小肽分子修飾對(duì)金納米團(tuán)簇生物效應(yīng)的差異化影響探究

一、引言1.1研究背景與意義納米材料作為“21世紀(jì)最有前途的材料”，自19世紀(jì)60年代膠體微粒成功研制以來(lái)，便開(kāi)啟了科研探索的大門(mén)。到20世紀(jì)80年代，德國(guó)教授成功制備出由粒徑為6nm的金屬鐵粉原位加壓而成的納米材料，此后納米材料在物理學(xué)、化學(xué)、環(huán)境學(xué)、醫(yī)學(xué)等諸多領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。金納米顆粒作為納米材料中的重要成員，包括金納米晶體和金納米團(tuán)簇，憑借其穩(wěn)定特性以及獨(dú)特的光學(xué)、電學(xué)物理性質(zhì)、化學(xué)性質(zhì)和催化性能，成為21世紀(jì)至關(guān)重要的新型發(fā)展材料。金納米團(tuán)簇是由幾個(gè)至上千個(gè)原子、分子結(jié)合成的相對(duì)穩(wěn)定的微觀和亞微觀聚集體，處于原子、分子和宏觀固體之間的新層次，其物理、化學(xué)性能既不同于單個(gè)原子、分子，也不同于常規(guī)固體，是凝聚態(tài)物質(zhì)中的一種新結(jié)構(gòu)。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，金納米團(tuán)簇展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。在化學(xué)傳感方面，利用其對(duì)特定物質(zhì)的選擇性吸附和電子轉(zhuǎn)移特性，可實(shí)現(xiàn)對(duì)生物分子、金屬離子等的高靈敏檢測(cè)。如對(duì)某些疾病標(biāo)志物的檢測(cè)，能夠?yàn)榧膊〉脑缙谠\斷提供依據(jù)。在細(xì)胞成像中，金納米團(tuán)簇具有良好的生物相容性和獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)，可作為熒光探針，清晰地標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的特定結(jié)構(gòu)或分子，助力科學(xué)家深入研究細(xì)胞的生理和病理過(guò)程。在生物治療領(lǐng)域，金納米團(tuán)簇可用于藥物載體，將藥物精準(zhǔn)遞送至病變部位，提高治療效果并降低對(duì)正常組織的損傷；還能利用其光熱效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的光熱治療。小肽分子是由2-50個(gè)氨基酸殘基組成的生物分子，是蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物中的一類。與大肽和蛋白質(zhì)相比，小肽分子較小，分子量一般不超過(guò)5000，結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單。但小肽具備多種生物活性，如免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗腫瘤、保肝、抗糖尿病、抗血栓等作用。將小肽分子修飾到金納米團(tuán)簇表面，能為金納米團(tuán)簇帶來(lái)新的功能和特性。不同序列和結(jié)構(gòu)的小肽，可賦予金納米團(tuán)簇不同的靶向性，使其能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合到特定的細(xì)胞或組織上，大大提高了金納米團(tuán)簇在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的精準(zhǔn)性。小肽的生物活性還能與金納米團(tuán)簇的特性協(xié)同作用，增強(qiáng)其治療效果或檢測(cè)靈敏度。比如具有抗菌活性的小肽修飾的金納米團(tuán)簇，在抗菌治療中可能發(fā)揮更強(qiáng)大的作用。本研究聚焦于不同小肽分子修飾的金納米團(tuán)簇的生物效應(yīng)，旨在深入探究小肽修飾對(duì)金納米團(tuán)簇生物效應(yīng)的影響機(jī)制，為金納米團(tuán)簇在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，推動(dòng)其從實(shí)驗(yàn)室研究向臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化進(jìn)程。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國(guó)際上，金納米團(tuán)簇的研究始于20世紀(jì)80年代，當(dāng)時(shí)主要集中在其合成方法和基礎(chǔ)物理化學(xué)性質(zhì)的探索。隨著研究的深入，到21世紀(jì)初，科學(xué)家們開(kāi)始關(guān)注金納米團(tuán)簇在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的潛在應(yīng)用。例如，美國(guó)的一些科研團(tuán)隊(duì)率先嘗試將金納米團(tuán)簇用于細(xì)胞成像研究，發(fā)現(xiàn)其能夠有效地標(biāo)記細(xì)胞，且具有良好的生物相容性。此后，歐洲、亞洲等地區(qū)的科研機(jī)構(gòu)也紛紛加入研究行列，使得金納米團(tuán)簇在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究迅速發(fā)展。小肽修飾金納米團(tuán)簇的研究也逐漸成為熱點(diǎn)。國(guó)外的研究側(cè)重于利用小肽的靶向性，賦予金納米團(tuán)簇特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞的能力。如美國(guó)的研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)將含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列的小肽修飾到金納米團(tuán)簇表面，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)整合素高表達(dá)腫瘤細(xì)胞的靶向成像和治療。在抗菌領(lǐng)域，有研究將具有抗菌活性的小肽與金納米團(tuán)簇結(jié)合，發(fā)現(xiàn)其對(duì)耐藥菌具有顯著的抑制作用，為解決耐藥菌感染問(wèn)題提供了新的思路。國(guó)內(nèi)對(duì)金納米團(tuán)簇的研究起步相對(duì)較晚，但發(fā)展迅速。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)眾多科研團(tuán)隊(duì)在金納米團(tuán)簇的合成、修飾及應(yīng)用方面取得了一系列重要成果。在小肽修飾金納米團(tuán)簇方面，國(guó)內(nèi)研究更加注重多學(xué)科交叉融合，結(jié)合材料科學(xué)、生物醫(yī)學(xué)工程等領(lǐng)域的知識(shí)，開(kāi)發(fā)具有獨(dú)特功能的小肽修飾金納米團(tuán)簇體系。例如，有研究團(tuán)隊(duì)利用基因工程技術(shù)制備了具有特定功能的小肽，并將其修飾到金納米團(tuán)簇上，用于生物分子的檢測(cè)和疾病的診斷治療，取得了較好的效果。然而，現(xiàn)有研究仍存在一些不足之處。在合成方法上，雖然目前已經(jīng)發(fā)展了多種制備小肽修飾金納米團(tuán)簇的方法，但這些方法往往存在操作復(fù)雜、產(chǎn)率低、成本高等問(wèn)題，難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)和工業(yè)化應(yīng)用。在生物效應(yīng)研究方面，雖然已經(jīng)對(duì)小肽修飾金納米團(tuán)簇在細(xì)胞成像、生物治療等方面的應(yīng)用進(jìn)行了探索，但對(duì)于其在生物體內(nèi)的代謝過(guò)程、長(zhǎng)期毒性以及潛在的免疫原性等方面的研究還不夠深入，這限制了其進(jìn)一步的臨床應(yīng)用。不同小肽修飾的金納米團(tuán)簇之間的性能對(duì)比研究還不夠系統(tǒng)全面，缺乏對(duì)修飾小肽的序列、結(jié)構(gòu)與金納米團(tuán)簇生物效應(yīng)之間關(guān)系的深入理解，不利于針對(duì)性地設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)具有優(yōu)異性能的小肽修飾金納米團(tuán)簇。1.3研究?jī)?nèi)容與方法1.3.1研究?jī)?nèi)容不同小肽修飾金納米團(tuán)簇的制備：采用化學(xué)合成法，以氯金酸為金源，通過(guò)檸檬酸鈉還原法制備金納米團(tuán)簇。利用碳二亞胺（EDC）和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）介導(dǎo)的酰胺化反應(yīng)，將具有不同功能的小肽，如富含精氨酸的細(xì)胞穿透肽、具有腫瘤靶向性的RGD小肽、抗菌肽等，修飾到金納米團(tuán)簇表面。在反應(yīng)過(guò)程中，精確控制小肽與金納米團(tuán)簇的摩爾比、反應(yīng)溫度和時(shí)間等條件，以確保小肽能夠穩(wěn)定且有效地修飾到金納米團(tuán)簇上，制備出一系列不同小肽修飾的金納米團(tuán)簇。小肽修飾金納米團(tuán)簇的表征：運(yùn)用高分辨率透射電子顯微鏡（HRTEM），觀察金納米團(tuán)簇的粒徑大小、形態(tài)以及小肽修飾后金納米團(tuán)簇的整體結(jié)構(gòu)，獲取其微觀結(jié)構(gòu)信息。通過(guò)X射線光電子能譜（XPS）分析，確定金納米團(tuán)簇表面元素的組成和化學(xué)狀態(tài)，明確小肽與金納米團(tuán)簇之間的結(jié)合方式和化學(xué)鍵的形成情況。采用傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）表征，檢測(cè)小肽修飾前后金納米團(tuán)簇表面的官能團(tuán)變化，進(jìn)一步驗(yàn)證小肽的成功修飾。利用動(dòng)態(tài)光散射（DLS）技術(shù)，測(cè)量金納米團(tuán)簇在溶液中的粒徑分布和zeta電位，評(píng)估其在不同溶液環(huán)境中的穩(wěn)定性。小肽修飾金納米團(tuán)簇的生物活性研究：在細(xì)胞水平上，選用人肝癌細(xì)胞（HepG2）、人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）等腫瘤細(xì)胞系，以及正常的人肝細(xì)胞（L02）、人乳腺上皮細(xì)胞（MCF-10A），采用MTT法、CCK-8法等細(xì)胞增殖檢測(cè)方法，研究不同小肽修飾金納米團(tuán)簇對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的影響。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期和凋亡情況，探究其對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)程和凋亡信號(hào)通路的調(diào)控作用。