發(fā)酵工程知識(shí)點(diǎn)

發(fā)酵工程知識(shí)點(diǎn)發(fā)酵（fermentation）無(wú)氧條件下，有機(jī)化合物進(jìn)行不徹底分解代謝釋放能量的過(guò)程。利用生物體或生物細(xì)胞（含動(dòng)物、植物和微生物細(xì)胞），在合適的條件下，經(jīng)特定的代謝途徑生產(chǎn)所需產(chǎn)物或菌體的過(guò)程。發(fā)酵工程（FermentationEngineering）：發(fā)酵工程是指采用現(xiàn)代工程技術(shù)手段，利用生物體或生物細(xì)胞的某些特定功能，為人類生產(chǎn)有用的產(chǎn)品，或直接把生物體或生物細(xì)胞應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程的一種新技術(shù)。發(fā)酵工程的特點(diǎn)1安全、簡(jiǎn)單：常溫常壓條件要求簡(jiǎn)單2原料來(lái)源廣，價(jià)格低：淀粉、糖蜜或其他農(nóng)副產(chǎn)品為主，礦石資源、石油產(chǎn)品甚至廢水、廢料亦可。3反應(yīng)專一：發(fā)酵通過(guò)生物體的自動(dòng)調(diào)節(jié)完成，專一性強(qiáng)，可得較為單一的代謝產(chǎn)物。4代謝多樣：即使是極其復(fù)雜的高分子化合物，也能在自然界找到所需的代謝產(chǎn)物。5.易受污染：培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)豐富，適合非目的微生物的生長(zhǎng)6.菌種易變異：通過(guò)變異和菌種篩選，可獲得高產(chǎn)的優(yōu)良菌株并使生產(chǎn)設(shè)備得到充分利用，也可以因此獲得按常規(guī)方法難以生產(chǎn)的產(chǎn)品。時(shí)間 時(shí)期 主要技術(shù)1900年前 自然發(fā)酵 天然接種1900~1939年 純培養(yǎng) 單種微生物分離與純培養(yǎng)技術(shù)1940~1956年 通氣培養(yǎng) 通氣攪拌的好氣性發(fā)酵工程技術(shù)1957~1959年 代謝控制 人工誘變育種與代謝控制發(fā)酵1960~1978年 全面發(fā)展 發(fā)酵動(dòng)力學(xué)、發(fā)酵的連續(xù)化自動(dòng)化工程技術(shù)；微生物生物合成和化學(xué)反應(yīng)合成相結(jié)合工程技術(shù)1979年至今 基因工程 原生質(zhì)體融合技術(shù)和DNA重組技術(shù)發(fā)酵生產(chǎn)方式：根據(jù)生產(chǎn)用微生物種類進(jìn)行分類：自然發(fā)酵自然環(huán)境或原料中天然存在的微生物菌群（傳統(tǒng)發(fā)酵：釀酒、制醋、做醬等）單菌純種發(fā)酵現(xiàn)在發(fā)酵工業(yè)常用（谷氨酸、抗生素、酶制劑）混菌純種發(fā)酵2種及2種以上純培養(yǎng)的微生物進(jìn)行混合發(fā)酵，現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)應(yīng)用到傳統(tǒng)發(fā)酵食品的形式。（直投式發(fā)酵劑生產(chǎn)酸乳、液體釀酒新工藝）根據(jù)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)進(jìn)行分類固態(tài)發(fā)酵發(fā)酵基質(zhì)呈不流動(dòng)狀態(tài)，傳統(tǒng)發(fā)酵常用。（食用菌的培養(yǎng)、大曲酒發(fā)酵、好氧菌的曲法培養(yǎng)、厭氧性的堆積發(fā)酵等）半固態(tài)發(fā)酵發(fā)酵基質(zhì)為半流動(dòng)狀態(tài)（黃酒發(fā)酵、醬油稀醪發(fā)酵）液態(tài)發(fā)酵發(fā)酵基質(zhì)為流動(dòng)狀態(tài)，主要方式為淺盤培養(yǎng)和深層液體培養(yǎng)。淺盤發(fā)酵：勞動(dòng)強(qiáng)度大、生產(chǎn)效率低、易污染；簡(jiǎn)單易行、投資少、適用于小型生產(chǎn)獲得優(yōu)質(zhì)的生產(chǎn)菌種是實(shí)現(xiàn)高水平發(fā)酵工程工業(yè)生產(chǎn)的前提。