飲用菊花脫毒原種苗繁育技術(shù)規(guī)程

1DBXX/XXXXX—XXXX飲用菊花脫毒原種苗繁育技術(shù)規(guī)程本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了飲用菊花（Chrysanthemummorifolium(Ramat.)TzveL.）脫毒原種苗的繁育技術(shù)要求和規(guī)程。本標(biāo)準(zhǔn)適用于常見飲用菊花脫毒原種苗的生產(chǎn)。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19165-2003日光溫室和塑料大棚結(jié)構(gòu)與性能要求GB/T8321（所有部分）農(nóng)藥合理使用準(zhǔn)則NY/T1224-2006農(nóng)用塑料薄膜安全使用控制技術(shù)規(guī)范NY/T391-2021綠色食品產(chǎn)地環(huán)境質(zhì)量NY/T496-2021肥料合理使用準(zhǔn)則通則NY/T1657-2008花卉脫毒種苗生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程NY/T1591-2008菊花切花種苗等級規(guī)格NY/T5121-2002無公害食品飲用菊花生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程NY/T525-2021有機肥料3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1飲用菊花脫毒種苗（Drinkchrysanthemumvirus-freeseedlings）指經(jīng)RT-PCR檢測方法鑒定，確認(rèn)脫除了菊花B病毒（CVB）、番茄不孕病毒（TAV）、黃瓜花葉病毒（CMV）等的脫毒核心材料（或脫毒苗）在隔離條件下生產(chǎn)的原原種苗、原種苗。2DBXX/XXXXX—XXXX3.2原原種苗（breederseed）指經(jīng)組織培養(yǎng)過程直接獲得的種苗。3.3原種苗（foundationseed）是指原原種苗繁殖的第一代苗。4一般性要求4.1產(chǎn)地環(huán)境產(chǎn)地環(huán)境符合NY/T391-2021的規(guī)定。4.2場地要求選擇排灌方便，地下水位較低，土層深厚、肥沃、疏松，3年內(nèi)未種過茄科作物，中性或微酸性土壤地塊種植。4.3化學(xué)農(nóng)藥使用應(yīng)符合GB/T8321（所有部分）的要求。4.4肥料要求應(yīng)符合NY/T496-2021和NY/T525-2021的要求。5網(wǎng)室建造與隔離一般宜南北向建造，鋼架結(jié)構(gòu)，大棚單體大棚寬8m，頂高不低于2.8m，連體棚可2～3聯(lián)體，棚寬8m為宜，大棚肩高不低于1.5m，連體大棚宜在中間拱頂上分布避雨天窗散熱。大棚長度可依據(jù)地形確定，最長不超過50m。大棚所有通風(fēng)處安裝60目防蟲網(wǎng)。大棚搭建應(yīng)符合GB19165-2003要求，大棚覆蓋薄膜應(yīng)符合NY/T1224-2006要求。大棚入口處宜配套緩沖間，田間操作人員進(jìn)入防蟲溫、網(wǎng)室應(yīng)更換工作衣和鞋具。6原種苗生產(chǎn)6.1原原種苗生產(chǎn)6.1.1材料和培養(yǎng)基準(zhǔn)備選具有繁育品種典型性狀、生長健壯的植株，至光照培養(yǎng)箱中采用變溫升溫的方式進(jìn)行熱處理，在日溫/夜溫分別為26℃/20℃下培養(yǎng)2d后，而后每2d晝/夜溫度分別升高2℃,直至38℃/30℃,該溫度下培養(yǎng)40d，取高溫培養(yǎng)長出的莖段，剪去葉片，留取心葉或腋芽，放在燒杯中，用肥皂水沖洗干凈，再用自來水沖洗1h。濾干，移入無菌操作臺，用20%的次氯酸鈉滅菌8min～10min，取出后用無菌水沖洗3～5次，待用。將制備好的MS+6-BA0.1mg/L培養(yǎng)基溶液分裝于培養(yǎng)瓶，每瓶30ml，瓶口蓋緊瓶蓋。在121℃,1.1MPa條件下滅菌20min，冷卻后放入無菌操作臺待用。