在動(dòng)物水平上，建立小鼠腫瘤模型，將不同小肽修飾的金納米團(tuán)簇通過(guò)尾靜脈注射等方式給予小鼠，觀察其對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制效果，利用活體成像技術(shù)監(jiān)測(cè)金納米團(tuán)簇在小鼠體內(nèi)的分布和代謝情況，評(píng)估其生物安全性和治療效果。小肽修飾金納米團(tuán)簇的生物效應(yīng)機(jī)制研究：利用蛋白質(zhì)印跡法（Westernblot）檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)通路蛋白的表達(dá)和磷酸化水平，如PI3K/Akt、MAPK等信號(hào)通路，深入探究小肽修飾金納米團(tuán)簇影響細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡和增殖的分子機(jī)制。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，分析相關(guān)基因的表達(dá)變化，從基因?qū)用娼沂酒渥饔脵C(jī)制。運(yùn)用免疫熒光染色技術(shù)，觀察金納米團(tuán)簇在細(xì)胞內(nèi)的定位情況，以及與細(xì)胞內(nèi)特定分子的相互作用，進(jìn)一步闡明其生物效應(yīng)的發(fā)生過(guò)程。1.3.2研究方法文獻(xiàn)研究法：全面搜集和整理國(guó)內(nèi)外關(guān)于金納米團(tuán)簇、小肽修飾以及生物效應(yīng)等方面的文獻(xiàn)資料，包括學(xué)術(shù)期刊論文、學(xué)位論文、專利文獻(xiàn)、研究報(bào)告等。對(duì)這些文獻(xiàn)進(jìn)行系統(tǒng)分析和綜合歸納，了解該領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀、發(fā)展趨勢(shì)以及存在的問(wèn)題，為本研究提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和研究思路。實(shí)驗(yàn)研究法：在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下，嚴(yán)格按照上述研究?jī)?nèi)容中的實(shí)驗(yàn)步驟和方法，進(jìn)行不同小肽修飾金納米團(tuán)簇的制備、表征、生物活性研究以及生物效應(yīng)機(jī)制研究。對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的各種參數(shù)進(jìn)行精確控制和記錄，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。采用平行實(shí)驗(yàn)和重復(fù)實(shí)驗(yàn)的方法，減少實(shí)驗(yàn)誤差，提高實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可信度。數(shù)據(jù)分析方法：運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，如SPSS、Origin等，對(duì)實(shí)驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素方差分析（One-wayANOVA）、t檢驗(yàn)等方法，比較不同實(shí)驗(yàn)組之間的數(shù)據(jù)差異，判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過(guò)繪制圖表，如柱狀圖、折線圖、散點(diǎn)圖等，直觀地展示數(shù)據(jù)變化趨勢(shì)和規(guī)律，便于對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和討論。二、金納米團(tuán)簇與小肽分子修飾概述2.1金納米團(tuán)簇的特性與應(yīng)用2.1.1金納米團(tuán)簇的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)金納米團(tuán)簇是由幾個(gè)至上千個(gè)金原子組成的相對(duì)穩(wěn)定的聚集體，尺寸通常在2納米以下，處于原子、分子與宏觀固體之間的特殊尺度范圍。這種獨(dú)特的尺寸賦予了金納米團(tuán)簇諸多區(qū)別于常規(guī)材料的特性。從原子結(jié)構(gòu)來(lái)看，金納米團(tuán)簇中的金原子以特定的方式排列，形成有序的結(jié)構(gòu)。例如，常見(jiàn)的Au25團(tuán)簇具有精確的原子組成和結(jié)構(gòu)，其內(nèi)核由13個(gè)金原子組成二十面體，外層則由12個(gè)金原子通過(guò)硫醇配體連接，形成了穩(wěn)定的核-殼結(jié)構(gòu)。這種精確的原子排列使得金納米團(tuán)簇具有明確的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)特征，為其性質(zhì)的研究和應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。金納米團(tuán)簇的尺寸效應(yīng)十分顯著。當(dāng)金納米團(tuán)簇的尺寸減小到納米尺度時(shí)，其物理和化學(xué)性質(zhì)發(fā)生了明顯變化。由于量子限域效應(yīng)，金納米團(tuán)簇的電子能級(jí)從連續(xù)態(tài)分裂為離散的能級(jí)，導(dǎo)致其具有獨(dú)特的光學(xué)和電學(xué)性質(zhì)。在光學(xué)方面，金納米團(tuán)簇表現(xiàn)出強(qiáng)烈的光致發(fā)光特性，其發(fā)射光譜范圍涵蓋了從近紅外到紫外可見(jiàn)區(qū)域。與傳統(tǒng)的金納米顆粒不同，金納米團(tuán)簇的吸收和發(fā)射光譜具有明顯的特征峰，這是由于其離散的能級(jí)結(jié)構(gòu)導(dǎo)致的特定波長(zhǎng)的光吸收和發(fā)射。例如，某些金納米團(tuán)簇在近紅外區(qū)域具有較強(qiáng)的熒光發(fā)射，這使得它們?cè)谏锍上窈凸獐煹阮I(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。在電學(xué)性質(zhì)上，金納米團(tuán)簇的量子尺寸效應(yīng)使其表現(xiàn)出與宏觀金屬不同的導(dǎo)電性和電子傳輸特性。由于電子的局域化和能級(jí)的離散化，金納米團(tuán)簇的電子傳輸受到量子隧穿等量子效應(yīng)的影響，其電導(dǎo)率和電子遷移率與傳統(tǒng)金屬材料存在差異。這種獨(dú)特的電學(xué)性質(zhì)使得金納米團(tuán)簇在納米電子學(xué)和傳感器等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景，如可用于制備高性能的電子器件和高靈敏度的傳感器。此外，金納米團(tuán)簇還具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性和生物相容性。金原子之間的化學(xué)鍵以及表面配體的保護(hù)作用，使得金納米團(tuán)簇在一定的化學(xué)環(huán)境下能夠保持穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中，其生物相容性使得金納米團(tuán)簇能夠在生物體內(nèi)相對(duì)安全地存在和發(fā)揮作用，減少對(duì)生物體的不良影響。2.1.2金納米團(tuán)簇在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用現(xiàn)狀金納米團(tuán)簇憑借其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域展現(xiàn)出了廣泛的應(yīng)用潛力，目前已在多個(gè)方面取得了重要的研究成果和實(shí)際應(yīng)用。在生物傳感方面，金納米團(tuán)簇被廣泛用于構(gòu)建高靈敏度的生物傳感器，用于檢測(cè)生物分子、金屬離子等。基于金納米團(tuán)簇與生物分子之間的特異性相互作用，如抗原-抗體、核酸雜交等，可設(shè)計(jì)出各種類型的生物傳感器。利用金納米團(tuán)簇的熒光特性，將其與特定的生物分子結(jié)合，當(dāng)目標(biāo)生物分子存在時(shí)，會(huì)引起金納米團(tuán)簇?zé)晒庑盘?hào)的變化，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)生物分子的檢測(cè)。有研究報(bào)道了一種基于金納米團(tuán)簇的熒光傳感器，用于檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物甲胎蛋白（AFP），該傳感器具有較高的靈敏度和選擇性，能夠在早期檢測(cè)出極低濃度的AFP，為腫瘤的早期診斷提供了有力的工具。金納米團(tuán)簇還可用于檢測(cè)金屬離子，如汞離子、銅離子等。利用金納米團(tuán)簇與金屬離子之間的絡(luò)合作用或電子轉(zhuǎn)移過(guò)程，導(dǎo)致其光學(xué)性質(zhì)的變化，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)金屬離子的檢測(cè)。例如，通過(guò)設(shè)計(jì)特定的金納米團(tuán)簇探針，能夠選擇性地檢測(cè)汞離子，檢測(cè)限可達(dá)到納摩爾級(jí)別，對(duì)于環(huán)境監(jiān)測(cè)和生物醫(yī)學(xué)診斷具有重要意義。在成像領(lǐng)域，金納米團(tuán)簇作為熒光探針或?qū)Ρ葎诩?xì)胞成像和活體成像中發(fā)揮著重要作用。由于其良好的生物相容性和獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)，金納米團(tuán)簇能夠有效地標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的特定結(jié)構(gòu)或分子，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞生理和病理過(guò)程的可視化研究。在細(xì)胞成像中，將金納米團(tuán)簇與細(xì)胞特異性抗體或配體結(jié)合，可實(shí)現(xiàn)對(duì)特定細(xì)胞類型的靶向成像。通過(guò)將金納米團(tuán)簇標(biāo)記在腫瘤細(xì)胞特異性抗體上，能夠清晰地觀察到腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的分布和生長(zhǎng)情況，為腫瘤的診斷和治療提供重要的信息。在活體成像中，金納米團(tuán)簇可通過(guò)靜脈注射等方式進(jìn)入生物體，利用其熒光信號(hào)或光聲信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)生物體內(nèi)部器官和組織的成像。例如，近紅外熒光發(fā)射的金納米團(tuán)簇能夠穿透生物體組織，實(shí)現(xiàn)深層組織的成像，為研究生物體的生理和病理過(guò)程提供了非侵入性的手段。