工業(yè)用菌種的要求：具備高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)目的代謝產(chǎn)物的能力具備穩(wěn)定的遺傳特性，不易變異和退化安全性（不是病源菌，不產(chǎn)毒素）生長(zhǎng)繁殖能力強(qiáng)，有較高的生長(zhǎng)速率，發(fā)酵周期短生產(chǎn)原料價(jià)格便宜、來(lái)源廣泛培養(yǎng)要求不高，培養(yǎng)條件易于控制不產(chǎn)生或少產(chǎn)生非目標(biāo)產(chǎn)物工業(yè)微生物菌種分離篩選的步驟：采集、富集、培養(yǎng)、篩選、產(chǎn)物分析工業(yè)菌種選育的思路：(1)進(jìn)：增加菌種利用底物或前體物的水平(2)通：解除或繞過(guò)代謝途徑中的限速步驟(3)截：改變代謝途徑，減少無(wú)用副產(chǎn)品的生成(4)堵：抑制或消除菌種對(duì)產(chǎn)品的利用和分解(5)出：改進(jìn)菌種外泌產(chǎn)品的能力種子擴(kuò)大培養(yǎng)：是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處于休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，再經(jīng)過(guò)扁瓶或搖瓶及種子罐逐級(jí)放大培養(yǎng)而獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過(guò)程。這些純種培養(yǎng)物稱為種子。作用：形成生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)、抑制雜菌污染獲得生長(zhǎng)活力旺盛、繁殖能力強(qiáng)的種子，縮短發(fā)酵周期逐步適應(yīng)大規(guī)模生產(chǎn)。目的：為發(fā)酵罐的投料提供一定數(shù)量代謝旺盛的種子。目標(biāo)：不但得到純而壯的培養(yǎng)物，而且要獲得活力旺盛、數(shù)量足夠的培養(yǎng)物。優(yōu)質(zhì)種子的標(biāo)準(zhǔn)菌種細(xì)胞的生長(zhǎng)活力強(qiáng)、同步性好，移種至發(fā)酵罐后能迅速生長(zhǎng)，遲緩期短；生理狀態(tài)穩(wěn)定，保持穩(wěn)定的生產(chǎn)能力；菌體總量及濃度能滿足大容量發(fā)酵罐的要求；無(wú)雜菌及噬菌體污染。實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)大培養(yǎng)主要有三種方法孢子進(jìn)罐法菌絲進(jìn)罐法細(xì)胞進(jìn)罐法生產(chǎn)車間擴(kuò)大培養(yǎng)：常用接種方法：胞子懸浮液-----微孔接種法搖瓶菌絲體------火焰保護(hù)接種法或壓差法影響種子質(zhì)量的因素：一、培養(yǎng)基原材料質(zhì)量波動(dòng)瓊脂牌號(hào)的不同水質(zhì)二、培養(yǎng)條件溫度濕度通氣量種齡接種量培養(yǎng)時(shí)間和冷藏時(shí)間種子質(zhì)量的控制措施：菌種穩(wěn)定性的檢查無(wú)（雜菌）檢查創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件菌種退化（degeneration）主要指生產(chǎn)菌種或選育過(guò)程中篩選出來(lái)的優(yōu)質(zhì)菌株，由于連續(xù)傳代保藏之后，菌株的某些生理性狀和形態(tài)特征逐漸退化或完全喪失的現(xiàn)象。菌種退化的防治：從菌種選育方面考慮在育種過(guò)程中，應(yīng)盡可能使用孢子或單核菌株，避免對(duì)多核細(xì)胞進(jìn)行處理；在使單鏈突變的同時(shí)，使另一條單鏈喪失模板作用，以減少出現(xiàn)分離回復(fù)現(xiàn)象；誘變處理后應(yīng)進(jìn)行充分的分離純化，以保證菌株的“純度”。從菌種保藏方面考慮控制傳代次數(shù)利用不易衰退的細(xì)胞傳代選擇合適的菌種保藏方法其他方面創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件真空冷凍干燥保藏法1）冷凍干燥原理水分在冰凍狀態(tài)下直接升華而干燥2）冷凍干燥的三要素：真空——降低水的蒸汽壓以加速水分的蒸發(fā)冷凍——使水蒸氣冷凝以減輕真空泵負(fù)荷,加速干燥溫度——達(dá)到進(jìn)一步加速干燥的目的3）冷凍干燥的優(yōu)點(diǎn)：對(duì)微生物的生物活性影響小所得干粉疏松，溶解性好；水分含量低；由于同時(shí)滿足干燥和真空兩個(gè)菌保要素，因而保存時(shí)間長(zhǎng),保存過(guò)程不易失活和退化真空冷凍干燥操作流程：冷凍干燥管準(zhǔn)備脫脂牛奶的準(zhǔn)備菌懸液的制備冷凍干燥真空封口質(zhì)量檢驗(yàn)液氮冷凍保藏法：冷凍保護(hù)劑在液氮冷凍保藏中，最常用的冷凍保護(hù)劑是二甲亞砜和甘油，最終使用濃度一般為甘油10％、二甲亞砜5％。液氮冷凍保藏微生物菌種的步驟：待冷凍保藏菌種懸液的制備從液體培養(yǎng)物制備菌懸液：液氮冷凍保藏菌種的活化微生物代謝的控制：是指運(yùn)用人為的方法對(duì)微生物的代謝調(diào)節(jié)進(jìn)行遺傳改造和條件的控制，以期按照人們的愿望，生產(chǎn)有用的微生物制品。實(shí)現(xiàn)初級(jí)代謝產(chǎn)物代謝控制發(fā)酵的方法：控制發(fā)酵條件培養(yǎng)基（各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，不同的氮、碳源等）pH

