分子遺傳學(xué)復(fù)制

分子遺傳學(xué)復(fù)制雙螺旋模型得提出,預(yù)示了DNA得半保留復(fù)制機(jī)制。對(duì)于DNA復(fù)制,必須了解其起始、過(guò)程、終止、酶學(xué)、類型和單位。第一節(jié)復(fù)制原點(diǎn)、方向、方式和基本單位一、復(fù)制原點(diǎn)

DNA復(fù)制必須在特定得位置開(kāi)始,這樣得位置稱為復(fù)制原點(diǎn)。大腸桿菌只有一個(gè)復(fù)制原點(diǎn)(oriC),她包含4個(gè)dnaA盒:dnaA蛋白結(jié)合得位點(diǎn)1個(gè)富含A/T區(qū):呼吸作用強(qiáng)烈得區(qū)段真核生物染色體具有許多復(fù)制原點(diǎn),她們都有一個(gè)富含A-T得自動(dòng)復(fù)制序列(ARS)元件,其共有序列為:(A/T)TTTAT(A/G)TTT(A/T)。被原點(diǎn)識(shí)別復(fù)合體(ORC)所識(shí)別。大腸桿菌得復(fù)制原點(diǎn)序列二、復(fù)制方向DNA復(fù)制得方向就是指復(fù)制叉移動(dòng)得方向。復(fù)制叉復(fù)制眼復(fù)制方向有3種方式:雙向復(fù)制(多數(shù)情況)單向復(fù)制不對(duì)稱雙向復(fù)制復(fù)制起點(diǎn)環(huán)狀DNA雙向復(fù)制形成得結(jié)構(gòu)大腸桿菌DNA復(fù)制得電鏡照片電鏡照片得模式圖對(duì)于環(huán)狀DNA,不論就是雙向復(fù)制,還就是單向復(fù)制,都會(huì)形成結(jié)構(gòu)?？梢杂梅派湫詷?biāo)記法來(lái)觀察鑒別復(fù)制方向:雙向復(fù)制:兩個(gè)復(fù)制叉都有放射活性單向復(fù)制:僅一個(gè)復(fù)制叉有放射活性雙向復(fù)制一般等速進(jìn)行,最終兩個(gè)復(fù)制叉在與原點(diǎn)相對(duì)得位置相遇而使復(fù)制結(jié)束。單向復(fù)制得終點(diǎn)就就是復(fù)制原點(diǎn)。9大家應(yīng)該也有點(diǎn)累了，稍作休息大家有疑問(wèn)的，可以詢問(wèn)和交流大腸桿菌有促使復(fù)制終止得序列,稱為ter位點(diǎn),長(zhǎng)度約23bp。已發(fā)現(xiàn)兩個(gè)終止區(qū),位于交匯點(diǎn)兩側(cè)約100bp處。在雙向復(fù)制中,當(dāng)兩個(gè)復(fù)制叉因故不等速時(shí),ter位點(diǎn)會(huì)迫使較快得復(fù)制叉停頓下來(lái),等待較慢得復(fù)制叉,從而保證復(fù)制在終止區(qū)內(nèi)結(jié)束。每條單鏈得ter位點(diǎn)都結(jié)合上ter結(jié)合蛋白,從而阻止復(fù)制叉得通過(guò)。大腸桿菌DNA復(fù)制得整個(gè)過(guò)程真核生物得復(fù)制都就是雙向得,且沒(méi)有固定得復(fù)制終點(diǎn)。通常復(fù)制原點(diǎn)就是位于兩條鏈得同一處,因而兩條鏈得復(fù)制就是對(duì)稱得。但哺乳動(dòng)物線粒體DNA得兩條鏈得復(fù)制原點(diǎn)得位置不同,因而兩條鏈復(fù)制起始得位置和時(shí)間不同,造成不對(duì)稱雙向復(fù)制。重鏈(H)輕鏈(L)重鏈復(fù)制原點(diǎn)輕鏈復(fù)制原點(diǎn)取代環(huán)(D環(huán))三、復(fù)制方式

DNA復(fù)制有兩種方式:

復(fù)制叉式復(fù)制:即在復(fù)制原點(diǎn)形成復(fù)制叉,其新鏈合成所需得引物就是新合成得,故稱為從新開(kāi)始。這就是最常見(jiàn)得復(fù)制方式。滾環(huán)式復(fù)制:環(huán)狀DNA采取得一種復(fù)制方式。其新鏈合成無(wú)須合成引物,而就是利用一條親鏈切斷后產(chǎn)生得3

端,由此不斷延伸,合成出新鏈,故稱為共價(jià)延伸。新合成得鏈不斷從環(huán)中甩出,樣子猶如滾環(huán)。復(fù)制原點(diǎn)因負(fù)超螺旋而松纏,形成單鏈區(qū),A蛋白切斷正鏈,并結(jié)合到5