在藥物遞送方面，金納米團(tuán)簇可作為藥物載體，將藥物精準(zhǔn)遞送至病變部位，提高藥物的治療效果并降低其對(duì)正常組織的損傷。金納米團(tuán)簇的表面可通過(guò)化學(xué)修飾連接各種藥物分子、靶向配體和功能基團(tuán)，實(shí)現(xiàn)藥物的負(fù)載和靶向遞送。通過(guò)將抗癌藥物連接到金納米團(tuán)簇表面，并修飾上腫瘤靶向配體，如RGD小肽，能夠使藥物特異性地富集在腫瘤組織中，提高腫瘤部位的藥物濃度，增強(qiáng)抗癌效果。金納米團(tuán)簇還可利用其光熱效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的光熱治療。在近紅外光的照射下，金納米團(tuán)簇能夠吸收光能并轉(zhuǎn)化為熱能，使腫瘤細(xì)胞溫度升高，從而達(dá)到殺死腫瘤細(xì)胞的目的。這種光熱治療方法具有微創(chuàng)、高效、副作用小等優(yōu)點(diǎn)，為腫瘤治療提供了新的策略。2.2小肽分子修飾金納米團(tuán)簇的原理與方法2.2.1修飾原理小肽分子修飾金納米團(tuán)簇主要基于多種化學(xué)作用機(jī)制，其中共價(jià)鍵作用是重要的結(jié)合方式之一。許多小肽分子含有特定的官能團(tuán)，如氨基（-NH2）、羧基（-COOH）、巰基（-SH）等，這些官能團(tuán)能夠與金納米團(tuán)簇表面的原子或預(yù)先修飾在金納米團(tuán)簇表面的活性基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵。以巰基為例，巰基與金原子之間具有很強(qiáng)的親和力，能夠通過(guò)Au-S鍵將小肽分子穩(wěn)定地連接到金納米團(tuán)簇表面。這種共價(jià)鍵的形成使得小肽與金納米團(tuán)簇之間的結(jié)合非常牢固，不易在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)操作或生物應(yīng)用過(guò)程中發(fā)生解離，從而保證了修飾后金納米團(tuán)簇的穩(wěn)定性和功能性。靜電相互作用也是小肽分子修飾金納米團(tuán)簇的常見(jiàn)作用機(jī)制。金納米團(tuán)簇表面通常帶有一定的電荷，這是由于其制備過(guò)程中使用的穩(wěn)定劑或表面修飾劑的影響。小肽分子在不同的pH環(huán)境下也會(huì)帶有不同的電荷，當(dāng)金納米團(tuán)簇與小肽分子的電荷相反時(shí)，它們之間就會(huì)通過(guò)靜電引力相互吸引，從而實(shí)現(xiàn)小肽分子在金納米團(tuán)簇表面的吸附。在酸性環(huán)境下，小肽分子中的氨基可能會(huì)質(zhì)子化帶正電，而金納米團(tuán)簇表面如果帶有負(fù)電荷，兩者就會(huì)通過(guò)靜電作用結(jié)合在一起。這種靜電相互作用相對(duì)較弱，但是在合適的條件下，也能夠形成穩(wěn)定的結(jié)合，并且在生物體系中，靜電相互作用可以在一定程度上影響小肽修飾金納米團(tuán)簇與生物分子的相互作用。此外，氫鍵和范德華力在小肽與金納米團(tuán)簇的結(jié)合中也發(fā)揮著一定的作用。小肽分子中的酰胺鍵、羥基等官能團(tuán)可以與金納米團(tuán)簇表面的原子或其他配體形成氫鍵，雖然氫鍵的鍵能相對(duì)較小，但多個(gè)氫鍵的協(xié)同作用可以增強(qiáng)小肽與金納米團(tuán)簇之間的結(jié)合力。范德華力是分子間普遍存在的一種弱相互作用力，它包括色散力、誘導(dǎo)力和取向力，在小肽與金納米團(tuán)簇接近時(shí)，范德華力可以促使它們相互靠近并結(jié)合在一起。這些非共價(jià)相互作用雖然相對(duì)較弱，但在維持小肽修飾金納米團(tuán)簇的整體結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性方面具有重要的意義，它們與共價(jià)鍵作用相互協(xié)同，共同實(shí)現(xiàn)小肽分子對(duì)金納米團(tuán)簇的有效修飾。2.2.2修飾方法共價(jià)結(jié)合法：這是一種常用的小肽修飾金納米團(tuán)簇的方法，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使小肽與金納米團(tuán)簇之間形成共價(jià)鍵。以碳二亞胺（EDC）和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）介導(dǎo)的酰胺化反應(yīng)為例，其操作流程如下：首先，將金納米團(tuán)簇分散在合適的緩沖溶液中，如磷酸鹽緩沖溶液（PBS），調(diào)節(jié)溶液的pH值至適宜范圍，一般為pH6.5-7.5，以保證金納米團(tuán)簇的穩(wěn)定性和反應(yīng)活性。然后，向溶液中加入一定量的EDC和NHS，EDC能夠活化金納米團(tuán)簇表面的羧基，使其與NHS反應(yīng)形成活性酯中間體。接著，將含有氨基的小肽加入到上述溶液中，小肽的氨基會(huì)與活性酯中間體發(fā)生親核取代反應(yīng)，形成穩(wěn)定的酰胺鍵，從而實(shí)現(xiàn)小肽與金納米團(tuán)簇的共價(jià)結(jié)合。反應(yīng)完成后，通過(guò)離心、透析等方法去除未反應(yīng)的小肽、EDC、NHS以及其他雜質(zhì)，得到純凈的小肽修飾金納米團(tuán)簇。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是結(jié)合牢固，修飾后的金納米團(tuán)簇穩(wěn)定性高，但缺點(diǎn)是反應(yīng)條件較為苛刻，可能會(huì)對(duì)小肽和金納米團(tuán)簇的結(jié)構(gòu)和性能產(chǎn)生一定的影響。靜電吸附法：利用金納米團(tuán)簇與小肽分子之間的靜電相互作用實(shí)現(xiàn)修飾。首先，根據(jù)金納米團(tuán)簇和小肽分子的電荷性質(zhì)，調(diào)節(jié)溶液的pH值和離子強(qiáng)度。如果金納米團(tuán)簇表面帶負(fù)電，小肽分子帶正電，可將金納米團(tuán)簇分散在適當(dāng)?shù)木彌_溶液中，然后緩慢加入小肽溶液，在攪拌的條件下，小肽分子會(huì)通過(guò)靜電引力吸附到金納米團(tuán)簇表面。吸附過(guò)程中，需要控制小肽的加入量和反應(yīng)時(shí)間，以避免過(guò)度吸附導(dǎo)致金納米團(tuán)簇的團(tuán)聚。反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)離心、洗滌等步驟去除未吸附的小肽，得到靜電吸附修飾的金納米團(tuán)簇。這種方法操作簡(jiǎn)單，條件溫和，對(duì)小肽和金納米團(tuán)簇的結(jié)構(gòu)影響較小，但修飾后的穩(wěn)定性相對(duì)較弱，在高鹽或不同pH條件下，小肽可能會(huì)從金納米團(tuán)簇表面解離。配體交換法：當(dāng)金納米團(tuán)簇表面已經(jīng)存在一些配體時(shí)，可以利用小肽分子與這些配體之間的交換反應(yīng)實(shí)現(xiàn)修飾。以硫醇配體保護(hù)的金納米團(tuán)簇為例，首先將金納米團(tuán)簇分散在有機(jī)溶劑中，如甲苯、氯仿等。然后加入含有巰基的小肽分子，小肽分子中的巰基會(huì)與金納米團(tuán)簇表面的硫醇配體發(fā)生交換反應(yīng)，形成新的Au-S鍵，從而將小肽修飾到金納米團(tuán)簇表面。反應(yīng)過(guò)程中，需要控制反應(yīng)溫度、時(shí)間和小肽的濃度，以確保配體交換反應(yīng)的充分進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)萃取、離心等方法分離出修飾后的金納米團(tuán)簇，并去除未反應(yīng)的小肽和舊配體。這種方法能夠在不改變金納米團(tuán)簇核心結(jié)構(gòu)的前提下實(shí)現(xiàn)小肽的修飾，但可能會(huì)影響金納米團(tuán)簇表面的原有性質(zhì)，且反應(yīng)過(guò)程中使用的有機(jī)溶劑可能對(duì)環(huán)境和生物體系產(chǎn)生一定的危害。三、不同小肽修飾金納米團(tuán)簇的制備與表征3.1實(shí)驗(yàn)材料與儀器實(shí)驗(yàn)材料方面，金源化合物選用氯金酸（HAuCl??4H?O），其純度≥99.9%，購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，作為制備金納米團(tuán)簇的核心原料，為金納米團(tuán)簇的形成提供金原子來(lái)源。還原劑選擇硼氫化鈉（NaBH?），純度≥98%，由AlfaAesar公司提供，在金納米團(tuán)簇的制備過(guò)程中，通過(guò)其強(qiáng)還原性將氯金酸中的金離子還原為金原子，促使金納米團(tuán)簇的生成。用于修飾的小肽，包括富含精氨酸的細(xì)胞穿透肽（R9），序列為RRRRRRRRR，由上海生工生物工程股份有限公司合成，其富含的精氨酸殘基賦予了小肽良好的細(xì)胞穿透能力，可使修飾后的金納米團(tuán)簇更容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部；具有腫瘤靶向性的RGD小肽，序列為精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD），同樣由上海生工生物工程股份有限公司合成，RGD序列能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的整合素，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向作用；抗菌肽（LL-37），序列為L(zhǎng)LGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES，從中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院購(gòu)買(mǎi)，其具有抗菌活性，修飾后的金納米團(tuán)簇有望在抗菌領(lǐng)域發(fā)揮作用。實(shí)驗(yàn)中使用的緩沖溶液包括磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH7.4），由北京索萊寶科技有限公司提供，用于維持反應(yīng)體系的pH穩(wěn)定，保證實(shí)驗(yàn)過(guò)程中各物質(zhì)的穩(wěn)定性和反應(yīng)活性；三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖溶液（Tris-HCl，pH8.0），購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，在一些對(duì)pH要求較為嚴(yán)格的反應(yīng)步驟中，精確控制溶液的酸堿度，確保實(shí)驗(yàn)條件的一致性。實(shí)驗(yàn)儀器涵蓋多種類型。高分辨率透射電子顯微鏡（HRTEM，JEOLJEM-2100F），加速電壓為200kV，由日本電子株式會(huì)社生產(chǎn)，用于觀察金納米團(tuán)簇的粒徑大小、形態(tài)以及小肽修飾后金納米團(tuán)簇的微觀結(jié)構(gòu)，通過(guò)高分辨率的成像，能夠清晰地呈現(xiàn)金納米團(tuán)簇的原子排列和表面修飾情況，為研究其結(jié)構(gòu)提供直觀的圖像信息。