溫度

溶氧

誘導(dǎo)物、前體

改變細(xì)胞透性生理學(xué)方法

谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)，生物素濃度的控制；

添加青霉素；

表面活性劑

遺傳學(xué)方法

營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株。如谷氨酸生產(chǎn)菌的油酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型，控制油酸，細(xì)胞膜合成不完整。

3、改變菌種的遺傳特性調(diào)節(jié)性或組成型突變株抗反饋突變菌株?duì)I養(yǎng)缺陷型菌株雙重營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物的調(diào)節(jié)方式：酶合成的誘導(dǎo)調(diào)節(jié)次級(jí)代謝產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)產(chǎn)生菌生長(zhǎng)速率調(diào)節(jié)初級(jí)代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)磷酸鹽調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)次級(jí)代謝產(chǎn)物代謝控制發(fā)酵的方法

1、補(bǔ)加前體或其類似物2、加入誘導(dǎo)物3、防止碳分解代謝阻遏或抑制的發(fā)生4、防止氮、磷代謝阻遏或抑制的發(fā)生5、篩選耐前體或前體類似物的突變株6、選育抗性突變株或營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株7、調(diào)節(jié)性或組成型突變株生產(chǎn)用培養(yǎng)基要求：滿足生產(chǎn)用菌種生長(zhǎng)繁殖需求滿足生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物的需求連續(xù)滅菌與間歇滅菌的比較：連續(xù)滅菌的優(yōu)點(diǎn)–保留較多的營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量；–容易放大；–較易自動(dòng)控制；–縮短滅菌周期；–在某些情況下，可使發(fā)酵罐的腐蝕減少；–發(fā)酵罐利用率高；–蒸汽負(fù)荷均勻。分批滅菌的優(yōu)點(diǎn)–設(shè)備投資較少–染菌的危險(xiǎn)性較小–人工操作較方便，適于小規(guī)模生產(chǎn)–對(duì)培養(yǎng)基中固體物質(zhì)含量較多時(shí)更為適宜如何解決高溫滅菌對(duì)培養(yǎng)基的破壞：不耐熱成分單獨(dú)滅菌采用過(guò)濾除菌、降低滅菌溫度、縮短滅菌時(shí)間產(chǎn)生沉淀反應(yīng)的成分分開滅菌采用連續(xù)滅菌的方法發(fā)酵動(dòng)力學(xué)（fermentationkinetics）：研究發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(zhǎng)、基質(zhì)消耗、產(chǎn)物合成等變化速率，以及反應(yīng)速率與各種影響因素之間內(nèi)在規(guī)律的科學(xué)，并以數(shù)學(xué)、工程學(xué)的原理，進(jìn)行定量描述。研究發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的目的：認(rèn)識(shí)發(fā)酵過(guò)程的規(guī)律優(yōu)化發(fā)酵工藝條件，確定最優(yōu)發(fā)酵過(guò)程參數(shù)，如：基質(zhì)濃度、溫度、pH、溶氧等提高發(fā)酵產(chǎn)量、效率和轉(zhuǎn)化率等