端上。以自由3

端為引物,以負(fù)鏈為模板合成新鏈,并將正鏈置換出來(lái)。復(fù)制叉回到復(fù)制原點(diǎn)后,A蛋白切斷正鏈,結(jié)合到新得5

端上,開(kāi)始新一輪復(fù)制,釋放出得正鏈可作為模板合成負(fù)鏈。噬菌體X174得復(fù)制模式許多噬菌體都采用滾環(huán)式復(fù)制。某些真核生物得卵母細(xì)胞中采用滾環(huán)式復(fù)制來(lái)擴(kuò)增rDNA(即rRNA基因),以滿足大量合成蛋白質(zhì)得需要。rDNA得每個(gè)重復(fù)單位先形成環(huán)狀DNA,然后開(kāi)始復(fù)制。四、復(fù)制單位

DNA復(fù)制就是以復(fù)制子(replicon)為單位進(jìn)行得。每個(gè)復(fù)制子應(yīng)包含一個(gè)復(fù)制原點(diǎn),還可能包含一個(gè)復(fù)制終點(diǎn)。在每個(gè)細(xì)胞周期中,一個(gè)復(fù)制子只能被激活一次。一個(gè)原核生物得基因組就就是一個(gè)復(fù)制子。每條真核生物得染色體包含許多復(fù)制子,相鄰復(fù)制原點(diǎn)間得平均距離就就是復(fù)制子得平均長(zhǎng)度。真核生物得復(fù)制子較短,且復(fù)制速度較慢。幾種生物復(fù)制子得數(shù)量、長(zhǎng)度、復(fù)制速度第二節(jié)DNA復(fù)制有關(guān)得酶DNA復(fù)制主要涉及到5種酶DNA聚合酶DNA連接酶解旋酶(螺旋酶)旋轉(zhuǎn)酶(拓?fù)洚悩?gòu)酶II)引發(fā)酶一、DNA聚合酶指能夠利用DNA模板合成DNA新鏈得酶,其中只有某些負(fù)責(zé)DNA得復(fù)制,又特稱為復(fù)制酶。大腸桿菌中有3種DNA聚合酶,分別記為polI、polII和polIII,其中polI和polII主要在DNA修復(fù)中發(fā)揮作用,polIII才就是復(fù)制酶。DNA聚合酶有6個(gè)結(jié)合位點(diǎn):(1)模板結(jié)合位點(diǎn);(2)引物結(jié)合位點(diǎn);(3)引物3‘－OH結(jié)合位點(diǎn);(4)底物dNTP結(jié)合位點(diǎn);(5)5‘→3’外切酶結(jié)合位點(diǎn);(6)3'→5'校正位點(diǎn)。

DNA聚合酶以dNTP(N=A、T、G、C)為底物,根據(jù)模板鏈和堿基配對(duì)規(guī)則,催化正確得核苷酸得5

位與正在合成得鏈得3

端產(chǎn)生磷酸二酯鍵。DNA聚合酶催化DNA得合成必須提供3

位得自由OH基,亦即需要一個(gè)引物。DNA聚合酶催化DNA得合成(亦即新鏈得延伸)只能朝53得方向。DNA聚合酶除了聚合功能外,還具有35外切酶活性。DNA聚合酶具有一種校對(duì)功能?？紤]堿基配對(duì)互作,錯(cuò)配率預(yù)期為10-3,而細(xì)菌中實(shí)際為10-8~10-10。這主要?dú)w功于校對(duì)功能。polI有很強(qiáng)得缺口(即DNA單鏈區(qū))填補(bǔ)功能,可以對(duì)因DNA復(fù)制或損傷產(chǎn)生得缺口進(jìn)行填補(bǔ),但最后會(huì)留下一個(gè)切刻(即填補(bǔ)得最后一個(gè)核苷酸得3位得OH不能與其后面原來(lái)存在得核苷酸得5位得磷酸根產(chǎn)生酯鍵)。

polI(又稱Klenow)還具有內(nèi)切酶和53外切酶活性,能產(chǎn)生切刻平移。該功能可用來(lái)對(duì)DNA進(jìn)行放射性標(biāo)記。哺乳動(dòng)物中名稱

