奶牛性控胚胎移植技術(shù)規(guī)程

1DBXX/XXXXX—XXXX奶牛性控胚胎移植技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了奶牛性控胚胎生產(chǎn)和移植技術(shù)的術(shù)語(yǔ)和定義、技術(shù)操作要求和方法。本文件適用于奶牛性控胚胎生產(chǎn)、移植技術(shù)推廣應(yīng)用的規(guī)范化操作。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T3157-2008中國(guó)荷斯坦牛GB/T31582-2015牛性控冷凍精液NY/T34-2004奶牛飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)NY/T815—2004肉牛飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)NY/T1445-2007奶牛胚胎移植技術(shù)規(guī)程DB64/T528-2008奶牛性控冷凍精液人工授精技術(shù)規(guī)程3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1性控胚胎sexedembryos選擇生產(chǎn)性能優(yōu)良、遺傳性能穩(wěn)定的供體牛進(jìn)行超數(shù)排卵處理，發(fā)情后用性別控制精液進(jìn)行人工授精，供體牛在配種后6d～7d回收的早期胚胎。3.2胚胎移植embryotransplantation選擇與供體牛生理狀況相近的受體牛，用非手術(shù)方法將胚胎移植到受體牛子宮角內(nèi)，以便胚胎繼續(xù)發(fā)育。4性控胚胎生產(chǎn)4.1供體牛的選擇與飼養(yǎng)管理4.1.1供體牛符合GB/T3157-2008中荷斯坦奶牛標(biāo)準(zhǔn)，系譜檔案完整，體型線性評(píng)分良好。成年母牛選擇參加奶牛生產(chǎn)性能測(cè)定（DHI）,生產(chǎn)性能優(yōu)良的牛只，或經(jīng)遺傳評(píng)估（EBV），具有較好育種價(jià)值的牛只；青年母牛選擇全基因組檢測(cè)（GEBV）,具有較好育種價(jià)值，或其父母生產(chǎn)性能優(yōu)良的牛只。2DBXX/XXXXX—XXXX4.1.2供體牛要求體格健壯，無(wú)遺傳缺陷。飼養(yǎng)環(huán)境的舒適、穩(wěn)定，避免出現(xiàn)疫苗注射等應(yīng)激反應(yīng)。保證科學(xué)、合理、平衡的日糧營(yíng)養(yǎng)。超數(shù)排卵前一個(gè)月，適量補(bǔ)充復(fù)合維生素、微量元素，適量增加精料，保證超排期間體重處于增重狀態(tài)。飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)按照NY/T34-2004執(zhí)行。具體要求按照NY/T1445-2007中5.1.1和5.1.2的規(guī)定執(zhí)行。4.2種公牛的性控冷凍精液的選擇根據(jù)供體牛選種選配的要求，選擇譜系清楚，檢疫合格，遺傳性狀穩(wěn)定，生產(chǎn)性能優(yōu)良的驗(yàn)證種公牛性控冷凍精液與供體牛進(jìn)行選配。性控冷凍精液質(zhì)量符合GB/T31582-2015的規(guī)定。4.3供體牛的超數(shù)排卵4.3.1季節(jié)選擇應(yīng)盡量避開(kāi)酷暑和嚴(yán)寒時(shí)節(jié)，以春秋季節(jié)為宜。4.3.2激素選擇超數(shù)排卵選用的生殖激素名稱、類型、注射劑量及功能見(jiàn)附錄A。4.3.3超數(shù)排卵方案不考慮供體牛的發(fā)情時(shí)間，避開(kāi)發(fā)情期。