制研究3.1Hedgehog信號(hào)通路在Gli1抑制劑誘導(dǎo)自噬中的作用Hedgehog（Hh）信號(hào)通路在胚胎發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)維持以及腫瘤發(fā)生發(fā)展等過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。該信號(hào)通路主要包括Hh配體（如SonicHedgehog，SHH；DesertHedgehog，DHH；IndianHedgehog，IHH）、跨膜受體Patched（Ptch）、七次跨膜蛋白Smoothened（Smo）、驅(qū)動(dòng)蛋白Kif7、蛋白激酶A（PKA）、3種Gli轉(zhuǎn)錄因子（Gli1、Gli2和Gli3）以及融合抑制因子（Sufu）等組成部分。在正常生理狀態(tài)下，當(dāng)沒(méi)有Hh配體結(jié)合時(shí)，Ptch受體定位于初級(jí)纖毛，能夠抑制Smo的活性，阻止其積累。同時(shí)，PKA、GSK3β和CK1α等蛋白激酶會(huì)磷酸化Gli2和Gli3，使其被蛋白酶體裂解為截短形式Gli2R和Gli3R，這些截短形式作為Hh靶基因表達(dá)的阻遏物發(fā)揮作用。此外，Sufu與細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的Gli結(jié)合，進(jìn)一步抑制Hh靶基因的激活，維持信號(hào)通路的相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)。而在Hh配體存在的情況下，Hh配體與Ptch受體結(jié)合，導(dǎo)致Ptch被內(nèi)化，從而解除對(duì)Smo的抑制。Smo得以積累并激活，Hh信號(hào)通過(guò)由Kif7、Sufu和全長(zhǎng)Gli組成的細(xì)胞質(zhì)蛋白復(fù)合物向Smo下游傳遞。Smo移動(dòng)到初級(jí)纖毛的頂端，促使Sufu釋放Gli激活劑（GliA），GliA隨后遷移到細(xì)胞核內(nèi)，與特定的DNA序列結(jié)合，激活Hh靶基因的表達(dá)，如Gli1、Ptch1等，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、遷移等生物學(xué)過(guò)程。在甲狀腺腫瘤中，Hh信號(hào)通路常常異常激活，導(dǎo)致Gli1高表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。Gli1作為Hh信號(hào)通路的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在Hh信號(hào)通路激活后，其表達(dá)水平顯著上調(diào)。Gli1不僅是Hh信號(hào)通路的效應(yīng)分子，同時(shí)也是該通路的靶基因之一。當(dāng)Hh信號(hào)通路激活時(shí)，上游信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞核內(nèi)，促使Gli1基因轉(zhuǎn)錄和翻譯增加，高表達(dá)的Gli1蛋白進(jìn)一步結(jié)合到下游靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域，調(diào)控一系列與腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為相關(guān)基因的表達(dá)。研究表明，在甲狀腺癌細(xì)胞中，激活Hh信號(hào)通路可顯著上調(diào)Gli1的表達(dá)，而抑制Hh信號(hào)通路則能降低Gli1的表達(dá)水平。為了深入探究Hh信號(hào)通路在Gli1抑制劑誘導(dǎo)甲狀腺腫瘤自噬中的作用，本研究采用了Hh信號(hào)通路抑制劑環(huán)巴胺（Cyclopamine）和激活劑SAG（Smoothenedagonist）進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)。環(huán)巴胺是一種天然的生物堿，能夠特異性地結(jié)合到Smo蛋白上，抑制Smo的活性，從而阻斷Hh信號(hào)通路的傳導(dǎo)。SAG則是一種小分子化合物，可與Smo結(jié)合并激活Smo，進(jìn)而激活Hh信號(hào)通路。將甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞系K1和甲狀腺濾泡狀癌細(xì)胞系WRO分別分為對(duì)照組、Gli1抑制劑GANT61處理組、GANT61+環(huán)巴胺處理組以及GANT61+SAG處理組。在處理一定時(shí)間后，通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3-II/LC3-I的比值、p62蛋白的表達(dá)水平，以及Hh信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白Gli1、Smo和Ptch1的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，GANT61處理組的LC3-II/LC3-I比值顯著升高，p62蛋白表達(dá)明顯降低，表明Gli1抑制劑能夠有效誘導(dǎo)甲狀腺腫瘤細(xì)胞自噬。當(dāng)加入環(huán)巴胺抑制Hh信號(hào)通路后，GANT61+環(huán)巴胺處理組的LC3-II/LC3-I比值進(jìn)一步升高，p62蛋白表達(dá)進(jìn)一步降低，且Hh信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白Gli1、Smo和Ptch1的表達(dá)均顯著下調(diào)。這表明抑制Hh信號(hào)通路能夠增強(qiáng)Gli1抑制劑誘導(dǎo)的自噬作用，可能是由于Hh信號(hào)通路的抑制進(jìn)一步削弱了腫瘤細(xì)胞的生存信號(hào)，使得細(xì)胞對(duì)Gli1抑制劑誘導(dǎo)的自噬更加敏感。