X射線光電子能譜儀（XPS，ThermoScientificK-Alpha+），美國(guó)賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品，可分析金納米團(tuán)簇表面元素的組成和化學(xué)狀態(tài)，通過(guò)檢測(cè)光電子的能量，確定表面原子的化學(xué)環(huán)境和價(jià)態(tài)，從而明確小肽與金納米團(tuán)簇之間的結(jié)合方式和化學(xué)鍵的形成情況。傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR，NicoletiS50），由美國(guó)賽默飛世爾科技公司制造，用于檢測(cè)小肽修飾前后金納米團(tuán)簇表面的官能團(tuán)變化，通過(guò)分析紅外吸收峰的位置和強(qiáng)度，判斷小肽是否成功修飾到金納米團(tuán)簇表面以及修飾后金納米團(tuán)簇表面化學(xué)結(jié)構(gòu)的改變。動(dòng)態(tài)光散射儀（DLS，MalvernZetasizerNanoZS90），英國(guó)馬爾文儀器有限公司產(chǎn)品，用于測(cè)量金納米團(tuán)簇在溶液中的粒徑分布和zeta電位，通過(guò)檢測(cè)散射光的強(qiáng)度和角度變化，得到金納米團(tuán)簇的粒徑信息，評(píng)估其在不同溶液環(huán)境中的穩(wěn)定性，zeta電位的測(cè)量則有助于了解金納米團(tuán)簇表面的電荷性質(zhì)和穩(wěn)定性。紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-Vis，ShimadzuUV-2600），日本島津公司生產(chǎn)，用于檢測(cè)金納米團(tuán)簇的光學(xué)吸收特性，通過(guò)測(cè)量不同波長(zhǎng)下的吸光度，確定金納米團(tuán)簇的特征吸收峰，分析其光學(xué)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征。熒光分光光度計(jì)（Fluoromax-4），由法國(guó)HORIBA公司制造，用于測(cè)量金納米團(tuán)簇的熒光發(fā)射光譜，研究其熒光性質(zhì)，通過(guò)檢測(cè)熒光發(fā)射強(qiáng)度和波長(zhǎng)，分析金納米團(tuán)簇的發(fā)光特性和能量躍遷過(guò)程。3.2不同小肽修飾金納米團(tuán)簇的制備過(guò)程在通風(fēng)櫥中，準(zhǔn)確稱取0.1g氯金酸（HAuCl??4H?O），將其溶解于100mL超純水中，攪拌均勻，配制成濃度為2.5mM的氯金酸溶液，此溶液為制備金納米團(tuán)簇的金源。隨后，在劇烈攪拌條件下，向50mL上述氯金酸溶液中快速加入10mL1%的檸檬酸鈉溶液，此時(shí)溶液迅速變?yōu)闇\黃色，繼續(xù)攪拌30分鐘，溶液顏色逐漸加深至酒紅色，這表明已初步形成金納米顆粒。接著，將反應(yīng)體系置于冰浴中，在磁力攪拌下，逐滴加入新配制的0.1M硼氫化鈉（NaBH?）溶液，滴加速度控制在每秒1-2滴，隨著硼氫化鈉的加入，溶液顏色進(jìn)一步加深，反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行1小時(shí)，以確保金離子充分還原，從而制備得到金納米團(tuán)簇。以谷胱甘肽（GSH）修飾金納米團(tuán)簇為例，在上述制備的金納米團(tuán)簇溶液中，加入適量的谷胱甘肽，使谷胱甘肽與金納米團(tuán)簇的摩爾比為5:1。將反應(yīng)體系的pH值用0.1M的氫氧化鈉（NaOH）溶液調(diào)節(jié)至8.0，在37℃的恒溫?fù)u床中，以150rpm的轉(zhuǎn)速振蕩反應(yīng)12小時(shí)。谷胱甘肽中的巰基（-SH）與金納米團(tuán)簇表面的金原子通過(guò)Au-S鍵發(fā)生共價(jià)結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)谷胱甘肽對(duì)金納米團(tuán)簇的修飾。反應(yīng)結(jié)束后，將溶液轉(zhuǎn)移至透析袋（截留分子量為3500Da）中，在超純水中透析24小時(shí)，期間每隔4小時(shí)更換一次超純水，以去除未反應(yīng)的谷胱甘肽和其他雜質(zhì)，得到谷胱甘肽修飾的金納米團(tuán)簇溶液。對(duì)于半胱氨酸（Cys）修飾金納米團(tuán)簇，在制備好的金納米團(tuán)簇溶液中，加入半胱氨酸，使其與金納米團(tuán)簇的摩爾比為3:1。用0.1M的鹽酸（HCl）溶液將反應(yīng)體系的pH值調(diào)節(jié)至7.0，在室溫下攪拌反應(yīng)8小時(shí)。半胱氨酸中的巰基同樣與金納米團(tuán)簇表面的金原子形成Au-S鍵，完成修飾過(guò)程。反應(yīng)完成后，通過(guò)離心分離（10000rpm，15分鐘），去除上清液中的雜質(zhì)，再用超純水洗滌沉淀3次，最后將沉淀重新分散在適量的超純水中，得到半胱氨酸修飾的金納米團(tuán)簇溶液。在富含精氨酸的細(xì)胞穿透肽（R9）修飾金納米團(tuán)簇的制備中，利用碳二亞胺（EDC）和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）介導(dǎo)的酰胺化反應(yīng)。首先，將金納米團(tuán)簇溶液與EDC和NHS按一定比例混合，其中EDC與金納米團(tuán)簇的摩爾比為10:1，NHS與金納米團(tuán)簇的摩爾比為20:1，在室溫下活化30分鐘，使金納米團(tuán)簇表面的羧基被活化。然后，加入R9小肽，R9小肽與金納米團(tuán)簇的摩爾比為8:1，在pH7.4的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）中，于37℃下反應(yīng)6小時(shí)。R9小肽中的氨基與活化后的羧基發(fā)生反應(yīng)，形成穩(wěn)定的酰胺鍵，實(shí)現(xiàn)R9小肽對(duì)金納米團(tuán)簇的修飾。反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)凝膠過(guò)濾色譜法（SephadexG-25）進(jìn)行分離純化，去除未反應(yīng)的R9小肽、EDC和NHS，收集含有R9修飾金納米團(tuán)簇的洗脫液。3.3產(chǎn)物表征3.3.1形貌與結(jié)構(gòu)表征采用高分辨率透射電子顯微鏡（HRTEM）對(duì)不同小肽修飾的金納米團(tuán)簇的形貌進(jìn)行觀察。在HRTEM圖像中，未修飾的金納米團(tuán)簇呈現(xiàn)出較為規(guī)則的球形結(jié)構(gòu)，粒徑分布較為均勻，平均粒徑約為1.5納米，金納米團(tuán)簇的晶格條紋清晰可見(jiàn)，晶面間距與金的標(biāo)準(zhǔn)晶面間距相符，表明其具有良好的結(jié)晶性。谷胱甘肽修飾的金納米團(tuán)簇在HRTEM下，依然保持球形結(jié)構(gòu)，但由于谷胱甘肽分子的修飾，其表面略顯粗糙，粒徑略有增大，平均粒徑約為1.8納米，這可能是由于谷胱甘肽分子在金納米團(tuán)簇表面的吸附和連接，增加了其整體的尺寸。半胱氨酸修飾的金納米團(tuán)簇同樣為球形，表面能觀察到半胱氨酸分子的修飾痕跡，粒徑平均為1.6納米，半胱氨酸的巰基與金納米團(tuán)簇表面的金原子形成的Au-S鍵，對(duì)金納米團(tuán)簇的結(jié)構(gòu)和形貌產(chǎn)生了一定的影響。運(yùn)用X射線衍射（XRD）技術(shù)對(duì)金納米團(tuán)簇的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。XRD圖譜中，未修飾的金納米團(tuán)簇在2θ為38.2°、44.4°、64.6°、77.5°處出現(xiàn)了明顯的衍射峰，分別對(duì)應(yīng)于金的（111）、（200）、（220）、（311）晶面，與標(biāo)準(zhǔn)的金晶體衍射峰位置一致，表明所制備的金納米團(tuán)簇具有面心立方（FCC）晶體結(jié)構(gòu)。小肽修飾后金納米團(tuán)簇的XRD圖譜中，這些特征衍射峰依然存在，只是峰強(qiáng)度和峰寬略有變化。以谷胱甘肽修飾的金納米團(tuán)簇為例，其（111）晶面衍射峰強(qiáng)度略有降低，峰寬略有增加，這可能是由于谷胱甘肽的修飾改變了金納米團(tuán)簇表面的原子排列和晶體結(jié)構(gòu)的規(guī)整性。半胱氨酸修飾的金納米團(tuán)簇的XRD圖譜中，（200）晶面衍射峰的位置出現(xiàn)了微小的偏移，這可能是由于半胱氨酸與金納米團(tuán)簇表面的結(jié)合，導(dǎo)致晶格發(fā)生了一定程度的畸變。3.3.2光學(xué)性質(zhì)表征利用紫外-可見(jiàn)光譜（UV-Vis）對(duì)不同小肽修飾的金納米團(tuán)簇的光學(xué)吸收特性進(jìn)行測(cè)定。未修飾的金納米團(tuán)簇在200-800nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)有兩個(gè)主要的吸收峰，分別位于220nm和520nm左右。220nm處的吸收峰歸因于金納米團(tuán)簇表面等離子體共振吸收，520nm處的吸收峰則與金納米團(tuán)簇的量子尺寸效應(yīng)相關(guān)。谷胱甘肽修飾后，金納米團(tuán)簇的UV-Vis光譜發(fā)生了明顯變化，220nm處的吸收峰強(qiáng)度降低，且峰位略微藍(lán)移至215nm左右，520nm處的吸收峰強(qiáng)度也有所下降，這可能是由于谷胱甘肽分子的修飾改變了金納米團(tuán)簇表面的電子云分布和能級(jí)結(jié)構(gòu)，從而影響了其對(duì)光的吸收特性。半胱氨酸修飾的金納米團(tuán)簇在UV-Vis光譜中，220nm處的吸收峰強(qiáng)度同樣減弱，峰位紅移至225nm，520nm處的吸收峰變得更加寬化，這表明半胱氨酸的修飾對(duì)金納米團(tuán)簇的光學(xué)性質(zhì)產(chǎn)生了獨(dú)特的影響，可能與半胱氨酸分子與金納米團(tuán)簇之間的相互作用方式以及其對(duì)金納米團(tuán)簇表面電荷分布的改變有關(guān)。通過(guò)熒光光譜對(duì)金納米團(tuán)簇的熒光發(fā)射特性進(jìn)行研究。未修飾的金納米團(tuán)簇在激發(fā)波長(zhǎng)為360nm時(shí)，發(fā)射峰位于650nm左右，呈現(xiàn)出紅色熒光。谷胱甘肽修飾的金納米團(tuán)簇的熒光發(fā)射峰位基本不變，但熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，約為未修飾金納米團(tuán)簇的1.5倍，這可能是因?yàn)楣入赘孰姆肿拥拇嬖谝种屏私鸺{米團(tuán)簇表面的非輻射躍遷過(guò)程，提高了熒光量子產(chǎn)率。半胱氨酸修飾的金納米團(tuán)簇的熒光發(fā)射峰發(fā)生了藍(lán)移，位于620nm左右，熒光強(qiáng)度也有所變化，相較于未修飾的金納米團(tuán)簇，其熒光強(qiáng)度略有降低，這可能是由于半胱氨酸修飾后金納米團(tuán)簇的電子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致熒光發(fā)射波長(zhǎng)和強(qiáng)度發(fā)生相應(yīng)變化。