應(yīng)用CIDR＋FSH＋PGF2α法進(jìn)行超數(shù)排卵處理。使用專用CIDR槍將CIDR送至供體牛子宮頸口處。以放置CIDR之日作為0d記，在7d～9d開(kāi)始，采用連續(xù)4d遞減注射法肌肉注射FSH。每天間隔12h注射2次，連續(xù)注射4d。在第5次和第6次注射FSH的同時(shí)注射0.2mgPGF2α;在第6次注射FSH后取出CIDR，用50ml生理鹽水分別溶解青霉素320萬(wàn)IU和鏈霉素100IU，混合后沖洗供體陰道。具體操作程序見(jiàn)附錄B.1。4.4供體牛的人工授精4.4.1供體牛發(fā)情鑒定在第8次注射FSH后，每隔4h觀察一次發(fā)情，每次0.5h以上。以母牛站定接受其它牛爬跨做為發(fā)情的標(biāo)準(zhǔn)，做好供體牛發(fā)情記錄。4.4.2人工授精時(shí)間與次數(shù)人工授精時(shí)間盡量接近排卵期。發(fā)情后12h進(jìn)行第1次輸精，同時(shí)肌肉注射0.05mgLHRH-A3；間隔8h～10h進(jìn)行第2次輸精，如果還有大量卵泡沒(méi)有排放，肌肉注射0.05mgLHRH-A3，間隔8h～10h后第3次輸精。每次輸精使用2支性控冷凍精液，分別輸配至左右兩側(cè)子宮角大彎處。具體操作程序見(jiàn)附錄B.2。人工授精操作按照DB64/T528-2008規(guī)定執(zhí)行。4.5性別控制胚胎的回收（采集）及處理4.5.1準(zhǔn)備工作在供體牛發(fā)情后的第6d，準(zhǔn)備好檢胚實(shí)驗(yàn)室。檢胚實(shí)驗(yàn)室要求清潔消毒，溫度20℃~25℃,相對(duì)濕度40%～60%。提前準(zhǔn)備好胚胎回收所用器械設(shè)備清洗、消毒滅菌、試劑耗材準(zhǔn)備等工作。器械設(shè)備和試劑耗材準(zhǔn)備要求見(jiàn)附錄C、附錄D。具體操作方法按照NY/T1445-2007中附錄C中的規(guī)定執(zhí)行。4.5.2回收與檢胚3DBXX/XXXXX—XXXX在供體牛發(fā)情后的第7d，用非手術(shù)方法進(jìn)行回收。將回收的沖卵液迅速送到檢胚室，通過(guò)體式顯微鏡進(jìn)行檢胚處理，并對(duì)檢出的胚胎進(jìn)行鑒定、分級(jí)和洗滌。具體操作方法按照NY/T1445-2007中5.3的規(guī)定執(zhí)行。4.5.3胚胎的保存性控胚胎經(jīng)過(guò)鑒定、分級(jí)和洗滌后，應(yīng)盡快進(jìn)行鮮胚移植或冷凍保存處理。具體操作方法按照NY/T1445-2007中5.4的規(guī)定執(zhí)行。4.5.4記錄做好每一批次每頭供體牛的超數(shù)排卵、人工授精、性控胚胎回收及處理和胚胎生產(chǎn)統(tǒng)計(jì)記錄，見(jiàn)附錄E、附錄F。5性控胚胎移植5.1受體牛的選擇與飼養(yǎng)管理選擇體格較大、健康的荷斯坦青年?；螂s交改良肉用母牛做受體牛，人工授精兩次或胚胎移植兩次不孕者不使用。保證科學(xué)、合理、平衡的受體牛日糧營(yíng)養(yǎng)，移植前1個(gè)月開(kāi)始補(bǔ)飼，補(bǔ)充微量元素和維生素，移植期間體重應(yīng)處于增重狀態(tài)。飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)按照NY/T34-2004和NY/T815—2004執(zhí)行。受體牛群要與供體牛有同樣的飼養(yǎng)管理?xiàng)l件。具體要求按照NY/T1445-2007中6.1的規(guī)定執(zhí)行。5.2受體牛的發(fā)情處理5.2.1自然發(fā)情黃體良好且與供體牛發(fā)情前后相差不超過(guò)±1d的自然發(fā)情受體牛，可以作為受體接受胚胎移植。