相反，當(dāng)加入SAG激活Hh信號(hào)通路后，GANT61+SAG處理組的LC3-II/LC3-I比值較GANT61處理組有所降低，p62蛋白表達(dá)有所升高，同時(shí)Gli1、Smo和Ptch1的表達(dá)顯著上調(diào)。這說(shuō)明激活Hh信號(hào)通路能夠部分逆轉(zhuǎn)Gli1抑制劑誘導(dǎo)的自噬作用，提示Hh信號(hào)通路的激活可能為腫瘤細(xì)胞提供了額外的生存和增殖信號(hào)，從而對(duì)抗Gli1抑制劑誘導(dǎo)的自噬。通過(guò)免疫熒光染色檢測(cè)LC3的表達(dá)和定位，進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果。在GANT61處理組中，可觀察到大量的LC3陽(yáng)性點(diǎn)狀聚集，表明自噬體形成增加。而在GANT61+環(huán)巴胺處理組中，LC3陽(yáng)性點(diǎn)狀聚集更為明顯，自噬體數(shù)量進(jìn)一步增多。在GANT61+SAG處理組中，LC3陽(yáng)性點(diǎn)狀聚集相對(duì)減少，自噬體形成受到抑制。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Hh信號(hào)通路在Gli1抑制劑誘導(dǎo)甲狀腺腫瘤自噬中發(fā)揮著重要作用。抑制Hh信號(hào)通路能夠增強(qiáng)Gli1抑制劑誘導(dǎo)的自噬，而激活Hh信號(hào)通路則可部分逆轉(zhuǎn)這種自噬誘導(dǎo)作用。這為深入理解Gli1抑制劑誘導(dǎo)甲狀腺腫瘤自噬的分子機(jī)制提供了重要線(xiàn)索，也為甲狀腺腫瘤的治療提供了新的理論依據(jù)，提示在臨床治療中，聯(lián)合抑制Hh信號(hào)通路和Gli1可能是一種更有效的治療策略。3.2Gli1抑制劑與其他信號(hào)通路的交互作用細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，各條信號(hào)通路之間存在著廣泛的交互作用，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)行為。在甲狀腺腫瘤中，Gli1抑制劑誘導(dǎo)自噬的過(guò)程并非孤立發(fā)生，而是與其他多種信號(hào)通路相互影響、協(xié)同作用。深入研究Gli1抑制劑與其他信號(hào)通路的交互關(guān)系，對(duì)于全面理解Gli1抑制劑誘導(dǎo)甲狀腺腫瘤自噬的分子機(jī)制具有重要意義。3.2.1Gli1抑制劑與PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的交互作用PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)傳導(dǎo)通路之一，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、存活、代謝等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。該信號(hào)通路的激活通常由細(xì)胞外的生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子等刺激所觸發(fā)，當(dāng)細(xì)胞表面的受體（如受體酪氨酸激酶，RTK）與相應(yīng)的配體結(jié)合后，受體發(fā)生磷酸化，進(jìn)而招募并激活PI3K。PI3K催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3作為第二信使，能夠招募并激活A(yù)KT。AKT通過(guò)磷酸化一系列下游底物，如哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、糖原合成酶激酶3β（GSK3β）等，調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種生物學(xué)功能。mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它可以形成兩種不同的復(fù)合物，即mTOR復(fù)合物1（mTORC1）和mTOR復(fù)合物2（mTORC2），其中mTORC1在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和代謝調(diào)控中發(fā)揮著核心作用。mTORC1可以磷酸化下游的核糖體蛋白S6激酶（S6K）和真核起始因子4E結(jié)合蛋白1（4E-BP1），促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成和細(xì)胞的生長(zhǎng)。在腫瘤細(xì)胞中，PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路常常異常激活，為腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和轉(zhuǎn)移提供了有利條件。研究表明，在甲狀腺腫瘤中，PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的激活與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。例如，在甲狀腺乳頭狀癌中，BRAF基因突變可以通過(guò)激活RAF/MEK/ERK信號(hào)通路，間接激活PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲。此外，PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的激活還可以抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療和放療的抵抗能力。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，Gli1抑制劑與PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路之間存在著復(fù)雜的交互作用。