2024-2025學年高二生物人教版選擇性必修3 第3章 實驗突破二 DNA片段的擴增及電泳鑒定

一、DNA片段的擴增1．實驗原理2．實驗步驟二、PCR擴增產(chǎn)物的電泳鑒定1．實驗原理2．實驗步驟三、操作提示1．為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌處理。在向微量離心管中添加反應組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。2．緩沖液和酶應分裝成小份，并在－20℃儲存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。四、關鍵點撥1．PCR擴增目的基因時，復性溫度的設定是成敗的關鍵。復性溫度過高會破壞引物與模板的堿基配對，復性溫度過低又會造成引物不能與DNA模板鏈的特定部位結合。復性溫度的設定與引物長度、堿基組成有關，假設引物的長度相同，在G、C含量高時，設定的復性溫度要高一些。因為DNA分子中G—C之間有三個氫鍵，A—T之間有兩個氫鍵。2．未出現(xiàn)擴增條帶的主要原因(1)TaqDNA聚合酶失活。(2)引物出現(xiàn)質量問題。(3)Mg2＋濃度過低。(4)變性時的溫度低，變性時間短。3．出現(xiàn)非特異性擴增條帶的主要原因(1)模板DNA出現(xiàn)污染。(2)引物特異性不強或形成引物二聚體。(3)Mg2＋濃度過高。(4)復性時的溫度過低等。例1(2023·滄州高二月考)關于“DNA片段的擴增及電泳鑒定”實驗，下列相關敘述正確的是()A．PCR儀實質上就是一臺能自動調控溫度的儀器，但在使用時需根據(jù)擴增的DNA片段以及引物的情況人工設定合適的溫度B．PCR反應體系中需加入耐高溫的DNA聚合酶，該酶主要在復性過程中起作用C．為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭、蒸餾水和移液器等在使用前都必須進行高壓滅菌處理D．電泳時，電泳緩沖液不能沒過凝膠，以免凝膠加樣孔中的電泳樣液流出答案A解析PCR反應體系中需加入耐高溫的DNA聚合酶，該酶主要在延伸過程中起作用，B錯誤；為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭、蒸餾水等在使用前都必須進行高壓滅菌處理，移液器不需要高壓滅菌處理，C錯誤；電泳時，電泳緩沖液以沒過凝膠1mm為宜，D錯誤。例2用PCR方法檢測轉基因植株是否成功導入目的基因時，得到以下電泳圖譜，其中1號為DNA標準樣液(Marker)，10號為無菌蒸餾水，PCR時加入的模板DNA如圖所示。據(jù)此作出的分析，不合理的是()A．PCR產(chǎn)物的分子大小在250～500bp之間B．3號樣品為不含目的基因的載體DNAC．9號樣品對應植株不是所需的轉基因植株D．10號確定反應體系等對結果沒有干擾答案B解析PCR過程中，可以通過設計特定的引物來擴增特定的DNA片段，4～9號是轉基因植株，理論上應包含目的基因，結合2號野生型和10號蒸餾水組的結果，推測包含目的基因的片段大小應為250～500bp，A合理；3號PCR結果包含250～500bp片段，應包含目的基因，B不合理；9號PCR結果不包含250～500bp片段，所以不是所需轉基因植株，C合理；10號放入蒸餾水，可排除反應體系等對結果的干擾，D合理。1．下列關于PCR操作過程的敘述，錯誤的是()A．在進行操作時，一定要戴好一次性手套B．PCR所用的緩沖液和酶應分裝成小份，在－20℃儲存C．將PCR所用緩沖液和酶從冰箱拿出，需放在高溫環(huán)境中迅速融化D．在向微量離心管中添加反應組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換答案C解析將PCR所用緩沖液和酶從冰箱拿出，需放在冰塊上緩慢融化，C錯誤。2．(2023·鹽城高二期中)某實驗利用PCR技術獲取目的基因，實驗結果顯示除目的基因條帶(引物與模板完全配對)外，還有2條非特異條帶(引物和模板不完全配對)。為了減少非特異條帶的產(chǎn)生，以下措施中有效的是()A．增加模板DNA的量B．延長熱變性的時間C．延長延伸的時間D．提高復性的溫度答案D解析增加模板DNA的量可以提高反應速度，但不能有效減少非特異性條帶的產(chǎn)生，A錯誤；延長熱變性的時間和延長延伸的時間會影響變性延伸過程，但對于延伸中的配對影響不大，故不能有效減少產(chǎn)生非特異性條帶，B、C錯誤；非特異性條帶增加的原因可能是復性溫度過低而造成引物與模板的錯配，故可通過提高復性的溫度來減少非特異性條帶的產(chǎn)生，D正確。3．下列有關電泳的敘述，不正確的是()A．電泳是指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程B．