分批發(fā)酵（）：指一次性投料、接種直到發(fā)酵結(jié)束，屬典型的非穩(wěn)態(tài)過(guò)程。根據(jù)發(fā)酵時(shí)間過(guò)程分析，微生物生長(zhǎng)與產(chǎn)物合成存在以下三種關(guān)系：與生長(zhǎng)相關(guān)→生長(zhǎng)偶聯(lián)型與生長(zhǎng)部分相關(guān)→生長(zhǎng)部分偶聯(lián)型與生長(zhǎng)不相關(guān)→無(wú)關(guān)聯(lián)補(bǔ)料分批式操作Fed-batchfermentation:在分批過(guò)程中，間歇或連續(xù)地以某種方式向培養(yǎng)系統(tǒng)中補(bǔ)加一定物料。連續(xù)發(fā)酵概念：當(dāng)發(fā)酵過(guò)程啟動(dòng)到一定階段（如產(chǎn)物合成最適時(shí)期），一邊連續(xù)補(bǔ)充發(fā)酵培養(yǎng)液，一邊又以相近的流速放出發(fā)酵液，使發(fā)酵罐內(nèi)料液量維持恒定，微生物在近似恒定狀態(tài)（恒定的基質(zhì)濃度、恒定的產(chǎn)物濃度、恒定的pH、恒定菌體濃度、恒定的比生長(zhǎng)速率）下生長(zhǎng)的發(fā)酵方式。引起pH變化的因素：1）基質(zhì)代謝（1）糖代謝特別是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使pH下降。糖缺乏，pH上升，是補(bǔ)料的標(biāo)志之一（2）氮代謝當(dāng)氨基酸中的-NH2被利用后pH會(huì)下降；尿素被分解成NH3，pH上升，NH3利用后pH下降，當(dāng)碳源不足時(shí)氮源當(dāng)碳源利用pH上升。（3）生理酸堿性物質(zhì)利用后pH會(huì)上升或下降2）產(chǎn)物形成某些產(chǎn)物本身呈酸性或堿性，使發(fā)酵液pH變化。如有機(jī)酸類產(chǎn)生使pH下降，紅霉素、潔霉素、螺旋霉素等抗生素呈堿性，使pH上升。3）菌體自溶，發(fā)酵后期，pH上升。引起發(fā)酵液pH值變化的常見(jiàn)因素(1)下降①培養(yǎng)基中C/N不當(dāng)，有機(jī)酸積累；②消沫油加得過(guò)多；③生理酸性物質(zhì)過(guò)多；(2)上升①C/N比例不當(dāng)，N過(guò)多，氨基氮釋放；②生理堿性物質(zhì)過(guò)多；③中間補(bǔ)料時(shí)堿性物加入量過(guò)大；發(fā)酵過(guò)程中pH值的調(diào)節(jié)及控制：1）發(fā)酵pH值的確定（范圍，時(shí)間）一般是在5～8之間，如谷氨酸發(fā)酵的最適pH值為7.5～8.0。隨菌種和產(chǎn)品不同而不同。同一菌種，生長(zhǎng)最適pH值可能與產(chǎn)物合成的最適pH值是不一樣的。按發(fā)酵過(guò)程的不同階段分別控制不同的pH，使產(chǎn)量最大。pH的控制方法常用方法調(diào)節(jié)好基礎(chǔ)料的pH?；A(chǔ)料中若含有玉米漿，pH呈酸性，必須調(diào)節(jié)pH。若要控制消后pH在6.0，消前pH往往要調(diào)到6.5-6.8。