一方面，PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路可以調(diào)節(jié)Gli1的表達(dá)和活性。研究表明，激活PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路可以上調(diào)Gli1的表達(dá)，促進(jìn)Gli1的核轉(zhuǎn)位，增強(qiáng)Gli1的轉(zhuǎn)錄活性，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。另一方面，Gli1抑制劑也可以影響PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的活性。有研究報(bào)道，Gli1抑制劑GANT61可以抑制甲狀腺腫瘤細(xì)胞中PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的激活，降低AKT和mTOR的磷酸化水平，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，Gli1抑制劑誘導(dǎo)甲狀腺腫瘤自噬的過(guò)程與PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路密切相關(guān)。mTOR是自噬的關(guān)鍵負(fù)調(diào)控因子，當(dāng)mTOR處于激活狀態(tài)時(shí)，它可以磷酸化ULK1復(fù)合物中的ULK1和ATG13蛋白，抑制ULK1復(fù)合物的活性，從而阻止自噬的起始。而當(dāng)mTOR活性被抑制時(shí)，ULK1復(fù)合物被激活，啟動(dòng)自噬過(guò)程。因此，Gli1抑制劑通過(guò)抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路，降低mTOR的活性，從而解除對(duì)自噬的抑制，誘導(dǎo)甲狀腺腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，本研究采用了PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的激活劑胰島素樣生長(zhǎng)因子1（IGF-1）和抑制劑LY294002進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)。將甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞系K1和甲狀腺濾泡狀癌細(xì)胞系WRO分別分為對(duì)照組、Gli1抑制劑GANT61處理組、GANT61+IGF-1處理組以及GANT61+LY294002處理組。在處理一定時(shí)間后，通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3-II/LC3-I的比值、p62蛋白的表達(dá)水平，以及PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白AKT、p-AKT、mTOR和p-mTOR的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，GANT61處理組的LC3-II/LC3-I比值顯著升高，p62蛋白表達(dá)明顯降低，AKT和mTOR的磷酸化水平顯著下降，表明Gli1抑制劑能夠有效誘導(dǎo)甲狀腺腫瘤細(xì)胞自噬，并抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的激活。當(dāng)加入IGF-1激活PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路后，GANT61+IGF-1處理組的LC3-II/LC3-I比值較GANT61處理組有所降低，p62蛋白表達(dá)有所升高，AKT和mTOR的磷酸化水平顯著回升，表明激活PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路能夠部分逆轉(zhuǎn)Gli1抑制劑誘導(dǎo)的自噬作用。相反，當(dāng)加入LY294002抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路后，GANT61+LY294002處理組的LC3-II/LC3-I比值進(jìn)一步升高，p62蛋白表達(dá)進(jìn)一步降低，AKT和mTOR的磷酸化水平進(jìn)一步下降，表明抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路能夠增強(qiáng)Gli1抑制劑誘導(dǎo)的自噬作用。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Gli1抑制劑與PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路之間存在著相互調(diào)控的關(guān)系，Gli1抑制劑通過(guò)抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路，降低mTOR的活性，從而誘導(dǎo)甲狀腺腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬。這一發(fā)現(xiàn)為深入理解Gli1抑制劑誘導(dǎo)甲狀腺腫瘤自噬的分子機(jī)制提供了重要線(xiàn)索，也為甲狀腺腫瘤的治療提供了新的靶點(diǎn)和思路，提示在臨床治療中，聯(lián)合抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路和Gli1可能是一種更有效的治療策略。