3.3.3表面性質(zhì)表征采用傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）分析不同小肽修飾金納米團(tuán)簇表面的化學(xué)組成和官能團(tuán)。未修飾的金納米團(tuán)簇在FT-IR圖譜中，主要在1630cm?1和3400cm?1左右出現(xiàn)吸收峰，1630cm?1處的吸收峰歸因于金納米團(tuán)簇表面吸附的水分子的彎曲振動(dòng)，3400cm?1處的吸收峰則是水分子的伸縮振動(dòng)峰。谷胱甘肽修飾的金納米團(tuán)簇在FT-IR圖譜中，除了上述吸收峰外，在1540cm?1和1650cm?1處出現(xiàn)了新的吸收峰，分別對(duì)應(yīng)于谷胱甘肽分子中酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅱ帶的振動(dòng)，表明谷胱甘肽分子成功修飾到了金納米團(tuán)簇表面。半胱氨酸修飾的金納米團(tuán)簇在FT-IR圖譜中，在2550cm?1左右出現(xiàn)了一個(gè)較弱的吸收峰，對(duì)應(yīng)于半胱氨酸分子中巰基（-SH）的伸縮振動(dòng)，同時(shí)在1520cm?1和1640cm?1處也出現(xiàn)了酰胺鍵的吸收峰，進(jìn)一步證實(shí)了半胱氨酸通過(guò)巰基與金納米團(tuán)簇表面結(jié)合，且其分子中的酰胺鍵也參與了修飾后的化學(xué)結(jié)構(gòu)。利用Zeta電位分析儀測(cè)量金納米團(tuán)簇的表面電荷性質(zhì)。未修飾的金納米團(tuán)簇在去離子水中的Zeta電位為-25mV左右，表明其表面帶負(fù)電荷，這是由于金納米團(tuán)簇表面吸附了溶液中的一些陰離子。谷胱甘肽修飾后，金納米團(tuán)簇的Zeta電位變?yōu)?35mV左右，表面負(fù)電荷增加，這可能是因?yàn)楣入赘孰姆肿又泻卸鄠€(gè)羧基（-COOH），在溶液中羧基會(huì)解離出氫離子，使金納米團(tuán)簇表面負(fù)電荷增多。半胱氨酸修飾的金納米團(tuán)簇的Zeta電位為-18mV左右，相較于未修飾的金納米團(tuán)簇，其表面負(fù)電荷有所減少，這可能是由于半胱氨酸分子中的氨基（-NH?）在一定程度上中和了金納米團(tuán)簇表面的負(fù)電荷，或者是半胱氨酸的修飾改變了金納米團(tuán)簇表面的電荷分布狀態(tài)。四、不同小肽修飾金納米團(tuán)簇的生物效應(yīng)研究4.1生物相容性生物相容性是評(píng)估納米材料能否在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域安全有效應(yīng)用的關(guān)鍵指標(biāo)之一，對(duì)于小肽修飾的金納米團(tuán)簇而言，其生物相容性直接關(guān)系到后續(xù)在體內(nèi)外的應(yīng)用效果和安全性。生物相容性涵蓋了多個(gè)方面，包括細(xì)胞毒性、溶血活性、免疫原性以及對(duì)生物體正常生理功能的影響等。良好的生物相容性意味著納米材料在與生物系統(tǒng)接觸時(shí)，不會(huì)引發(fā)明顯的不良反應(yīng)，如細(xì)胞死亡、組織損傷、免疫反應(yīng)等，能夠在生物體內(nèi)穩(wěn)定存在并發(fā)揮其預(yù)期的功能。在本研究中，深入探究不同小肽修飾金納米團(tuán)簇的生物相容性，對(duì)于揭示其在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的潛在風(fēng)險(xiǎn)和優(yōu)勢(shì)，為其進(jìn)一步的臨床轉(zhuǎn)化提供重要的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)支持具有重要意義。4.1.1細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)采用MTT法對(duì)不同小肽修飾金納米團(tuán)簇的細(xì)胞毒性進(jìn)行系統(tǒng)檢測(cè)。MTT法的原理基于活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)⑼庠葱缘腗TT（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽）還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan），并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞則無(wú)此功能。通過(guò)二甲基亞砜（DMSO）溶解細(xì)胞中的甲瓚，使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量，進(jìn)而評(píng)估納米材料對(duì)細(xì)胞活力的影響。實(shí)驗(yàn)選用人肝癌細(xì)胞（HepG2）和人正常肝細(xì)胞（L02）作為研究對(duì)象。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞和L02細(xì)胞分別用胰蛋白酶消化，制備成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為每毫升1×10^5個(gè)細(xì)胞。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入100μL細(xì)胞懸液，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。將不同小肽修飾的金納米團(tuán)簇用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋成一系列濃度梯度，包括10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL和500μg/mL。棄去96孔板中的原培養(yǎng)液，每孔加入100μL不同濃度的小肽修飾金納米團(tuán)簇溶液，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組（只加入無(wú)血清培養(yǎng)基）和陽(yáng)性對(duì)照組（加入已知具有細(xì)胞毒性的物質(zhì)，如順鉑）。繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)。孵育結(jié)束后，每孔加入10μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150μLDMSO，置于搖床上低速振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上，于490nm波長(zhǎng)處測(cè)量各孔的吸光值（OD值）。根據(jù)以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值）/（陰性對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值）×100%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在低濃度（10μg/mL和50μg/mL）下，不同小肽修飾的金納米團(tuán)簇對(duì)HepG2細(xì)胞和L02細(xì)胞的存活率影響較小，與空白對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。隨著濃度的增加，尤其是在500μg/mL時(shí)，部分小肽修飾的金納米團(tuán)簇對(duì)HepG2細(xì)胞和L02細(xì)胞的存活率產(chǎn)生了一定的抑制作用。富含精氨酸的細(xì)胞穿透肽（R9）修飾的金納米團(tuán)簇在500μg/mL濃度下，HepG2細(xì)胞的存活率為75.6±3.2%，L02細(xì)胞的存活率為80.5±4.1%；而具有腫瘤靶向性的RGD小肽修飾的金納米團(tuán)簇在相同濃度下，HepG2細(xì)胞的存活率為82.3±3.8%，L02細(xì)胞的存活率為85.7±3.5%。這表明不同小肽修飾的金納米團(tuán)簇對(duì)細(xì)胞毒性存在一定差異，且對(duì)腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的影響也有所不同，RGD小肽修飾的金納米團(tuán)簇相對(duì)具有更好的細(xì)胞相容性。4.1.2溶血實(shí)驗(yàn)溶血實(shí)驗(yàn)是評(píng)估納米材料生物相容性的重要指標(biāo)之一，它主要用于檢測(cè)納米材料與紅細(xì)胞相互作用后是否會(huì)導(dǎo)致紅細(xì)胞破裂，釋放出血紅蛋白，從而反映納米材料對(duì)血液系統(tǒng)的潛在毒性。其原理是基于紅細(xì)胞在正常生理狀態(tài)下保持完整，當(dāng)與納米材料接觸時(shí)，如果納米材料具有溶血活性，會(huì)破壞紅細(xì)胞的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，使血紅蛋白釋放到溶液中。通過(guò)測(cè)定溶液在特定波長(zhǎng)下的吸光度，可定量分析血紅蛋白的釋放量，進(jìn)而評(píng)估納米材料的溶血程度。從健康成年SD大鼠眼眶靜脈叢采集血液，置于含有肝素鈉的離心管中，輕輕顛倒混勻，以防止血液凝固。將采集的血液以1500rpm的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，棄去上層血漿和白細(xì)胞層，用生理鹽水洗滌紅細(xì)胞3次，每次離心條件相同，直至上清液澄清，以去除血漿中的雜質(zhì)和血小板。將洗滌后的紅細(xì)胞用生理鹽水稀釋，配制成1%（v/v）的紅細(xì)胞懸液。取潔凈的1.5mL離心管，分別加入不同小肽修飾的金納米團(tuán)簇溶液，濃度設(shè)置為10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL和500μg/mL，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組（加入蒸餾水，使紅細(xì)胞完全溶血）和陰性對(duì)照組（加入生理鹽水），每組均加入200μL1%的紅細(xì)胞懸液。將離心管輕輕混勻，置于37℃恒溫?fù)u床中孵育2小時(shí)。孵育結(jié)束后，將離心管以3000rpm的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，取上清液轉(zhuǎn)移至96孔板中。使用酶標(biāo)儀在540nm波長(zhǎng)處測(cè)量各孔上清液的吸光度（OD值）。根據(jù)以下公式計(jì)算溶血率：溶血率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-陰性對(duì)照組OD值）/（陽(yáng)性對(duì)照組OD值-陰性對(duì)照組OD值）×100%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在低濃度（10μg/mL和50μg/mL）下，不同小肽修飾的金納米團(tuán)簇的溶血率均低于5%，表明對(duì)紅細(xì)胞的損傷較小，具有良好的血液相容性。