在基礎(chǔ)料中加入維持pH的物質(zhì)，如CaCO3，或具有緩沖能力的試劑，如磷酸緩沖液等通過(guò)補(bǔ)料調(diào)節(jié)pH在發(fā)酵過(guò)程中根據(jù)糖氮消耗需要進(jìn)行補(bǔ)料。在補(bǔ)料與調(diào)pH沒(méi)有矛盾時(shí)采用補(bǔ)料調(diào)pH，如（1）調(diào)節(jié)補(bǔ)糖速率，調(diào)節(jié)空氣流量來(lái)調(diào)節(jié)pH（2）當(dāng)NH2-N低，pH低時(shí)補(bǔ)氨水；當(dāng)NH2-N低，pH高時(shí)補(bǔ)(NH4)2SO4當(dāng)補(bǔ)料與調(diào)pH發(fā)生矛盾時(shí)，加酸堿調(diào)pH泡沫對(duì)發(fā)酵的不利影響：降低發(fā)酵設(shè)備的利用率增加了菌群的非均一性增加了染菌的機(jī)會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物的損失消泡劑會(huì)給后提取工序帶來(lái)困難泡沫的控制：①調(diào)整培養(yǎng)基中的成分(如少加或緩加易起泡的原材料)或改變某些物理化學(xué)參數(shù)(如pH值、溫度、通氣和攪拌)或者改變發(fā)酵工藝(如采用分次投料)來(lái)控制，以減少泡沫形成的機(jī)會(huì)。但這些方法的效果有一定的限度。②采用菌種選育的方法，篩選不產(chǎn)生流態(tài)泡沫的菌種，來(lái)消除起泡的內(nèi)在因素如：雜交選育不產(chǎn)流態(tài)泡沫的土霉素生產(chǎn)菌株對(duì)于已形成的泡沫，工業(yè)上可以采用機(jī)械消泡和化學(xué)消泡劑消泡或兩者同時(shí)使用消泡。③采用機(jī)械消泡或消泡劑消泡這兩種方法來(lái)消除已形成的泡沫：通過(guò)化學(xué)方法，降低泡沫液膜的表面張力，使泡沫破滅；利用物理方法，使泡沫液膜的局部受力，打破液膜原來(lái)受力平衡而破裂。什么叫發(fā)酵染菌?在發(fā)酵過(guò)程中，生產(chǎn)菌以外的其他微生物侵入了發(fā)酵液，從而使發(fā)酵過(guò)程失去了真正意義上的純種培養(yǎng)。染菌會(huì)對(duì)發(fā)酵工業(yè)造成哪些不良影響？染菌仍是發(fā)酵工業(yè)的致命傷。輕者影響產(chǎn)率、產(chǎn)物提取收得率和產(chǎn)品質(zhì)量；嚴(yán)重者造成生產(chǎn)失敗，浪費(fèi)大量原材料，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，而且擾亂生產(chǎn)秩序，破壞生產(chǎn)計(jì)劃。遇到連續(xù)染菌，特別是又找不到染菌原因，未有防治措施時(shí)，往往會(huì)影響人們的情緒和生產(chǎn)積極性，造成無(wú)法估量的危害。發(fā)酵異?，F(xiàn)象及染菌原因分析：溶解氧的異常變化當(dāng)雜菌是好氣性微生物時(shí)，溶解氧的變化是在較短時(shí)間內(nèi)下降，直至接近于零，且在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)不能回升；當(dāng)雜菌是非好氣性微生物，而生產(chǎn)菌由于受污染而抑制生長(zhǎng)，使耗氧量減少，溶解氧升高。排氣的CO2異常變化對(duì)于特定的發(fā)酵