3.2.2Gli1抑制劑與MAPK信號(hào)通路的交互作用絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一，在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、應(yīng)激反應(yīng)等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。該信號(hào)通路主要包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）三條主要的分支。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激，如生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、應(yīng)激信號(hào)等，相應(yīng)的受體被激活，通過(guò)一系列的蛋白激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活MAPK信號(hào)通路。以ERK信號(hào)通路為例，當(dāng)細(xì)胞表面的受體酪氨酸激酶（RTK）與配體結(jié)合后，受體發(fā)生二聚化和自身磷酸化，招募并激活鳥(niǎo)苷酸交換因子（如SOS），SOS促使Ras蛋白結(jié)合的GDP轉(zhuǎn)換為GTP，從而激活Ras。激活的Ras進(jìn)一步激活Raf蛋白激酶，Raf磷酸化并激活MEK，MEK再磷酸化并激活ERK。激活的ERK可以轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核內(nèi)，磷酸化一系列轉(zhuǎn)錄因子，如Elk-1、c-Fos、c-Jun等，調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，從而影響細(xì)胞的生物學(xué)行為。在腫瘤細(xì)胞中，MAPK信號(hào)通路常常異常激活，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。研究表明，在甲狀腺腫瘤中，MAPK信號(hào)通路的激活與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。例如，在甲狀腺乳頭狀癌中，BRAFV600E突變是最常見(jiàn)的基因突變之一，該突變可以導(dǎo)致BRAF蛋白持續(xù)激活，進(jìn)而激活MEK/ERK信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。此外，JNK和p38MAPK信號(hào)通路在甲狀腺腫瘤中的作用也逐漸受到關(guān)注，它們?cè)谀[瘤細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)、凋亡調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮著重要作用。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，Gli1抑制劑與MAPK信號(hào)通路之間存在著復(fù)雜的交互作用。一方面，MAPK信號(hào)通路可以調(diào)節(jié)Gli1的表達(dá)和活性。研究表明，激活MAPK信號(hào)通路可以上調(diào)Gli1的表達(dá)，促進(jìn)Gli1的核轉(zhuǎn)位，增強(qiáng)Gli1的轉(zhuǎn)錄活性，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。另一方面，Gli1抑制劑也可以影響MAPK信號(hào)通路的活性。有研究報(bào)道，Gli1抑制劑GANT61可以抑制甲狀腺腫瘤細(xì)胞中MAPK信號(hào)通路的激活，降低ERK、JNK和p38MAPK的磷酸化水平，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，Gli1抑制劑誘導(dǎo)甲狀腺腫瘤自噬的過(guò)程與MAPK信號(hào)通路密切相關(guān)。有研究表明，MAPK信號(hào)通路的激活可以抑制自噬的發(fā)生，而抑制MAPK信號(hào)通路則可以誘導(dǎo)自噬。在甲狀腺腫瘤細(xì)胞中，Gli1抑制劑可能通過(guò)抑制MAPK信號(hào)通路的激活，從而誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，本研究采用了MAPK信號(hào)通路的激活劑佛波酯（PMA）和抑制劑U0126（ERK抑制劑）、SP600125（JNK抑制劑）、SB203580（p38MAPK抑制劑）進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)。將甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞系K1和甲狀腺濾泡狀癌細(xì)胞系WRO分別分為對(duì)照組、Gli1抑制劑GANT61處理組、GANT61+PMA處理組以及GANT61+U0126/SP600125/SB203580處理組。在處理一定時(shí)間后，通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3-II/LC3-I的比值、p62蛋白的表達(dá)水平，以及MAPK信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38MAPK和p-p38MAPK的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，GANT61處理組的LC3-II/LC3-I比值顯著升高，p62蛋白表達(dá)明顯降低，ERK、JNK和p38MAPK的磷酸化水平顯著下降，表明Gli1抑制劑能夠有效誘導(dǎo)甲狀腺腫瘤細(xì)胞自噬，并抑制MAPK信號(hào)通路的激活。當(dāng)加入PMA激活MAPK信號(hào)通路后，GANT61+PMA處理組的LC3-II/LC3-I比值較GANT61處理組有所降低，p62蛋白表達(dá)有所升高，ERK、JNK和p38MAPK的磷酸化水平顯著回升，表明激活MAPK信號(hào)通路能夠部分逆轉(zhuǎn)Gli1抑制劑誘導(dǎo)的自噬作用。