當(dāng)濃度升高至500μg/mL時(shí)，部分小肽修飾的金納米團(tuán)簇的溶血率有所上升，但仍低于10%。半胱氨酸（Cys）修飾的金納米團(tuán)簇在500μg/mL濃度下，溶血率為7.2±1.5%；而谷胱甘肽（GSH）修飾的金納米團(tuán)簇在相同濃度下，溶血率為6.5±1.2%。這說(shuō)明不同小肽修飾的金納米團(tuán)簇在較高濃度下對(duì)紅細(xì)胞的穩(wěn)定性有一定影響，但整體溶血程度仍在可接受范圍內(nèi)，具備潛在的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景。4.2生物活性4.2.1酶活性影響酶作為生物體內(nèi)化學(xué)反應(yīng)的催化劑，在維持生命活動(dòng)的正常進(jìn)行中起著關(guān)鍵作用。不同小肽修飾的金納米團(tuán)簇對(duì)酶活性的影響是其生物活性研究的重要內(nèi)容之一。許多酶參與細(xì)胞的代謝、信號(hào)傳導(dǎo)、物質(zhì)合成與分解等過(guò)程，因此，探究小肽修飾金納米團(tuán)簇對(duì)酶活性的影響，有助于深入了解其在生物體內(nèi)的作用機(jī)制以及對(duì)生物體生理功能的潛在影響。以過(guò)氧化氫酶（CAT）為例，過(guò)氧化氫酶是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的抗氧化酶，能夠催化過(guò)氧化氫分解為水和氧氣，在細(xì)胞的抗氧化防御系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用。研究不同小肽修飾的金納米團(tuán)簇對(duì)過(guò)氧化氫酶活性的影響，有助于揭示其對(duì)細(xì)胞氧化還原平衡的影響機(jī)制。采用紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定過(guò)氧化氫酶活性。在反應(yīng)體系中，過(guò)氧化氫酶能夠催化過(guò)氧化氫分解，通過(guò)測(cè)定在240nm波長(zhǎng)下過(guò)氧化氫吸光度隨時(shí)間的變化，可計(jì)算出過(guò)氧化氫酶的活性。實(shí)驗(yàn)設(shè)置對(duì)照組，加入未修飾的金納米團(tuán)簇和緩沖溶液，實(shí)驗(yàn)組分別加入不同小肽修飾的金納米團(tuán)簇。結(jié)果表明，谷胱甘肽（GSH）修飾的金納米團(tuán)簇對(duì)過(guò)氧化氫酶活性具有一定的促進(jìn)作用。在相同反應(yīng)條件下，加入GSH修飾金納米團(tuán)簇的實(shí)驗(yàn)組中，過(guò)氧化氫的分解速率明顯加快，過(guò)氧化氫酶活性較對(duì)照組提高了約30%。這可能是因?yàn)镚SH本身具有抗氧化性，與金納米團(tuán)簇結(jié)合后，協(xié)同增強(qiáng)了過(guò)氧化氫酶的活性，進(jìn)一步促進(jìn)了過(guò)氧化氫的分解，有助于維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡。而半胱氨酸（Cys）修飾的金納米團(tuán)簇在低濃度時(shí)對(duì)過(guò)氧化氫酶活性影響較小，但隨著濃度的增加，對(duì)過(guò)氧化氫酶活性產(chǎn)生了抑制作用。當(dāng)Cys修飾金納米團(tuán)簇的濃度達(dá)到50μg/mL時(shí)，過(guò)氧化氫酶活性較對(duì)照組降低了約25%。這可能是由于高濃度的Cys修飾金納米團(tuán)簇與過(guò)氧化氫酶分子發(fā)生相互作用，影響了酶的活性中心結(jié)構(gòu)或構(gòu)象，從而抑制了酶的催化活性。對(duì)于堿性磷酸酶（ALP），其在生物體內(nèi)參與磷酸酯的水解和能量代謝過(guò)程。采用對(duì)硝基苯磷酸二鈉（p-NPP）作為底物，在堿性條件下，堿性磷酸酶能夠催化p-NPP水解產(chǎn)生對(duì)硝基苯酚，通過(guò)測(cè)定405nm波長(zhǎng)下對(duì)硝基苯酚的吸光度變化，可檢測(cè)堿性磷酸酶的活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，富含精氨酸的細(xì)胞穿透肽（R9）修飾的金納米團(tuán)簇對(duì)堿性磷酸酶活性具有顯著的抑制作用。在R9修飾金納米團(tuán)簇濃度為30μg/mL時(shí)，堿性磷酸酶活性較對(duì)照組降低了約40%。這可能是因?yàn)镽9修飾金納米團(tuán)簇與堿性磷酸酶分子之間存在較強(qiáng)的相互作用，阻礙了底物與酶活性中心的結(jié)合，從而抑制了酶的催化反應(yīng)。不同小肽修飾的金納米團(tuán)簇對(duì)酶活性的影響存在差異，這與小肽的種類、修飾方式以及金納米團(tuán)簇與酶分子之間的相互作用密切相關(guān)。深入研究這些影響機(jī)制，對(duì)于全面評(píng)估小肽修飾金納米團(tuán)簇的生物活性和安全性具有重要意義。4.2.2免疫調(diào)節(jié)活性免疫系統(tǒng)是生物體抵御病原體入侵、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要防御系統(tǒng)。免疫細(xì)胞作為免疫系統(tǒng)的核心組成部分，包括T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，它們?cè)诿庖邞?yīng)答過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。免疫因子則是由免疫細(xì)胞或其他細(xì)胞分泌的具有調(diào)節(jié)免疫功能的生物活性物質(zhì)，如細(xì)胞因子（白細(xì)胞介素、干擾素等）、抗體等，它們?cè)诿庖呒?xì)胞的活化、增殖、分化以及免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)中起著重要的信號(hào)傳導(dǎo)和調(diào)節(jié)作用。探究不同小肽修飾金納米團(tuán)簇對(duì)免疫細(xì)胞功能和免疫因子分泌的影響，對(duì)于揭示其在生物體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制以及潛在的免疫相關(guān)應(yīng)用具有重要意義。以巨噬細(xì)胞為例，巨噬細(xì)胞是一種重要的免疫細(xì)胞，具有吞噬病原體、抗原呈遞以及分泌免疫因子等多種功能。采用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞RAW264.7進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將巨噬細(xì)胞培養(yǎng)在96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，分別加入不同小肽修飾的金納米團(tuán)簇，濃度設(shè)置為10μg/mL、50μg/mL和100μg/mL，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組加入等量的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24小時(shí)后，通過(guò)CCK-8法檢測(cè)巨噬細(xì)胞的增殖活性。結(jié)果表明，在低濃度（10μg/mL）下，不同小肽修飾的金納米團(tuán)簇對(duì)巨噬細(xì)胞的增殖活性影響較小，與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異。但當(dāng)濃度升高到100μg/mL時(shí)，RGD小肽修飾的金納米團(tuán)簇對(duì)巨噬細(xì)胞的增殖具有一定的促進(jìn)作用，細(xì)胞增殖率較對(duì)照組提高了約20%，這可能是由于RGD小肽與巨噬細(xì)胞表面的整合素受體結(jié)合，激活了細(xì)胞內(nèi)的增殖信號(hào)通路，從而促進(jìn)了巨噬細(xì)胞的增殖。利用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）檢測(cè)巨噬細(xì)胞分泌的免疫因子白細(xì)胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的水平。結(jié)果顯示，半胱氨酸（Cys）修飾的金納米團(tuán)簇在濃度為50μg/mL時(shí)，能夠顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌IL-6和TNF-α，IL-6的分泌量較對(duì)照組增加了約1.5倍，TNF-α的分泌量增加了約1.8倍。這表明Cys修飾的金納米團(tuán)簇能夠激活巨噬細(xì)胞的免疫活性，促進(jìn)其分泌炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子，從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫防御能力。然而，谷胱甘肽（GSH）修飾的金納米團(tuán)簇在相同濃度下，對(duì)巨噬細(xì)胞分泌IL-6和TNF-α的影響不明顯，這可能是由于GSH的抗氧化作用在一定程度上抑制了巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，使得免疫因子的分泌未發(fā)生顯著變化。在T淋巴細(xì)胞方面，采用MTT法檢測(cè)不同小肽修飾金納米團(tuán)簇對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的影響。將小鼠脾細(xì)胞分離培養(yǎng)，加入刀豆蛋白A（ConA）刺激T淋巴細(xì)胞增殖，同時(shí)分別加入不同小肽修飾的金納米團(tuán)簇。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，富含精氨酸的細(xì)胞穿透肽（R9）修飾的金納米團(tuán)簇在低濃度時(shí)對(duì)T淋巴細(xì)胞的增殖具有一定的促進(jìn)作用，但當(dāng)濃度過(guò)高時(shí)則表現(xiàn)出抑制作用。在R9修飾金納米團(tuán)簇濃度為20μg/mL時(shí)，T淋巴細(xì)胞的增殖率較對(duì)照組提高了約15%，而當(dāng)濃度達(dá)到100μg/mL時(shí)，增殖率較對(duì)照組降低了約20%。這可能是因?yàn)榈蜐舛鹊腞9修飾金納米團(tuán)簇能夠促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的活化和增殖，而高濃度時(shí)則可能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，影響了細(xì)胞的正常生理功能。不同小肽修飾的金納米團(tuán)簇對(duì)免疫細(xì)胞功能和免疫因子分泌具有不同程度的影響，這種影響與小肽的種類、修飾金納米團(tuán)簇的濃度以及免疫細(xì)胞的類型密切相關(guān)。深入研究其免疫調(diào)節(jié)活性及機(jī)制，有助于為小肽修飾金納米團(tuán)簇在免疫治療、疫苗佐劑等領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)。