5.2.2同期發(fā)情處于發(fā)情周期7d～15d且直腸檢查黃體良好的受體牛，采用一次注射PGF2α法進(jìn)行同期發(fā)情處理；在不考慮發(fā)情周期的情況下，采用兩次注射PGF2α或CIDR+PGF2α法對(duì)受體牛進(jìn)行同期發(fā)情處理。受體牛的PGF2α處理的時(shí)間要與供體牛的PGF2α處理時(shí)間相吻合。具體操作按照NY/T1445-2007中6.2的規(guī)定執(zhí)行。5.2.3發(fā)情觀察同期發(fā)情處理的受體牛，在注射PGF2α24h后開(kāi)始跟群觀察發(fā)情，以穩(wěn)定站立接受其它牛爬跨為準(zhǔn)確發(fā)情標(biāo)準(zhǔn)，觀察發(fā)情至96h，做好發(fā)情觀察記錄。5.3黃體檢查受體牛發(fā)情第6d，通過(guò)直腸觸摸檢查黃體，確定排卵側(cè)有功能性黃體，突起明顯，直徑1cm以上，質(zhì)地稍硬彈性好，基質(zhì)充實(shí)，子宮形態(tài)質(zhì)地正常的受體進(jìn)行胚胎移植。直腸觸診檢查受體卵巢和黃體時(shí)，動(dòng)作應(yīng)輕、柔，以免過(guò)分刺激黃體和卵巢。5.4移植供體牛采集的新鮮胚胎，可以直接移植給經(jīng)直腸檢查黃體合格的受體牛；冷凍保存的胚胎進(jìn)行移植時(shí)，應(yīng)進(jìn)行解凍處理，并對(duì)胚胎質(zhì)量進(jìn)行鑒定，胚胎移植應(yīng)在受體牛發(fā)情的第6d～8d之間進(jìn)行。移4DBXX/XXXXX—XXXX植所用器械設(shè)備和試劑耗材，見(jiàn)附錄G。具體操作按照NY/T1445-2007中6.3的規(guī)定執(zhí)行。5.5妊娠檢查5.5.1胚胎移植后應(yīng)注意觀察受體牛返情情況。胚胎移植28d～60d時(shí)，對(duì)未返情的牛只應(yīng)用直腸觸診法、B超檢查法等方法進(jìn)行妊娠檢查并做記錄，在移植后90d～120d時(shí)進(jìn)行復(fù)檢。妊娠檢查時(shí)動(dòng)作要輕柔，以免引起流產(chǎn)。5.5.2受體牛妊娠后要加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，營(yíng)養(yǎng)要全面，要注意與其它牛群分離，單獨(dú)飼養(yǎng)，避免打斗、追趕，抽打等引起流產(chǎn)。5.6記錄做好受體牛的發(fā)情觀察、黃體檢查、胚胎移植和妊娠檢查記錄，記錄要求和方法見(jiàn)附錄H。5DBXX/XXXXX—XXXX（資料性附錄）超數(shù)排卵選用激素表表A.1超數(shù)排卵選用激素表激素名稱類型劑量（注射總量/頭）功能促卵泡素（FSH）凍干針劑肌肉注射，經(jīng)產(chǎn)牛360mg~400mg/頭；育成牛300mg~加拿大生產(chǎn)FSH為例）。保證多個(gè)卵子同時(shí)發(fā)育成熟，是超數(shù)排卵的主要激素。陰道栓硅膠或海綿含有孕酮（P）,維持血液中的孕酮水平，制品西蘭生產(chǎn)CIDR為例）。抑制供體發(fā)情，促進(jìn)卵泡發(fā)育同步。促黃體素釋放激素（LHRH-A3）水針劑/粉劑在輸精時(shí)或輸精前4h～6h肌0.025mg/支。促進(jìn)LH的釋放，進(jìn)而促進(jìn)多個(gè)卵子同步成熟、排放，促進(jìn)黃體形成。前列腺素水針劑超數(shù)排卵過(guò)程中肌肉注射0.4mg/頭，沖胚結(jié)束后肌肉注射0.4mg。規(guī)格：0.2mg/支。溶解黃體，防止黃體囊腫和持久黃體的形成，促進(jìn)供體牛發(fā)情。6DBXX/XXXXX—XXXXB.1超數(shù)排卵操作程序放置CIDR（資料性附錄）超數(shù)排卵及人工授精操作程序早晚分別注射下午開(kāi)始觀察發(fā)情，并記錄發(fā)情時(shí)間。