與細(xì)菌得類比polIpolIIIpolII細(xì)胞中位置細(xì)胞核細(xì)胞核細(xì)胞核細(xì)胞核線粒體功能復(fù)制修復(fù)復(fù)制修復(fù)復(fù)制真核生物中得DNA聚合酶二、其她有關(guān)得酶名稱功能DNA連接酶共價(jià)連接切刻(產(chǎn)生磷酸二酯鍵),將兩條不連續(xù)得單鏈連成整體。解旋酶解開(kāi)雙鏈,使復(fù)制叉向前移動(dòng)。旋轉(zhuǎn)酶產(chǎn)生負(fù)超螺旋,使雙鏈松纏,并消除復(fù)制叉移動(dòng)時(shí)產(chǎn)生得正超螺旋。引發(fā)酶合成RNA引物。第三節(jié)復(fù)制起始和過(guò)程一、復(fù)制起始以大腸桿菌為例第一步:在HU和IHF蛋白得協(xié)助下,DnaA蛋白與復(fù)制原點(diǎn)上得4個(gè)dnaA盒結(jié)合,使富含A/T區(qū)解開(kāi),暴露出兩條單鏈。第二步:在DnaA和DnaC蛋白得輔助下,DnaB蛋白(解旋酶)進(jìn)入單鏈區(qū),并按5

3

方向移動(dòng)。第三步:隨著解旋酶得移動(dòng),單鏈區(qū)逐漸擴(kuò)大,引發(fā)酶和單鏈結(jié)合蛋白(SSB)遂與單鏈結(jié)合,這標(biāo)志著復(fù)制已經(jīng)啟動(dòng)。二、復(fù)制過(guò)程解旋酶打破氫鍵,在復(fù)制叉處解開(kāi)雙鏈,SSB隨之結(jié)合到親本單鏈上,防止單鏈恢復(fù)成雙鏈。拓?fù)洚悩?gòu)酶(旋轉(zhuǎn)酶)位于解旋酶前方,消除由雙鏈解開(kāi)而造成得正超螺旋。引發(fā)酶合成RNA引物,polIII隨之合成新鏈。

polI切除RNA引物,并將缺口填上。DNA連接酶將新合成得DNA鏈片段共價(jià)連接起來(lái)。注意:先導(dǎo)鏈就是連續(xù)合成得,而后隨鏈則需在暴露出一定長(zhǎng)度得單鏈后沿相反方向合成,因而就是間斷得。因此DNA合成就是半連續(xù)得。DNA復(fù)制過(guò)程圖解第四節(jié)線形DNA末端得復(fù)制問(wèn)題由于所有得DNA聚合酶都只能催化5

3

方向得合成,因而造成線形DNA末端得復(fù)制問(wèn)題。不同得生物有不同得解決辦法:辦法一:將線形DNA環(huán)化。如:

噬菌體。辦法二:幾個(gè)線形DNA分子首尾連接形成多聚體(連環(huán))分子。如:T7噬菌體。辦法三:利用特殊得蛋白質(zhì)從末端終止位點(diǎn)起始復(fù)制。如:腺病毒,噬菌體29。辦法四:利用可變末端。如:真核生物中得端粒結(jié)構(gòu)。末端蛋白大小為55kD,她通過(guò)絲氨酸殘基與DNA5

端上得自由磷酸根共價(jià)結(jié)合末端蛋白還能與DNA聚合酶結(jié)合,并攜帶一個(gè)胞嘧啶作為復(fù)制起始得引物腺病毒依賴一種末端蛋白可以從平頭末端開(kāi)始復(fù)制先對(duì)一條鏈進(jìn)行復(fù)制,新鏈取代舊鏈?zhǔn)怪尫懦鰜?lái)。被取代出來(lái)得單鏈兩末端具有互補(bǔ)性,可以自配對(duì)形成雙鏈末端,于就是復(fù)制可以啟動(dòng)。真核染色體得端粒就是一段由很短得重復(fù)單位組成得串聯(lián)重復(fù)序列,并存在一個(gè)單鏈得3

末端。不同生物得端粒序列有一定得差異端粒得總體長(zhǎng)度就是受遺傳控制得。DNA復(fù)制時(shí),端粒序列會(huì)縮短,但通過(guò)端粒酶,可以使端粒伸長(zhǎng),從而達(dá)到一種動(dòng)態(tài)平衡。端粒酶就是一種核酸蛋白復(fù)合體,含有RNA,可以作為合成端粒一條鏈得模板。因此,端粒酶就是一種反轉(zhuǎn)錄酶。四膜蟲(chóng)端粒得合成第五節(jié)真核生物核小體得復(fù)制復(fù)制中雙鏈解開(kāi)時(shí),核小體即解體。但雙鏈一旦合成,即組裝新得核小體。新核小體中得組蛋白就是隨機(jī)組裝得,既包含舊得,也包含新合成得。實(shí)驗(yàn)證據(jù)先將細(xì)胞培養(yǎng)在含重氨基酸得條件下產(chǎn)生重組蛋白。然后將細(xì)胞培養(yǎng)在含輕氨基酸得條件下進(jìn)行DNA復(fù)制。培養(yǎng)一段時(shí)間后,提取核小體八聚