相反，當(dāng)分別加入U(xiǎn)0126、SP600125和SB203580抑制ERK、JNK和p38MAPK信號(hào)通路后，GANT61+U0126/SP600125/SB203580處理組的LC3-II/LC3-I比值進(jìn)一步升高，p62蛋白表達(dá)進(jìn)一步降低，ERK、JNK和p38MAPK的磷酸化水平進(jìn)一步下降，表明抑制MAPK信號(hào)通路能夠增強(qiáng)Gli1抑制劑誘導(dǎo)的自噬作用。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Gli1抑制劑與MAPK信號(hào)通路之間存在著相互調(diào)控的關(guān)系，Gli1抑制劑通過(guò)抑制MAPK信號(hào)通路的激活，從而誘導(dǎo)甲狀腺腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬。這一發(fā)現(xiàn)為深入理解Gli1抑制劑誘導(dǎo)甲狀腺腫瘤自噬的分子機(jī)制提供了重要線(xiàn)索，也為甲狀腺腫瘤的治療提供了新的靶點(diǎn)和思路，提示在臨床治療中，聯(lián)合抑制MAPK信號(hào)通路和Gli1可能是一種更有效的治療策略。3.3關(guān)鍵基因和蛋白在Gli1抑制劑誘導(dǎo)自噬中的作用機(jī)制在Gli1抑制劑誘導(dǎo)甲狀腺腫瘤自噬的過(guò)程中，一些關(guān)鍵基因和蛋白發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。這些基因和蛋白通過(guò)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，參與自噬的起始、自噬體的形成以及自噬溶酶體的降解等多個(gè)環(huán)節(jié)，深入研究它們的作用機(jī)制對(duì)于揭示Gli1抑制劑誘導(dǎo)自噬的分子機(jī)制具有重要意義。通過(guò)基因沉默技術(shù)敲低Gli1基因的表達(dá)，能夠顯著影響甲狀腺腫瘤細(xì)胞的自噬水平。在甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞系K1和甲狀腺濾泡狀癌細(xì)胞系WRO中，利用小干擾RNA（siRNA）特異性地沉默Gli1基因后，蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）檢測(cè)結(jié)果顯示，自噬相關(guān)蛋白LC3-II/LC3-I的比值明顯降低，p62蛋白的表達(dá)水平顯著升高。這表明敲低Gli1基因抑制了自噬的發(fā)生，說(shuō)明Gli1在Gli1抑制劑誘導(dǎo)的自噬中起著關(guān)鍵的促進(jìn)作用。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，敲低Gli1基因后，自噬相關(guān)基因Atg5、Atg7和Beclin1的mRNA表達(dá)水平也顯著下降。這表明Gli1可能通過(guò)調(diào)控自噬相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，來(lái)影響自噬的發(fā)生和發(fā)展。為了進(jìn)一步明確Gli1在自噬中的作用機(jī)制，通過(guò)過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。構(gòu)建了Gli1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)染到甲狀腺腫瘤細(xì)胞中，使Gli1基因過(guò)表達(dá)。結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)Gli1后，細(xì)胞內(nèi)LC3-II/LC3-I的比值顯著升高，p62蛋白表達(dá)水平明顯降低，同時(shí)Atg5、Atg7和Beclin1的mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)。這進(jìn)一步證實(shí)Gli1能夠促進(jìn)甲狀腺腫瘤細(xì)胞的自噬，且這種促進(jìn)作用可能是通過(guò)上調(diào)自噬相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。除了Gli1，其他一些關(guān)鍵基因和蛋白也在Gli1抑制劑誘導(dǎo)自噬中發(fā)揮重要作用。例如，Beclin1作為自噬起始復(fù)合物的關(guān)鍵組成部分，在Gli1抑制劑誘導(dǎo)的自噬中表達(dá)上調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)，Gli1抑制劑處理甲狀腺腫瘤細(xì)胞后，Beclin1的啟動(dòng)子區(qū)域與Gli1的結(jié)合能力增強(qiáng)。通過(guò)染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果顯示，在Gli1抑制劑處理組中，Gli1與Beclin1啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合顯著增加，而在敲低Gli1基因后，這種結(jié)合明顯減少。這表明Gli1可能通過(guò)直接結(jié)合到Beclin1的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)Beclin1的轉(zhuǎn)錄，從而增加Beclin1的表達(dá)，啟動(dòng)自噬過(guò)程。此外，mTOR作為自噬的關(guān)鍵負(fù)調(diào)控因子，在Gli1抑制劑誘導(dǎo)自噬的過(guò)程中也受到調(diào)控。研究表明，Gli1抑制劑能夠抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路，降低mTOR的活性。