3DBXX/XXXXX—XXXX6.1.2分化和繼代培養(yǎng)在無菌條件下，在解剖鏡下剝?nèi)∫褱缇牧系纳L點0.3mm～0.5mm，接種到已滅菌的培養(yǎng)基上，置于26℃,光強2000lx～3000lx，光照時間16h/d條件下培養(yǎng)，一周左右莖尖轉(zhuǎn)綠并萌動，20d～30d形成帶芽莖段。在無菌條件下將已分化的帶芽莖段剪成小段，每段帶1～2個腋芽，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基（MS+6-BA0.1mg/L）中進(jìn)行增殖，3～4周后獲30～40個帶腋芽芽段。6.1.3病毒檢測取繼代培養(yǎng)壯芽或葉片提取RNA，經(jīng)RT-PCR檢測方法鑒定，如沒有病毒則繼續(xù)培養(yǎng)，脫毒不徹底則棄之不用。具體操作見附錄A。6.1.4生根培養(yǎng)及煉苗移栽6.1.4.1生根培養(yǎng)將繼代培養(yǎng)的莖段轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基（MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.1mg/L）誘導(dǎo)生根，培養(yǎng)溫度25℃~6.1.4.2煉苗移栽瓶苗株高6cm～7cm，5～6片平展葉，生根5條以上3cm～4cm長的根時即可煉苗，幼苗煉苗1d~2d后，定植在營養(yǎng)缽或苗床，于具60目防蟲網(wǎng)的防蟲網(wǎng)室或防蟲溫室內(nèi)進(jìn)行培育。6.1.4.3移栽管理原原種苗采用9cm×9cm營養(yǎng)缽或苗床移栽，珍珠巖+蛭石+泥炭按體積比1︰1︰1的比例混質(zhì)，移栽前用廣譜保護(hù)性殺菌劑噴灑消毒。移栽后澆透定根水，以后保持基質(zhì)70%的持水量，空氣濕度保持在80%～90%。太陽光強時要注意采用遮陽網(wǎng)遮蔭。當(dāng)植株發(fā)新葉后，逐步恢復(fù)自然光照，并進(jìn)行葉面施肥。氣溫不足時采取小拱棚膜和大棚相結(jié)合的雙膜覆蓋方式。白天保持25℃~26℃,夜間18℃~20℃。成活后白天保持25℃~27℃,夜間16℃~18℃,注意控水降溫，防止幼苗徒長。移栽前一周注意揭膜通風(fēng)煉苗。6.2脫毒原原種苗的性狀觀察隨機抽取每個無性系脫毒苗5～10株，以其母株為對照一起種植至開花。觀察比較其主要生物性狀，與母株無差異者則可確認(rèn)為原原種苗，有差異則淘汰整個無性系。6.3原種苗網(wǎng)室中繁殖4DBXX/XXXXX—XXXX6.3.1原種繁育田環(huán)境原種繁育田要求育苗環(huán)境除應(yīng)符合NY/T391-2021的規(guī)定外，要選擇排灌方便、地下水位較低，地勢高燥，土層深厚、肥沃、疏松，陽光充足，通風(fēng)條件好，3年內(nèi)未種過茄科植物，5年內(nèi)未種過菊科植物的中性或微酸性土壤地塊，且周圍800m范圍內(nèi)無其它菊科和茄科植物種植。6.3.2苗床整理、消毒育苗地于冬前深耕曬垡，每667m2施入完全腐熟的農(nóng)家肥500kg，扦插前一周左右平整土地，清除雜草，畦面做到平、細(xì)、碎。育苗畦高25cm～30cm，畦面寬100cm，畦間距40cm。苗床四周開寬50cm的深溝，便于排水。苗床消毒每平方米用70%甲基托布津可濕性粉劑8g兌水1000倍，菌線威0.3g～0.5g兌水3500~7000倍，均勻噴灑畦面上預(yù)防雜菌和根結(jié)線蟲病。再用茶枯餅0.03kg驅(qū)趕地下害蟲。在整平的畦面上均勻鋪上5cm～10cm厚的河沙。6.3.3定植、剪頂、腋芽扦插原種苗母株定植行株距應(yīng)為45cm×45cm，便于除草和施基肥。從煉苗移栽成活的原原種苗上取健壯枝條扦插于苗床上，于網(wǎng)室中擴繁。當(dāng)原種苗母株長到7～8片葉時，從基部留3～4片葉處剪下頂芽進(jìn)行扦插。6.3.4原種苗越冬和田間管理在原種基地擴繁種苗需周年進(jìn)行，當(dāng)溫度低于0℃時，需要搭小拱棚，蓋上薄膜保溫。當(dāng)母株苗越冬后，要及時掀開薄膜，中耕除草，松土保墑。苗高7cm～8cm時，要開溝施1次復(fù)合肥。