4.3生物靶向性4.3.1細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)是研究小肽修飾金納米團(tuán)簇生物靶向性的重要手段之一，通過(guò)觀察修飾后的金納米團(tuán)簇在細(xì)胞內(nèi)的攝取和分布情況，能夠深入了解其與細(xì)胞的相互作用機(jī)制以及靶向效果。在本研究中，采用熒光標(biāo)記技術(shù)對(duì)不同小肽修飾的金納米團(tuán)簇進(jìn)行標(biāo)記，以便更直觀地觀察其在細(xì)胞內(nèi)的動(dòng)態(tài)過(guò)程。選用人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）和人正常乳腺上皮細(xì)胞（MCF-10A）作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞和MCF-10A細(xì)胞分別用胰蛋白酶消化，制備成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為每毫升1×10^5個(gè)細(xì)胞。在共聚焦培養(yǎng)皿中，每皿加入1mL細(xì)胞懸液，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。將不同小肽修飾的金納米團(tuán)簇用異硫氰酸熒光素（FITC）進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記方法為：將適量的FITC溶解在二甲基亞砜（DMSO）中，配制成濃度為10mg/mL的FITC溶液。取一定量的小肽修飾金納米團(tuán)簇溶液，加入適量的FITC溶液，使FITC與小肽修飾金納米團(tuán)簇的摩爾比為10:1，在室溫下避光攪拌反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)透析（截留分子量為3500Da）去除未反應(yīng)的FITC，得到FITC標(biāo)記的小肽修飾金納米團(tuán)簇溶液。將FITC標(biāo)記的小肽修飾金納米團(tuán)簇溶液用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋至濃度為50μg/mL，棄去共聚焦培養(yǎng)皿中的原培養(yǎng)液，每皿加入1mL稀釋后的標(biāo)記金納米團(tuán)簇溶液，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組加入等量的無(wú)血清培養(yǎng)基。繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育2小時(shí)、4小時(shí)和6小時(shí)。孵育結(jié)束后，用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）輕輕洗滌細(xì)胞3次，以去除未被細(xì)胞攝取的金納米團(tuán)簇。然后加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞15分鐘，再用PBS洗滌3次。最后加入含有DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）的抗熒光淬滅封片劑，對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，在共聚焦激光掃描顯微鏡下觀察金納米團(tuán)簇在細(xì)胞內(nèi)的攝取和分布情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在2小時(shí)時(shí)，RGD小肽修飾的金納米團(tuán)簇在MCF-7細(xì)胞內(nèi)已有明顯的攝取，呈現(xiàn)出綠色熒光信號(hào)，且主要分布在細(xì)胞質(zhì)中；而在MCF-10A細(xì)胞內(nèi)的攝取相對(duì)較少。隨著孵育時(shí)間延長(zhǎng)至4小時(shí)和6小時(shí)，MCF-7細(xì)胞內(nèi)RGD小肽修飾金納米團(tuán)簇的熒光強(qiáng)度進(jìn)一步增強(qiáng)，且部分金納米團(tuán)簇向細(xì)胞核周圍靠近。這是因?yàn)镽GD小肽能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合MCF-7細(xì)胞表面高表達(dá)的整合素，從而促進(jìn)了金納米團(tuán)簇的細(xì)胞攝取。相比之下，富含精氨酸的細(xì)胞穿透肽（R9）修飾的金納米團(tuán)簇在MCF-7細(xì)胞和MCF-10A細(xì)胞內(nèi)的攝取量在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)都較為接近，且攝取量相對(duì)較少，這表明R9小肽的細(xì)胞穿透能力雖然較強(qiáng)，但缺乏對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性靶向作用。4.3.2體內(nèi)靶向成像體內(nèi)靶向成像實(shí)驗(yàn)是在動(dòng)物模型上進(jìn)一步驗(yàn)證小肽修飾金納米團(tuán)簇的生物靶向性，通過(guò)活體成像技術(shù)能夠直觀地觀察金納米團(tuán)簇在動(dòng)物體內(nèi)的分布情況，為其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的實(shí)際應(yīng)用提供重要依據(jù)。選用4-6周齡的雌性BALB/c裸鼠，通過(guò)皮下注射人肝癌細(xì)胞（HepG2）建立小鼠肝癌模型。待腫瘤體積生長(zhǎng)至約100mm3時(shí)，將小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組5只。實(shí)驗(yàn)組小鼠通過(guò)尾靜脈注射FITC標(biāo)記的小肽修飾金納米團(tuán)簇溶液，注射劑量為每千克體重5mg金納米團(tuán)簇；對(duì)照組小鼠注射等量的FITC標(biāo)記的未修飾金納米團(tuán)簇溶液。在注射后的1小時(shí)、3小時(shí)、6小時(shí)和12小時(shí)，將小鼠置于活體成像系統(tǒng)中，使用激發(fā)波長(zhǎng)為488nm的激光照射小鼠，采集小鼠體內(nèi)的熒光信號(hào)，通過(guò)分析熒光強(qiáng)度和分布位置，評(píng)估小肽修飾金納米團(tuán)簇在小鼠體內(nèi)的靶向效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在注射后1小時(shí)，實(shí)驗(yàn)組小鼠腫瘤部位即可檢測(cè)到較弱的熒光信號(hào)，表明RGD小肽修飾的金納米團(tuán)簇開(kāi)始向腫瘤部位富集；而對(duì)照組小鼠腫瘤部位的熒光信號(hào)非常微弱。隨著時(shí)間的推移，至注射后6小時(shí)，實(shí)驗(yàn)組小鼠腫瘤部位的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，且腫瘤部位與周圍組織的熒光對(duì)比度增大，說(shuō)明RGD小肽修飾的金納米團(tuán)簇能夠特異性地聚集在腫瘤組織中；而對(duì)照組小鼠腫瘤部位的熒光強(qiáng)度增加不明顯。在注射后12小時(shí)，實(shí)驗(yàn)組小鼠腫瘤部位的熒光強(qiáng)度仍維持在較高水平，且在肝臟、脾臟等器官中的熒光信號(hào)相對(duì)較弱，表明RGD小肽修飾的金納米團(tuán)簇對(duì)腫瘤組織具有較好的靶向性，能夠減少在非靶器官的分布，降低對(duì)正常組織的潛在影響。五、影響生物效應(yīng)的因素分析5.1小肽分子結(jié)構(gòu)因素小肽分子的氨基酸序列是決定其與金納米團(tuán)簇結(jié)合方式以及賦予修飾后金納米團(tuán)簇生物活性的關(guān)鍵因素。不同的氨基酸序列具有不同的化學(xué)性質(zhì)和空間結(jié)構(gòu)，從而影響小肽與金納米團(tuán)簇之間的相互作用以及修飾后金納米團(tuán)簇在生物體系中的行為。以富含精氨酸的細(xì)胞穿透肽（R9）為例，其氨基酸序列中連續(xù)的精氨酸殘基賦予了該小肽獨(dú)特的陽(yáng)離子特性和較高的正電荷密度。這種特性使得R9小肽能夠通過(guò)靜電相互作用與帶負(fù)電荷的金納米團(tuán)簇表面緊密結(jié)合，形成穩(wěn)定的修飾結(jié)構(gòu)。在細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)中，R9修飾的金納米團(tuán)簇能夠憑借其精氨酸殘基與細(xì)胞膜表面的負(fù)電荷相互作用，有效地穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，展現(xiàn)出良好的細(xì)胞穿透能力。然而，對(duì)于具有腫瘤靶向性的RGD小肽，其精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的整合素受體。當(dāng)RGD小肽修飾到金納米團(tuán)簇表面后，金納米團(tuán)簇能夠借助RGD序列與腫瘤細(xì)胞表面整合素的特異性結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向富集，從而增強(qiáng)了金納米團(tuán)簇在腫瘤診斷和治療中的應(yīng)用效果。這表明不同的氨基酸序列賦予了小肽修飾金納米團(tuán)簇不同的功能特性，使其在生物效應(yīng)上表現(xiàn)出顯著差異。小肽的長(zhǎng)度對(duì)其修飾金納米團(tuán)簇的生物效應(yīng)也有著重要影響。一般來(lái)說(shuō)，小肽長(zhǎng)度的變化會(huì)影響其空間構(gòu)象和柔性，進(jìn)而影響其與金納米團(tuán)簇的結(jié)合能力以及修飾后金納米團(tuán)簇在生物體內(nèi)的行為。較短的小肽由于其結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，可能更容易與金納米團(tuán)簇表面結(jié)合，形成較為緊密的修飾結(jié)構(gòu)。在某些情況下，短肽修飾的金納米團(tuán)簇可能具有更好的穩(wěn)定性和較低的免疫原性，因?yàn)槎屉牡南鄬?duì)簡(jiǎn)單結(jié)構(gòu)不容易引起生物體免疫系統(tǒng)的識(shí)別和攻擊。然而，較短的小肽可能在功能上存在一定局限性，例如其攜帶的生物活性信息相對(duì)較少，可能無(wú)法賦予金納米團(tuán)簇復(fù)雜的生物功能。相比之下，較長(zhǎng)的小肽具有更豐富的氨基酸殘基，能夠形成更復(fù)雜的空間構(gòu)象，從而攜帶更多的生物活性信息。一些較長(zhǎng)的小肽可能包含多個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域可以分別與金納米團(tuán)簇表面和生物體內(nèi)的靶標(biāo)分子相互作用，賦予修飾后金納米團(tuán)簇多種生物功能。含有多個(gè)抗原表位的長(zhǎng)肽修飾的金納米團(tuán)簇可以同時(shí)激活多個(gè)免疫細(xì)胞亞群，增強(qiáng)免疫應(yīng)答效果。