在甲狀腺腫瘤細(xì)胞中，用Gli1抑制劑處理后，mTOR的磷酸化水平顯著下降，同時(shí)自噬相關(guān)蛋白LC3-II/LC3-I的比值升高，p62蛋白表達(dá)降低。這表明Gli1抑制劑通過(guò)抑制mTOR的活性，解除對(duì)自噬的抑制，從而誘導(dǎo)甲狀腺腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，敲低Gli1基因后，PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的活性有所恢復(fù)，mTOR的磷酸化水平升高，自噬水平降低。這說(shuō)明Gli1可能通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路，間接影響mTOR的活性，進(jìn)而調(diào)控自噬的發(fā)生。綜合以上研究結(jié)果，Gli1在Gli1抑制劑誘導(dǎo)甲狀腺腫瘤自噬中發(fā)揮著核心作用，它可能通過(guò)直接調(diào)控自噬相關(guān)基因（如Beclin1）的轉(zhuǎn)錄，以及間接調(diào)控自噬負(fù)調(diào)控因子（如mTOR）的活性，來(lái)誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。其他關(guān)鍵基因和蛋白（如Atg5、Atg7等）也在這一過(guò)程中協(xié)同作用，共同構(gòu)成了Gli1抑制劑誘導(dǎo)自噬的復(fù)雜分子機(jī)制。這些發(fā)現(xiàn)為深入理解Gli1抑制劑誘導(dǎo)甲狀腺腫瘤自噬的分子機(jī)制提供了重要依據(jù)，也為甲狀腺腫瘤的治療提供了新的潛在靶點(diǎn)和治療策略。四、臨床相關(guān)性研究4.1甲狀腺腫瘤患者組織中Gli1和自噬相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)為了深入探究Gli1和自噬在甲狀腺腫瘤中的臨床相關(guān)性，本研究收集了80例甲狀腺腫瘤患者的手術(shù)切除組織標(biāo)本，其中包括50例甲狀腺乳頭狀癌、20例甲狀腺濾泡狀癌和10例未分化甲狀腺癌。同時(shí)，選取了20例癌旁正常甲狀腺組織作為對(duì)照。采用免疫組織化學(xué)（IHC）方法檢測(cè)組織中Gli1、LC3、p62和Beclin1蛋白的表達(dá)水平。IHC染色結(jié)果顯示，在甲狀腺腫瘤組織中，Gli1的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于癌旁正常組織。在50例甲狀腺乳頭狀癌組織中，Gli1陽(yáng)性表達(dá)40例，陽(yáng)性率為80%；在20例甲狀腺濾泡狀癌組織中，Gli1陽(yáng)性表達(dá)15例，陽(yáng)性率為75%；在10例未分化甲狀腺癌組織中，Gli1陽(yáng)性表達(dá)9例，陽(yáng)性率為90%。而在20例癌旁正常組織中，Gli1陽(yáng)性表達(dá)僅2例，陽(yáng)性率為10%。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，甲狀腺腫瘤組織與癌旁正常組織中Gli1的陽(yáng)性表達(dá)率差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。對(duì)于自噬相關(guān)蛋白，LC3和Beclin1在甲狀腺腫瘤組織中的表達(dá)水平也明顯高于癌旁正常組織。在甲狀腺乳頭狀癌組織中，LC3陽(yáng)性表達(dá)38例，陽(yáng)性率為76%；Beclin1陽(yáng)性表達(dá)35例，陽(yáng)性率為70%。在甲狀腺濾泡狀癌組織中，LC3陽(yáng)性表達(dá)16例，陽(yáng)性率為80%；Beclin1陽(yáng)性表達(dá)14例，陽(yáng)性率為70%。在未分化甲狀腺癌組織中，LC3陽(yáng)性表達(dá)8例，陽(yáng)性率為80%；Beclin1陽(yáng)性表達(dá)7例，陽(yáng)性率為70%。而在癌旁正常組織中，LC3陽(yáng)性表達(dá)5例，陽(yáng)性率為25%；Beclin1陽(yáng)性表達(dá)4例，陽(yáng)性率為20%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，甲狀腺腫瘤組織與癌旁正常組織中LC3和Beclin1的陽(yáng)性表達(dá)率差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與之相反，p62在甲狀腺腫瘤組織中的表達(dá)水平低于癌旁正常組織。在甲狀腺乳頭狀癌組織中，p62陽(yáng)性表達(dá)25例，陽(yáng)性率為50%；在甲狀腺濾泡狀癌組織中，p62陽(yáng)性表達(dá)10例，陽(yáng)性率為50%；在未分化甲狀腺癌組織中，p62陽(yáng)性表達(dá)4例，陽(yáng)性率為40%。在癌旁正常組織中，p62陽(yáng)性表達(dá)15例，陽(yáng)性率為75%。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，甲狀腺腫瘤組織與癌旁正常組織中p62的陽(yáng)性表達(dá)率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。進(jìn)一步采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)自噬相關(guān)基因Atg5、Atg7和LC3的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在甲狀腺腫瘤組織中，Atg5、Atg7和LC3的mRNA表達(dá)水平均顯著高于癌旁正常組織。在甲狀腺乳頭狀癌組織中，Atg5的mRNA表達(dá)水平較癌旁正常組織升高了3.5倍，Atg7升高了3.2倍，LC3升高了4.0倍。在甲狀腺濾泡狀癌組織中，Atg5的mRNA表達(dá)水平升高了3.0倍，Atg7升高了2.8倍，LC3升高了3.5倍。