待測樣品中DNA分子的大小和構象、凝膠的濃度等都會影響DNA在電泳中的遷移速率C．進行電泳時，帶電分子會向著與其所帶電荷相同的電極移動D．PCR的產(chǎn)物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定答案C解析由于同性相斥、異性相吸，帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動，C錯誤。4．為優(yōu)化目的基因(700bp)的PCR條件，研究者設計不同的復性溫度進行實驗，產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結果如圖所示。據(jù)圖分析，下列有關說法錯誤的是()A．對照組可用無菌蒸餾水代替模板，其他成分相同B．電泳條帶的寬度、亮度與擴增產(chǎn)物大小呈正相關C．復性溫度的高低會影響PCR擴增產(chǎn)物的純度D．58℃是本實驗中擴增該基因的最佳復性溫度答案B解析實驗設計應遵循對照原則與單一變量原則，故對照組可用無菌蒸餾水代替模板，其他成分相同，A正確；PCR技術中，反應最終的電泳條帶的寬度、亮度與PCR起始狀態(tài)的模板DNA(或者模板)含量呈正相關，B錯誤；據(jù)圖可知，58℃條件下條帶寬度最大，故該溫度是本實驗中擴增該基因的最佳復性溫度，D正確。5．(多選)(2023·揚州高二期末)在基因工程操作中，科研人員利用兩種限制酶(R1和R2)處理基因載體，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖所示。下列相關敘述正確的是()A．電泳時，核酸的移動方向是從正極到負極的B．該載體最可能為環(huán)狀DNA分子C．限制酶R1與R2的切點最長相距約600bpD．兩種限制酶在載體上識別的序列可能相同答案BC解析根據(jù)圖示可知，200bp的DNA分子量小，800bp的DNA分子量較大，200bp的DNA移動速度快，所以在電泳時，核酸的移動方向是從負極到正極的，A錯誤；當僅用一種限制酶切割載體時，僅產(chǎn)生一種長度的DNA片段，因此該載體最有可能為環(huán)狀DNA分子，B正確；兩種限制酶同時切割時產(chǎn)生600bp和200bp兩種長度的DNA片段，所以兩種限制酶的切點最長相距約600bp，C正確；當僅用一種限制酶切割載體時，兩種限制酶切割產(chǎn)生的DNA片段等長，而兩種限制酶同時切割時則產(chǎn)生兩種不同長度的DNA片段，所以兩種限制酶在載體上各有一個酶切位點，二者識別的序列不相同，D錯誤。6．(2023·江蘇，22節(jié)選)為了將某納米抗體和綠色熒光蛋白基因融合表達，運用重組酶技術構建質粒，如圖1所示。請回答下列問題：(1)分別進行PCR擴增片段F1與片段F2時，配制的兩個反應體系中不同的有______________，擴增程序中最主要的不同是________________。(2)將PCR產(chǎn)物片段與線性質粒載體混合后，在重組酶作用下可形成環(huán)化質粒，直接用于轉化細菌。這一過程與傳統(tǒng)重組質粒構建過程相比，不需要使用的酶主要有________________。(3)為了驗證平板上菌落中的質粒是否符合設計，用不同菌落的質粒為模板、用引物F1－F和F2－R進行了PCR擴增，質粒P1～P4的擴增產(chǎn)物電泳結果如圖2。根據(jù)圖中結果判斷，可以舍棄的質粒有________。(4)對于PCR產(chǎn)物電泳結果符合預期的質粒，通常需進一步通過基因測序確認，原因是______________________________________________________________________________。答案(1)模板、引物引物的設計(2)限制酶、DNA連接酶(3)P3、P4(4)電泳只能測大小(長度)，不知道具體序列解析(1)PCR反應進行的條件：引物、耐高溫的DNA聚合酶、4種脫氧核苷酸、模板和緩沖液(其中需要Mg2＋)。分別進行PCR擴增片段F1與片段F2時，配制的兩個反應體系中不同的有模板(片段F1、片段F2)、引物。PCR過程需要兩種引物，能分別與目的基因兩條鏈的3′端通過堿基互補配對結合。引物設計是決定PCR反應成敗的最重要因素，因此擴增程序中最主要的不同是引物的設計。(2)傳統(tǒng)重組質粒構建需要使用限制酶切割質粒使其具有與目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA連接酶將目的基因和質粒連接成重組質粒。將PCR產(chǎn)物片段與線性質粒載體混合后，在重組酶的作用下可形成環(huán)化質粒，不需要使用限制酶和DNA連接酶。(3)EGFP為72