施用肥料應(yīng)符合NY/T496-2021和NY525-2021規(guī)定。具體田間管理參照NY/T1657-2008和NY/T5121-2002操作，經(jīng)過一年生產(chǎn)和集中繁育，繁育出健壯原種苗。6.4脫毒原種苗質(zhì)量檢測脫毒原種苗質(zhì)量檢測參照NY/T1591-2008中5.1.3進(jìn)行抽樣檢查，并按照NY/T1591-2008中5.2的內(nèi)容進(jìn)行檢測，確定種苗的質(zhì)量等級。5DBXX/XXXXX—XXXX附錄A（規(guī)范性附錄）RNA病毒的反轉(zhuǎn)錄——聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測方法A.1主要儀器設(shè)備與試劑、耗材表1各步驟主要儀器設(shè)備與試劑、耗材步驟/類別主要儀器設(shè)備主要試劑盒與試劑（試劑均使用分析純試劑）主要耗材RNA提取高壓滅菌鍋、電子天平、高速冷凍離心機、微量移液器、微量核酸測定儀RNA提取試劑盒：TaKaRaMiniBESTPlantRNAExtractionKit試劑：無水乙醇、液氮無RNA酶的離心管移液器配套槍頭、配套槍頭盒、研缽、研棒、PE手套、乳膠手套第一鏈水浴鍋、制冰機、PCR擴增反轉(zhuǎn)錄試劑盒：PrimeScript?II1st無RNA酶PCR管cDNA合成儀器StrandcDNASynthesisKit和槍頭、乳膠手套PCR擴增PCR擴增儀器、制冰機PremixTaq?(TaKaRaTaq?Version2.0plusdye)、引物、礦物油無RNA酶PCR管和槍頭、乳膠手套凝膠電泳電子天平、微波爐、電泳儀、水平電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)瓊脂糖、1×TAE緩沖液、DNAMarker三角瓶、量筒、制膠板、梳子、乳膠手套A.2操作步驟A.2.1菊花總RNA的提取RNA提取按照試劑盒（TaKaRaMiniBESTPlantRNAExtractionKit）Protocol-II的說明書進(jìn)行。用1.0%的瓊脂糖凝膠對總RNA提取結(jié)果進(jìn)行電泳檢測，利用微量核酸測定儀檢測RNA濃度，測量A260與A280值。6DBXX/XXXXX—XXXXA.2.2第一鏈cDNA合成按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript?II1stStrandcDNASynthesisKit）說明書進(jìn)行。A.2.3PCR擴增及電泳（1）PCR反應(yīng)體系PCR反應(yīng)體系：總體積10μL，其中0.4μL上游引物（10mM0.4μL下游引物（10mM5μLPremixTaq(TaKaRaTaq?Version2.0plusdye)（0.05U/μl1μLcDNA模板（20ng/μL3.2μLddH2O。（2）PCR反應(yīng)程序PCR反應(yīng)程序：1）94℃預(yù)變性4min；2）94℃變性45s；3）按表A.4推薦的引物退火溫度退火45s；4）72℃延伸45s；5）重復(fù)步驟24共35個循環(huán)；6）72℃延伸7min；7）4℃保存。（3）PCR擴增產(chǎn)物電泳檢測配制1.0%瓊脂糖凝膠，放入電泳槽中，電泳液浸沒膠面1mm。樣品沿著膠孔邊緣勻速加入。接通電源，選擇合適的電壓和時間電泳。電泳結(jié)束后，膠塊置于紫外成像系統(tǒng)中，調(diào)整拍攝范圍和焦距，拍攝成像。A.3結(jié)果判斷RT-PCR檢測時，設(shè)定陽性和陰性對照，當(dāng)陽性對照有目標(biāo)帶出現(xiàn)，陰性對照無帶時，檢測的結(jié)果為有效。檢測樣品有與陽性對照相同的目標(biāo)帶出現(xiàn)時為陽性，無目標(biāo)帶為陰性。表2菊花病毒的特異性引物病毒名稱引物序列（5’-3’）退火溫度產(chǎn)物（bp）菊花B病毒（CVB）P1:ACCGAATTCTTAGTCACAATGCCTCCCP2:TCCGAGCTCATAGAGACGGCATACCGG55℃650番茄不孕病毒（TAV）P1:CCATCCCTTC