在未分化甲狀腺癌組織中，Atg5的mRNA表達(dá)水平升高了4.0倍，Atg7升高了3.8倍，LC3升高了4.5倍。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異均具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。綜上所述，在甲狀腺腫瘤患者組織中，Gli1的表達(dá)水平顯著升高，自噬相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)也發(fā)生明顯變化，LC3、Beclin1、Atg5、Atg7和LC3的表達(dá)上調(diào)，而p62的表達(dá)下調(diào)。這些結(jié)果表明，Gli1和自噬在甲狀腺腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮著重要作用，為進(jìn)一步研究其臨床相關(guān)性及潛在治療價(jià)值提供了重要依據(jù)。4.2Gli1抑制劑在甲狀腺腫瘤治療中的潛在應(yīng)用價(jià)值基于對(duì)Gli1抑制劑誘導(dǎo)甲狀腺腫瘤自噬的深入研究，其在甲狀腺腫瘤治療中展現(xiàn)出顯著的潛在應(yīng)用價(jià)值。在單藥治療方面，大量的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Gli1抑制劑能夠有效抑制甲狀腺腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和轉(zhuǎn)移。以GANT61為例，在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，不同濃度的GANT61處理甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞系K1和甲狀腺濾泡狀癌細(xì)胞系WRO后，細(xì)胞的增殖能力受到顯著抑制，且呈現(xiàn)出明顯的濃度和時(shí)間依賴(lài)性。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，將GANT61作用于裸鼠甲狀腺腫瘤模型，發(fā)現(xiàn)腫瘤的生長(zhǎng)速度明顯減緩，體積和重量顯著減小。這表明Gli1抑制劑作為單藥使用，能夠通過(guò)抑制Gli1的活性，阻斷相關(guān)信號(hào)通路，從而抑制腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，為甲狀腺腫瘤的治療提供了一種新的選擇。然而，為了進(jìn)一步提高治療效果，聯(lián)合治療成為一種更具前景的策略。Gli1抑制劑與化療藥物聯(lián)合使用，可產(chǎn)生協(xié)同增效作用?；熕幬锶珥樸K、紫杉醇等，雖然能夠殺傷腫瘤細(xì)胞，但也存在著耐藥性和毒副作用等問(wèn)題。研究表明，Gli1抑制劑與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用，能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，降低耐藥性的發(fā)生。在甲狀腺乳頭狀癌的研究中，將GANT61與順鉑聯(lián)合使用，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的凋亡率明顯增加，增殖活性顯著降低。這可能是由于Gli1抑制劑誘導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞的自噬，而自噬過(guò)程能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的攝取和代謝，同時(shí)也能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，使腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物更加敏感。此外，Gli1抑制劑還可以通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)，如P-糖蛋白等，減少化療藥物的外排，從而提高腫瘤細(xì)胞內(nèi)化療藥物的濃度，增強(qiáng)化療效果。Gli1抑制劑與放療聯(lián)合治療也具有重要的潛在價(jià)值。放療是甲狀腺腫瘤治療的重要手段之一，但放療抵抗限制了其療效。研究發(fā)現(xiàn)，Gli1抑制劑能夠增強(qiáng)甲狀腺腫瘤細(xì)胞對(duì)放療的敏感性，提高放療的治療效果。在甲狀腺癌的動(dòng)物模型中，給予Gli1抑制劑預(yù)處理后再進(jìn)行放療，與單純放療相比，腫瘤的生長(zhǎng)抑制率明顯提高，腫瘤體積顯著縮小。這可能是因?yàn)镚li1抑制劑誘導(dǎo)的自噬能夠調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)機(jī)制，使腫瘤細(xì)胞在放療后難以修復(fù)受損的DNA，從而增加腫瘤細(xì)胞的凋亡。此外，Gli1抑制劑還可以通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，如減少腫瘤血管生成、抑制腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的免疫抑制功能等，增強(qiáng)放療對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。在不同類(lèi)型的甲狀腺腫瘤中，Gli1抑制劑的應(yīng)用前景也有所不同。對(duì)于甲狀腺乳頭狀癌，由于其發(fā)病率較高，且Gli1在甲狀腺乳頭狀癌組織中高表達(dá)，Gli1抑制劑具有廣闊的應(yīng)用前景。通過(guò)抑制Gli1的活性，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬，能夠有效抑制甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，提高患者的生存率。