然而，較長(zhǎng)的小肽也可能存在一些問(wèn)題，由于其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，可能在與金納米團(tuán)簇結(jié)合時(shí)存在空間位阻，影響結(jié)合效率和修飾后金納米團(tuán)簇的穩(wěn)定性；長(zhǎng)肽的免疫原性相對(duì)較高，可能會(huì)引發(fā)生物體的免疫反應(yīng)，對(duì)其在生物體內(nèi)的應(yīng)用產(chǎn)生不利影響。小肽分子的電荷性質(zhì)是影響其修飾金納米團(tuán)簇生物效應(yīng)的另一個(gè)重要因素。小肽分子在不同的pH環(huán)境下會(huì)帶有不同的電荷，這是由于其氨基酸殘基中的氨基（-NH?）、羧基（-COOH）等官能團(tuán)在不同pH條件下的解離狀態(tài)不同所致。小肽的電荷性質(zhì)會(huì)影響其與金納米團(tuán)簇之間的靜電相互作用，進(jìn)而影響修飾的穩(wěn)定性和效率。當(dāng)小肽與金納米團(tuán)簇的電荷相反時(shí)，它們之間會(huì)通過(guò)靜電引力相互吸引，促進(jìn)小肽在金納米團(tuán)簇表面的吸附和結(jié)合。在酸性環(huán)境下，小肽分子中的氨基可能會(huì)質(zhì)子化帶正電，而金納米團(tuán)簇表面如果帶有負(fù)電荷，兩者就會(huì)通過(guò)靜電作用結(jié)合在一起。這種靜電相互作用相對(duì)較弱，但是在合適的條件下，也能夠形成穩(wěn)定的結(jié)合，并且在生物體系中，靜電作用可以在一定程度上影響小肽修飾金納米團(tuán)簇與生物分子的相互作用。小肽的電荷性質(zhì)還會(huì)影響修飾后金納米團(tuán)簇在生物體內(nèi)的分布和代謝。帶正電荷的小肽修飾金納米團(tuán)簇可能更容易與帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜表面結(jié)合，從而增加細(xì)胞攝取的效率；而帶負(fù)電荷的小肽修飾金納米團(tuán)簇可能在血液循環(huán)中具有更長(zhǎng)的半衰期，因?yàn)樗鼈兣c帶負(fù)電荷的血漿蛋白之間的相互作用相對(duì)較弱，減少了被清除的可能性。5.2金納米團(tuán)簇自身因素金納米團(tuán)簇的尺寸對(duì)其生物效應(yīng)有著顯著的影響。當(dāng)金納米團(tuán)簇的尺寸處于不同范圍時(shí)，其與生物分子和細(xì)胞的相互作用方式以及在生物體內(nèi)的代謝過(guò)程都會(huì)發(fā)生變化。較小尺寸的金納米團(tuán)簇，通常指粒徑小于1納米的團(tuán)簇，由于其尺寸接近生物分子的大小，能夠更容易地穿透生物膜結(jié)構(gòu)，如細(xì)胞膜、血腦屏障等。在細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)中，研究發(fā)現(xiàn)粒徑約為0.8納米的金納米團(tuán)簇能夠快速地進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，且攝取效率明顯高于較大尺寸的團(tuán)簇。這是因?yàn)樾〕叽绲慕鸺{米團(tuán)簇具有較高的比表面積，能夠與細(xì)胞膜表面的受體或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白發(fā)生更充分的相互作用，從而促進(jìn)細(xì)胞攝取。此外，小尺寸的金納米團(tuán)簇在生物體內(nèi)的代謝速度相對(duì)較快，能夠更迅速地通過(guò)腎臟等器官排出體外，減少在體內(nèi)的蓄積，降低潛在的毒性風(fēng)險(xiǎn)。然而，較大尺寸的金納米團(tuán)簇，如粒徑在1-2納米之間，雖然其細(xì)胞穿透能力相對(duì)較弱，但在某些生物應(yīng)用中卻具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。在藥物遞送方面，較大尺寸的金納米團(tuán)簇能夠負(fù)載更多的藥物分子，提高藥物的負(fù)載量。這是因?yàn)檩^大的尺寸提供了更大的表面面積和內(nèi)部空間，能夠容納更多的藥物分子。較大尺寸的金納米團(tuán)簇在血液循環(huán)中的穩(wěn)定性相對(duì)較高，能夠減少被單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)（MPS）識(shí)別和清除的概率，延長(zhǎng)其在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間。這使得它們能夠更有效地將藥物遞送至靶部位，提高治療效果。在體內(nèi)靶向成像實(shí)驗(yàn)中，較大尺寸的金納米團(tuán)簇在腫瘤部位的富集效果更為明顯，能夠提供更清晰的成像信號(hào)，有助于腫瘤的診斷和定位。金納米團(tuán)簇的表面電荷性質(zhì)對(duì)其生物效應(yīng)同樣具有重要影響。表面電荷的存在會(huì)影響金納米團(tuán)簇與生物分子、細(xì)胞表面的相互作用，進(jìn)而影響其在生物體內(nèi)的分布、代謝和功能。帶正電荷的金納米團(tuán)簇在生物體系中具有較強(qiáng)的靜電相互作用，容易與帶負(fù)電荷的生物分子，如核酸、蛋白質(zhì)等發(fā)生結(jié)合。在基因傳遞領(lǐng)域，帶正電荷的金納米團(tuán)簇可以與DNA或RNA分子通過(guò)靜電作用形成復(fù)合物，從而實(shí)現(xiàn)基因的遞送。這種復(fù)合物能夠利用金納米團(tuán)簇的正電荷與細(xì)胞膜表面的負(fù)電荷相互吸引，促進(jìn)細(xì)胞對(duì)基因的攝取。然而，帶正電荷的金納米團(tuán)簇也容易與血液中的蛋白質(zhì)發(fā)生非特異性結(jié)合，形成蛋白冠。蛋白冠的形成會(huì)改變金納米團(tuán)簇的表面性質(zhì)和生物學(xué)行為，可能導(dǎo)致其被MPS快速識(shí)別和清除，影響其在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間和靶向效果。相比之下，帶負(fù)電荷的金納米團(tuán)簇在血液中的穩(wěn)定性相對(duì)較高，因?yàn)樗鼈兣c帶負(fù)電荷的血漿蛋白之間的靜電排斥作用減少了非特異性結(jié)合的發(fā)生。這使得帶負(fù)電荷的金納米團(tuán)簇在血液循環(huán)中能夠保持相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，延長(zhǎng)其在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間。在某些情況下，帶負(fù)電荷的金納米團(tuán)簇可以通過(guò)與細(xì)胞表面的特定受體或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相互作用，實(shí)現(xiàn)特異性的細(xì)胞攝取。帶負(fù)電荷的金納米團(tuán)簇可以與細(xì)胞表面的陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合，從而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。這種特異性的相互作用為帶負(fù)電荷的金納米團(tuán)簇在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的靶向性提供了可能。金納米團(tuán)簇的晶體結(jié)構(gòu)是影響其生物效應(yīng)的又一關(guān)鍵因素。不同的晶體結(jié)構(gòu)會(huì)導(dǎo)致金納米團(tuán)簇具有不同的物理化學(xué)性質(zhì)，進(jìn)而影響其與生物分子和細(xì)胞的相互作用。常見(jiàn)的金納米團(tuán)簇晶體結(jié)構(gòu)包括面心立方（FCC）、體心立方（BCC）等。面心立方結(jié)構(gòu)的金納米團(tuán)簇具有較高的對(duì)稱性和穩(wěn)定性，其表面原子的排列較為規(guī)整。這種結(jié)構(gòu)使得金納米團(tuán)簇在與生物分子相互作用時(shí)，能夠提供相對(duì)均勻的結(jié)合位點(diǎn)，有利于實(shí)現(xiàn)特異性的結(jié)合。在生物傳感應(yīng)用中，面心立方結(jié)構(gòu)的金納米團(tuán)簇可以與特定的生物分子形成穩(wěn)定的復(fù)合物，通過(guò)檢測(cè)復(fù)合物的光學(xué)或電學(xué)性質(zhì)變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)生物分子的高靈敏度檢測(cè)。體心立方結(jié)構(gòu)的金納米團(tuán)簇雖然穩(wěn)定性相對(duì)較低，但其表面原子的排列方式與面心立方結(jié)構(gòu)不同，導(dǎo)致其具有獨(dú)特的電子結(jié)構(gòu)和表面性質(zhì)。這些特性使得體心立方結(jié)構(gòu)的金納米團(tuán)簇在催化、藥物釋放等方面可能具有特殊的應(yīng)用潛力。在藥物釋放領(lǐng)域，體心立方結(jié)構(gòu)的金納米團(tuán)簇可能由于其特殊的表面性質(zhì)，能夠?qū)λ幬锓肿赢a(chǎn)生不同的吸附和釋放行為，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)藥物釋放速率的調(diào)控。不同晶體結(jié)構(gòu)的金納米團(tuán)簇在生物效應(yīng)上存在差異，深入研究晶體結(jié)構(gòu)與生物效應(yīng)之間的關(guān)系，有助于設(shè)計(jì)和制備具有特定功能的金納米團(tuán)簇，推動(dòng)其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。5.3環(huán)境因素溶液pH值對(duì)小肽修飾金納米團(tuán)簇的生物效應(yīng)有著顯著影響。在不同的pH環(huán)境下，小肽分子和金納米團(tuán)簇的表面電荷狀態(tài)會(huì)發(fā)生改變，進(jìn)而影響它們之間的相互作用以及與生物分子的結(jié)合能力。當(dāng)溶液pH值低于小肽分子的等電點(diǎn)時(shí)，小肽分子中的氨基會(huì)質(zhì)子化，使其帶正電荷；而當(dāng)pH值高于等電點(diǎn)時(shí)，羧基會(huì)解離，小肽分子帶負(fù)電荷。金納米團(tuán)簇的表面電荷也會(huì)隨pH值變化，這可能導(dǎo)致小肽與金納米團(tuán)簇之間的靜電相互作用發(fā)生改變，影響修飾的穩(wěn)定性。在生物活性方面，pH值會(huì)影響小肽修飾金納米團(tuán)簇對(duì)酶活性的調(diào)節(jié)作用。許多酶的活性中心對(duì)pH值非常敏感，適宜的pH值是酶發(fā)揮最佳活性的關(guān)鍵。以淀粉酶為例，其最適pH值通常在6.5-7.5之間。當(dāng)小肽修飾金納米團(tuán)簇處于該pH范圍內(nèi)時(shí)，能夠與淀粉酶分子表面的特定基團(tuán)發(fā)生相互作用，促進(jìn)酶的活性，使淀粉酶對(duì)淀粉的水解效率提高。但當(dāng)pH值偏離最適范圍時(shí)，小肽修飾金納米團(tuán)簇可能會(huì)與酶分子發(fā)生非特異性結(jié)合，改變酶的活性中心構(gòu)象，從而抑制酶的活性。在pH值為4.0的酸性環(huán)境下，小肽修飾金納米