沖胚連續(xù)4d早晚以遞減劑量注射FSH圖B.1超數(shù)排卵操作程序圖B.2人工授精操作程序發(fā)情第1次AI，同時(shí)注射LHRH-A3第2次AI，同時(shí)注射LHRH-A3第3次AI，同時(shí)注射LHRH-A30（h）1220～2228～32圖B.2人工授精操作程序圖7DBXX/XXXXX—XXXX（資料性附錄）器械設(shè)備準(zhǔn)備表表C.1器械設(shè)備準(zhǔn)備表序號(hào)名稱序號(hào)名稱1CIDR槍體視顯微鏡2子宮頸擴(kuò)張棒胚胎冷凍儀3子宮粘液去除棒21恒溫板4集卵杯22水浴鍋515#沖卵管23618#沖卵管24液氮罐715#沖卵管鋼芯25輸精槍818#沖卵管鋼芯26止血鉗9100ul加樣器27鑷子1000ul加樣器28細(xì)管剪砂輪29泡沫箱吸胎胚管30頭燈31量筒32湯瓶解凍杯33雨鞋液氮杯34連體服酒精燈35紫外線燈溫度計(jì)36噴壺8DBXX/XXXXX—XXXX（資料性附錄）試劑耗材準(zhǔn)備表表D.1試劑耗材準(zhǔn)備表序號(hào)名稱序號(hào)名稱15%碘酊21四孔盤(pán)275%酒精220.22um過(guò)濾器3高錳酸鉀231ml注射器4維生素AD注射液245ml注射器5亞硒酸鈉-維生素E注射液2520ml注射器6石蠟油2630ml注射器7青霉素2750ml注射器8鏈霉素280.25ml胚胎細(xì)管9陰道栓（CIDR）29棉球促卵泡素（FSH）30紙巾前列腺素（PGF2α)31擦鏡紙促黃體素釋放激素（LHRH-A3）32封口塞沖卵液33封口粉保存液34輸精槍外套乙二醇冷凍液35拇指管2%利多卡因36記號(hào)筆無(wú)水乙醇37直檢手套生理鹽水38橡膠手套35mm培養(yǎng)皿39加樣器槍頭2090mm培養(yǎng)皿9DBXX/XXXXX—XXXX（資料性附錄）超數(shù)排卵及胚胎采集記錄表表E.1超數(shù)排卵及胚胎采集記錄表地點(diǎn)牛場(chǎng)名稱負(fù)責(zé)人供體場(chǎng)號(hào)耳號(hào)品種公牛號(hào)公牛站精液質(zhì)量超排處理：發(fā)情日期及時(shí)間人工授精日期、時(shí)間及數(shù)量第一次第二次第三次第四次輸精人員放栓前處理放栓日期及時(shí)間FSH廠家注發(fā)情日期及時(shí)間人工授精日期、時(shí)間及數(shù)量第一次第二次第三次第四次輸精人員FSH劑量（mL）其他處理早晨早晨早晨早晨總劑量采胚時(shí)間提漏號(hào)細(xì)管號(hào)及顏色胚胎數(shù)及質(zhì)量解凍日期備注黃體數(shù)LR采胚時(shí)間提漏號(hào)細(xì)管號(hào)及顏色胚胎數(shù)及質(zhì)量解凍日期備注其中：桑葚胚早期囊胚囊胚擴(kuò)張囊胚退化胚未受精卵備注：CM-桑葚配；EB-早期囊胚；BL-囊胚；EXB-擴(kuò)張囊胚；分為ABCD四級(jí)采胚人員：檢胚人員：冷凍人員：DBXX/XXXXX—XXXX（資料性附錄）胚胎生產(chǎn)統(tǒng)計(jì)表表F.1胚胎生產(chǎn)統(tǒng)計(jì)表序號(hào)時(shí)間供體牛號(hào)采胚總數(shù)可用胚胎不可用胚胎術(shù)者備注合計(jì)MCMEBBEXB合計(jì)無(wú)精退化ABABABABAB12345678合計(jì)DBXX/XXXXX—XXXX（資料性附錄）胚胎移植器械設(shè)備與試劑耗材準(zhǔn)備表表G.1胚胎移植器械設(shè)備與試劑耗材準(zhǔn)備表序號(hào)器械設(shè)備名稱序號(hào)試劑耗材與名稱1CIDR槍1陰道栓（CIDR）2體式顯微鏡2前列腺素（PGF2α)