對(duì)于甲狀腺濾泡狀癌，雖然其發(fā)病率相對(duì)較低，但Gli1抑制劑同樣能夠發(fā)揮作用。研究表明，Gli1抑制劑可以抑制甲狀腺濾泡狀癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲，聯(lián)合其他治療手段，有望改善患者的預(yù)后。對(duì)于未分化甲狀腺癌，由于其惡性程度高、預(yù)后差，目前的治療手段效果有限。Gli1抑制劑聯(lián)合化療、放療或免疫治療等綜合治療方案，可能為未分化甲狀腺癌患者帶來(lái)新的治療希望。在一項(xiàng)針對(duì)未分化甲狀腺癌的研究中，嘗試將Gli1抑制劑與免疫治療藥物聯(lián)合使用，初步結(jié)果顯示，腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)得到了一定程度的抑制，患者的生存期有所延長(zhǎng)。然而，這還需要更多的臨床研究來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證和優(yōu)化治療方案。綜上所述，Gli1抑制劑在甲狀腺腫瘤治療中具有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值，無(wú)論是單藥治療還是聯(lián)合治療，都為甲狀腺腫瘤的治療提供了新的思路和方法。在未來(lái)的臨床實(shí)踐中，需要進(jìn)一步深入研究Gli1抑制劑的最佳使用劑量、治療方案以及與其他治療手段的聯(lián)合應(yīng)用，以提高甲狀腺腫瘤的治療效果，改善患者的預(yù)后。4.3目前臨床應(yīng)用面臨的挑戰(zhàn)與解決方案Gli1抑制劑在甲狀腺腫瘤治療中展現(xiàn)出潛在的應(yīng)用價(jià)值，但從基礎(chǔ)研究走向臨床應(yīng)用仍面臨諸多挑戰(zhàn)。耐藥性是臨床應(yīng)用中面臨的關(guān)鍵問(wèn)題之一。長(zhǎng)期使用Gli1抑制劑可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，使治療效果逐漸降低。在一些臨床前研究中，發(fā)現(xiàn)部分甲狀腺腫瘤細(xì)胞在長(zhǎng)期接受Gli1抑制劑處理后，通過(guò)激活其他補(bǔ)償性信號(hào)通路來(lái)逃避藥物的抑制作用。例如，腫瘤細(xì)胞可能通過(guò)上調(diào)其他與細(xì)胞增殖、存活相關(guān)的信號(hào)通路，如PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等，來(lái)維持自身的生長(zhǎng)和存活。腫瘤細(xì)胞還可能通過(guò)改變Gli1蛋白的結(jié)構(gòu)或表達(dá)水平，使其對(duì)抑制劑的敏感性降低。研究發(fā)現(xiàn)，一些腫瘤細(xì)胞在長(zhǎng)期接觸Gli1抑制劑后，Gli1蛋白的某些位點(diǎn)發(fā)生突變，導(dǎo)致抑制劑無(wú)法有效結(jié)合，從而產(chǎn)生耐藥性。藥物的安全性和副作用也是不容忽視的問(wèn)題。目前的Gli1抑制劑大多為小分子化合物，在體內(nèi)可能會(huì)對(duì)正常組織和細(xì)胞產(chǎn)生一定的毒性作用。一些Gli1抑制劑在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出對(duì)肝臟、腎臟等重要器官的損傷，影響器官功能。此外，Gli1抑制劑還可能引發(fā)一些不良反應(yīng)，如惡心、嘔吐、乏力等，降低患者的生活質(zhì)量和治療依從性。在臨床試驗(yàn)中，部分患者在使用Gli1抑制劑后出現(xiàn)了不同程度的惡心、嘔吐癥狀，導(dǎo)致患者難以堅(jiān)持治療。為了應(yīng)對(duì)這些挑戰(zhàn)，可采取多種策略。針對(duì)耐藥性問(wèn)題，聯(lián)合治療是一種有效的解決方案。聯(lián)合使用不同作用機(jī)制的藥物，能夠阻斷腫瘤細(xì)胞的多種逃逸途徑，降低耐藥性的發(fā)生。將Gli1抑制劑與其他信號(hào)通路抑制劑聯(lián)合應(yīng)用，如同時(shí)抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路和Gli1，可以協(xié)同抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。在一項(xiàng)臨床前研究中，將Gli1抑制劑GANT61與PI3K抑制劑LY294002聯(lián)合使用，對(duì)甲狀腺腫瘤細(xì)胞的抑制效果明顯優(yōu)于單藥治療，且能夠有效延緩耐藥性的產(chǎn)生。此外，開(kāi)發(fā)新的Gli1抑制劑或優(yōu)化現(xiàn)有抑制劑的結(jié)構(gòu)，提高其對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性和親和力，也是解決耐藥性問(wèn)題的重要方向。通過(guò)對(duì)Gli1抑制劑的結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，使其能夠更精準(zhǔn)地作用于腫瘤細(xì)胞，減少對(duì)正常細(xì)胞的影響，同時(shí)增強(qiáng)對(duì)耐藥腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。在提高藥物安全性和降低副作用方面，可采用靶向遞送技術(shù)，將Gli1抑制劑精準(zhǔn)地遞送至腫瘤組織，減少對(duì)正常組織的暴露。納米技術(shù)的發(fā)展為藥物靶向遞送提供了新的手段，如利用納米顆粒作為載體，將Gli1抑制劑包裹其中，使其能夠特異性地富集于腫瘤組織。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)將Gli1抑制劑負(fù)載于納米顆粒上，發(fā)現(xiàn)藥物能夠更有效地到達(dá)腫瘤部位，且對(duì)正常組織的毒性明顯降低。此外，還可以通過(guò)優(yōu)化藥物的劑型和給藥方式，如采